番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程-编制说明

一、项目来源根据《广西标准化协会关于下达2020年第三批团体标准制定项目计划的通知》（桂标协[2020]8号）文件精神，由广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所提出，广西大学、广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所共同起草的团体标准《番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程》。二、项目背景及目的意义番茄细菌性斑点病与1933年首次在美国发现，随后发展成为一种世界性冰河，遍及各大洲。番茄细菌性斑点病最高发病率可达100%，造成5%—75%的减产。降低果实的外观品质，对其商品性影响较大，该病已被列入我国的出入境检疫有害生物名录。番茄细菌性斑点病在植株苗期和成株期均可发生，可对植株的叶、茎、果柄、萼片、果面造成危害。近年来，在华南秋冬番茄的主产区广西百色市田阳区爆发的番茄细菌性斑点病病害对番茄植株的茎部危害严重，且发病率可达80%以上，严重制约了广西番茄主产区的发展。该病病原菌通过遗留在病叶、病果、发病枝条等植株残余组织中以及田块内的杂草上。翌年借助风雨传播、灌溉水等传播到植株上，或经过人工整枝打杈等农事活动造成的伤口以及植株上的气孔、皮孔、水孔等自然孔口侵入组织，在植株的薄壁组织细胞间隙中蔓延，造成寄主细胞的破坏。同时病原菌在新田块中可以通过带菌的种子传播。病原菌在干燥的种子上存活数年，环境条件适宜，在苗期即可侵染植株。低温高湿是番茄细菌性斑点病发病的主要条件。气温在15℃以上，且连续阴雨达3d以上时，最有利于病情的发展。在栽培管理上，浇水多，排水不良，雨后积水，肥料供应不足或偏施氮肥均会加重病害发生。在广西番茄主产区之一的百色，地处亚热带气候区，春季与量，冬季温暖潮湿。番茄的种植主要在夏秋季节播种，冬季到翌年春季上市，多为露地栽培。冬季及早春易发生连续早晚间雾露重、阴雨天气，导致该病呈现流行态势。为解决这一问题，育种家针对番茄细菌性斑点病开展了抗病育种。然而再进行抗病鉴定中遇到较多问题。一是病原菌的致病力在人工接种过程中的影响。病原菌致病力的分化，在同一病株的表现不同。二是缺乏统一的接种浓度。在众多研究中表明，病原菌的浓度与病害的严重程度有关。在一定的范围内，病原菌的浓度越大，病害越严重；相反病原菌浓度过低，病害发生不充分，无法区分品种间的抗性。三是接种方法，不同病原菌的接种方法对抗性鉴定有较大的影响。接种方法应根据病害的侵染特性等方面进行综合考虑。四是作物类型，作物不同的生长期对病害的敏感程度会出现差异。五是接种环境因素会影响病原菌的繁殖、侵染。因此，通过制定团体标准《番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程》，以标准为抓手，让广大科研院所和番茄育种企业规范鉴定番茄细菌性斑点病，从源头上更好保障番茄的生长，提高番茄的经济价值，增加农民收入，对推动我区番茄产业健康发展，打造广西番茄品牌，促进农民增收脱贫和乡村振兴均具有重要意义。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准《番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程》项目任务下达后，广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所成立了标准编制工作组，起草单位制定了起草编写方案与进度安排，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作。具体标准编制工作由广西大学，广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所等起草单位组成标准编制工作组，编制工作组成员如下：。编制工作组下设三个组，分别是资料收集组、草案编写组、标准实施组。资料收集组负责国内外有关番茄细菌性斑点病的文献资料的查询、收集和整理工作，查阅前人对番茄细菌性斑点病抗病性鉴定研究情况和目前科学界对番茄细菌性斑点病抗病性鉴定方法的研究进展。草案编写组负责起草标准草案、征求意见稿和标准编制说明、送审稿及编制说明的编写工作，包括后期召开征求意见会、网上征求意见，以及标准的不断修改和完善。标准实施组负责《番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程》团体标准发布后，组织科研院所、相关育种企业开展标准宣贯培训会，对标准进行详细解读，让相关人员了解标准，并根据标准对甘番茄细菌性斑点病抗病性鉴定方法进行规范化操作，保证番茄品种抗病性鉴定的准确性，并对标准实施情况进行总结分析，不断对团体标准提出修正意见。（二）收集整理文献资料标准编制工作组收集了国内有关甘薯外源硒生物强化生产相关文献资料。主要有：NY/T1858—2010(所有部分）番茄主要病害抗病性鉴定技术规程（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，2020年4月，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定为番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术的术语和定义、试剂与材料、接种体制备、病原菌鉴定、鉴定条件和实验设计、接种、病情调查、抗病性评价。（四）调研、形成征求意见稿2020年4月—9月，标准起草工作小组进行了广泛实地调研工作，查阅了大量的国内外文献资料，对番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术的前人研究成果进行系统总结。形成了标准的基本构架，对主要内容进行了讨论并对项目的工作进行了部署和安排。2020年10月，在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术要求，并结合广西大学、广西农科院蔬菜所实验研究的基础上，按照简化、统一等原则编制完成团体标准《番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程》（草案）。2020年11月—2021年3月，标准起草工作组再次深入区内番茄种植区进行采样，针对番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术进行验证。通过实验验证，掌握番茄细菌性斑点病抗性鉴定的具体技术要求。并实际征求意见，通过收集反馈了大量意见，标准编制工作组多次召开会议，对标准草案进行了反复修改和研究讨论。最终形成了团体标准《番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程》（征求意见稿）和（征求意见稿）编制说明。四、标准制定原则1、实用性原则本文件是在充分收集相关资料和文献，分析番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术当前现状，调研番茄细菌性斑点病的发病情况，在现有国家、行业标准相关番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术要求的基础上，结合广西大学、广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所等多年的番茄细菌性斑点病抗性鉴定试验而总结起草的。符合当前番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术发展的方向与市场需求，有利于行业的长远发展，有利于提高番茄细菌性斑点病抗性鉴定效率，对推动我区番茄产业健康发展，打造广西番茄品牌，促进农民增收脱贫，具有较强的实用性和可操作性。2、协调性原则本文件编写过程中注意了与番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。3、规范性原则本文件严格按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。4、前瞻性原则本文件在兼顾当前区内番茄细菌性斑点病抗性鉴定现实情况的同时，还考虑到了番茄产业快速发展的趋势和需要，在标准中体现了个别特色性、前瞻性和先进性条款，作为对番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术的指导。五、标准主要内容及依据来源团体标准《番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术规程》主要章节内容包括术语和定义、试剂与材料、接种体制备、病原菌鉴定、鉴定条件和实验设计、接种、病情调查、抗病性评价。其中术语和定义主要依据番茄细菌性斑点病的主要发生情况和症状要求确定。试剂与材料、接种体制备、病原菌鉴定等主要依据广西大学、广西农科院蔬菜研究所经过试验验证确定。病原菌的分离鉴定在广西田阳区那坡镇番茄产地采样的番茄叶片，经分离纯化后，菌落呈圆形，全缘或锯齿状，乳白色，表面光滑，略有光泽，质地粘稠，菌落半径在2mm左右。菌落形态特征见图1。图1.菌落形态特征烟叶过敏反应与回接结果将保存的病原菌转移到液体ＮＡ培养基中，设置温度28℃，转速120r/min震荡培养48ｈ。用分光光度计在波长入＝600的条件下测定OD值，将菌液稀释至OD为0.6—0.8。用注射器吸取菌液，沿着叶脉注射到烟草叶片叶肉组织中，24h观察是否有斑枯过敏反应。并将病原菌接种到健康番茄植株上，接种后，番茄植株放置于人工气候箱中培养，温度设定在25℃，空气湿度为95±5％。结果表明病原菌发生烟叶过敏反应；接种健康番茄植株，叶片出现斑点，斑点有黄色晕圈等典型症状。（图2）图2.烟叶过敏反应及回接叶片发病情况分子鉴定结果分子鉴定扩展程序与条件依据黄立飞等（2011）方法。以病原细菌的总基因组DNA为模板，上游引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），下游引物1942R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增。进行16srDNAPCR扩增后，得到一条约1500bp的条带（图3）。通过与GenBank中的核酸序列进行对比，其与丁香假单胞杆菌番茄致病变种的同源性达99%。图3.病原菌的16srDNAPCR扩增电泳图不同接种方法对苗期植株病情指数的影响由图4可知，对照组均不发病，说明发病是人工接种导致的；叶片针刺法在Ｂ、Ｃ、Ｄ种质中病情指数均最高；剪叶接种法、叶柄接种法、茎干接种法在不同番茄种质中，对病情指数的影响互有高低；菌土法的病情指数最低，使用菌土接种法，Ａ种质的所有重复试验及Ｂ、Ｃ、Ｄ种质的部分重复试验中，叶片出现无病症的情况。Ｄ为感病对照番茄材料，利用针刺叶片接种法、剪叶接种法、茎干接种法、叶柄接种，Ｄ种质均达到感病级别（病情指数＞40），不同的接种方法对４个种质的接种病情指数的影响趋势较一致。从病害充分发病的角度来看，针刺叶片接种法、剪叶接种法、茎干接种法、叶柄接种法均能满足要求。图4.不同接种方法对苗期植株病情指数的影响不同接种方法下的发病症状发病症状看，针刺叶片法发病从叶片开始发病，后逐渐蔓延到茎干，斑点在叶片上分布均匀（图5Ａ）；剪叶法操作简便，病症首先出现在叶片上（图5Ｂ）；叶柄法先在叶柄上形成斑点，后蔓延到叶片上，后期接种叶片常提前掉落（图5Ｃ）；茎干接种法病症显症时间要较叶片的两种接种方法慢1到2ｄ，症状首先出现在茎部伤口周围，形成水渍状斑块（图5Ｄ），后面逐渐变黑，叶片出现典型症状较茎干慢，但是茎干接种法在接种植株之间发病较均匀。图5.不同的接种方法的发病特点不同接种浓度下的病情指数从图6中可以看出，随着接种液浓度的升髙，４份番茄材料的病情指数均呈现增加的结果。在接种液浓度为1×106、1×107cfu/ml时候病情指数均显著增加。由于Ｄ是己知的高感病的番茄种质材料，在接种浓度为1×103、1×104、1×105、1×106cfu/ml时，病情指数＜40，发病不够充分。当用浓度为1×108、1×109cfu/ml的接种液进行接种时，D发病充分。图6.不同浓度接种液对番茄细菌性斑点病病情指数的影响不同生长阶段接种的病情指数在番茄植株的三个生长阶段进行接种，４份番茄材料均表现出番茄细菌性斑点病的典型症状，从图7中可以看出，在Ａ种质中，开花期接种的病情指数最高，病情指数平均值达到44.8，极显著高于３—５叶期和７—９叶期接种的病情指数，３—５叶期和７—９叶期之间病情指数差异不显著；在Ｂ、Ｃ、Ｄ材料中，开花期和3—５叶期接种病情指数差异不显著，两时期均显著高于７—９叶期接种。由此可知，病原菌最容易浸染花果期植株，其次为苗期，在营养生长旺盛的７—９叶期接种效果较差。从病情指数在不同种质之间的变化趋势上来看，３个生长阶段的对不同种质的抗性鉴定结果的变化趋势较一致，但是７—８叶时期接种接种发病效果低，不能反映出种质的抗性差异。图7.接种不同生长阶段番茄植株细菌性斑点病的病情指数不同接种调查时间对发病情况的影响如图8所示，材料间接种后的病情发展趋势基本一致：接种后第五天开始显现病症；第5到8天接种病情发展迅速；第8到11天，病情指数增长速度减缓；11天后病情趋于稳定。在接种后14±2天是病情观察的适宜时期。图8.接种后病情指数随着接种天数的变化不同温度和保湿时间对发病情况的影响给出了不同温度和不同保湿时间下番茄植株的病情指数。当温度固定时，病情指数随保湿时间的增加而增加，当保湿时间为固定时，病情指数随温度的升高先增加后降低，合适的温度（20—25℃）和较长的保湿时间（＞96h）有利于病情的蔓延，病情指数较高。在25℃保湿时间为144ｈ时候，病情指数达到最大的86.58。表1.温度和保湿时间对番茄接种细菌性斑点病病菌的病情指数的影响番茄种质抗性鉴定试验对74份番茄种质资源进行细菌性斑点病抗性鉴定。采用苗期茎干接种法对这74份种质资源进行抗性鉴定。接种第5天出现了典型叶部斑点的发病症状，斑点褐色或深褐色，周围有黄色晕圈，茎干伤口处变黑，在第10天左右茎干出现病斑。苗期茎千接种法的病情指数范围为8.15—87.55，浸种法的病情指数范围为12.5—86.67。比较苗期茎千法与浸种法的接种结果，两种方法下抗性分型结果相同的番茄种质资源有26份，对两