生物化学：第三章 酶学课件

第三章

酶学

周口师范学院生命科学系

(2008.10)

生物化学：第三章酶学

一、酶的概述

二、酶的分类与命名

三、酶催化作用特性的分子机理

四、酶促反应的动力学

五、重要的酶类及酶活性的调控

六、酶的分离纯化及活力测定主要内容生物化学：第三章酶学一.酶的概述酶概念酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂(Biocatalysts)。绝大多数的酶都是蛋白质(Enzyme和Ribozyme)酶催化的生物化学反应，称为酶促反应(Enzymaticreaction)。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物(substrate)。生物化学：第三章酶学酶的研究历史1897年，酶的发现和提出：Buchner（1907诺贝尔化学奖）兄弟用不含细胞的酵母汁成功实现了发酵。提出了发酵与活细胞无关，而与细胞液中的酶有关。1913年，Michaelis和Menten提出了酶促动力学原理—米氏学说。1926年，Sumner从刀豆种子中分离、纯化得到了脲酶结晶，首次证明酶是具有催化活性的蛋白质。1982年，Cech对四膜虫的研究中发现RNA具有催化作用。生物化学：第三章酶学2008年诺贝尔生理学或医学奖德国人哈拉尔德·楚尔·豪森在上世纪７０年代开始的研究中发现导致宫颈癌的ＨＰＶ（人乳头状瘤病毒），为宫颈癌疫苗今天的诞生奠定了基础。法国人弗朗索瓦丝·巴尔－西诺西和吕克·蒙塔尼在上世纪８０年代发现了艾滋病病毒，使医学界找到了确诊艾滋病病毒感染的办法，延缓了这种病毒的传播。生物化学：第三章酶学酶及生物催化剂概念的发展……克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：Enzyme(天然酶、生物工程酶)核酸类：Ribozyme;Deoxyribozyme模拟生物催化剂生物化学：第三章酶学

酶的化学本质

大多数酶是蛋白质（Mostenzymesareproteins）

1926年美国Sumner脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。20世纪80年代发现某些RNA有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。某些核酸也有酶活性

生物化学：第三章酶学

酶是有催化能力的蛋白质生物化学：第三章酶学酶和一般催化剂的共性1.用量少而催化效率高；2.它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。酶本身在反应前后也不发生变化。3.酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。生物化学：第三章酶学酶的催化特性

酶的催化作用可使反应速度提高10７–101３倍。如：过氧化氢分解2H2O2

2H2O+O2.用Fe3+

催化，效率为6X10-4mol/mol.S，而用过氧化氢酶催化，效率为6X106mol/mol.S。

-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。1．高效性

是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。

如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。2.酶的专一性生物化学：第三章酶学酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40

C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。3.酶反应条件的温和性如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。4.酶活力的可调控性5.某些酶活力与辅酶、辅基及金属离子有关生物化学：第三章酶学根据酶的组成成分

单纯酶(simpleenzyme)是基本组成单位仅为氨基酸的一类酶。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均属此列。

复合酶(conjugatedenzyme)的催化活性，除蛋白质部分(酶蛋白apoenzyme)外，还需要非蛋白质的物质，即所谓酶的辅助因子(cofactors)，两者结合成的复合物称作全酶(holoenzyme)，即：二.酶的分类与命名12生物化学：第三章酶学根据酶的结构特点及组织形式1.单体酶：只含一条肽链，分子量小，大多数水解酶属于此类。2.寡聚酶：由相同或不同的若干亚基构成。每条肽链是一个亚基，单独的亚基无酶的活力。如乳酸脱氢酶含四个亚基。3.多酶复合体：若干个功能相关的酶彼此嵌合形成的复合体。每个单独的酶都具有活性，当它们形成复合体时，可催化某一特定的链式反应，如脂肪酸合成酶复合体，含有六个酶及一个非酶蛋白质。生物化学：第三章酶学根据酶的存在位置1.胞内酶：在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶，大多数的酶属于此类。2.胞外酶：在合成后分泌到细胞外发生作用的酶，主要为水解酶。生物化学：第三章酶学1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：酶国际系统分类法1.氧化-还原酶类Oxido-reductases

2.转移(移换)酶类Transferases3.水解酶类hydrolases4.裂合（裂解）酶类Lyase5.异构酶类Isomerases6.合成酶类LigasesorSynthetases生物化学：第三章酶学氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1.氧化-还原酶类Oxido-reductases生物化学：第三章酶学转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2.转移(移换)酶类Transferases生物化学：第三章酶学水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：3.水解酶类hydrolases生物化学：第三章酶学主要包括醛缩酶、水化酶（脱水酶）及脱氨酶等。裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子而形成双键的反应及其逆反应。A+B==A-B例如，苹果酸裂合酶即延胡索酸水合酶催化的反应。4.裂合（裂解）酶类Lyase生物化学：第三章酶学异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。5.异构酶类Isomerases生物化学：第三章酶学合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H==A-B+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2

草酰乙酸6.合成酶类LigasesorSynthetases生物化学：第三章酶学1.习惯命名法:根据其催化底物来命名（蛋白酶；淀粉酶）根据所催化反应的性质来命名（水解酶；转氨酶；裂解酶等）结合上述两个原则来命名（琥珀酸脱氢酶）有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点（胃蛋白酶、胰蛋白酶、硷性磷酸脂酶和酸性磷酸脂酶）。酶的命名生物化学：第三章酶学2.国际系统命名法（国际酶学委员会１９６１年提出）系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。例如：习惯名称：谷丙转氨酶系统名称：丙氨酸:

-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应：

-酮戊二酸+丙氨酸

谷氨酸+丙酮酸生物化学：第三章酶学乳酸脱氢酶

EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号生物化学：第三章酶学

酶催化的中间产物理论酶的活性中心酶作用专一性及其机理酶高效催化的分子基础三、酶催化作用特性的机理生物化学：第三章酶学酶的催化作用与分子活化能化学反应自由能方程式ΔG=ΔH-TΔS（ΔG是总自由能的变化，ΔH是总热能的变化，ΔS是熵的变化）当ΔG＞0，反应不能自发进行。当ΔG＜0，反应能自发进行。活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol反应物全部进入活化状态所需的自由能。生物化学：第三章酶学

化学反应要能够发生，关键的是反应体系中的分子必须分子处于活化状态，活化分子比一般分子多含的能量就称为活化能。反应体系中活化分子越多，反应就越快。增加反应体系的活化分子数有两条途径:一是向反应体系中加入能量，另一途径是降低反应活化能。酶的作用就在于降低化学反应活化能。生物化学：第三章酶学例2H2O2→2H2O+O2

反应活化能非催化反应75.24kJ/mol钯催化反应48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol生物化学：第三章酶学酶催化的中间产物理论E+SP+EES能量水平反应过程

G

E1

E2

酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。

S+E→ES→P+E底物酶中间产物产物酶生物化学：第三章酶学酶的活性中心

1、酶的活性中心和必需基团酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心（activecenter）或活性部位（activesite），参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶分子的必需基团。必需基团:酶分子中有些基团若经化学修饰（氧化、还原、酰化、烷化）使其改变，则酶的活性丧失，这些基团称为必需基团。非必需基团：有的酶温和水解掉几个AA残基，仍能表现活性，这些基团即非必需基团。2、酶的活性的研究手段

活酶的专一性研究

酶分子的化学修饰：差示标记法，亲和标记法

X-射线衍射法生物化学：第三章酶学必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质生物化学：第三章酶学AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团:

His57,

Asp102,Ser195生物化学：第三章酶学为Tyr248为Arg145为Glu270为底物Zn羧肽酶活性中心示意图

生物化学：第三章酶学差示标记法图解RRRRR*A.非差示标记B.差示标记RRR*R(底物)生物化学：第三章酶学亲和标记法

根据酶与底物特异结合的性质，设计或合成一种含有反应基团的底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。这种试剂象底物一样进入活性部位，接近结合位点，并以其活泼的化学基团与活性部位的某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征。+

X-Y生物化学：第三章酶学酶作用的专一性与分子机理酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性绝对专一性相对专一性旋光异构专一性几何异构专一性键专一性基团专一性1专一性分类生物化学：第三章酶学2消化道内几种蛋白酶的专一性（芳香）（硷性）（丙）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶生物化学：第三章酶学“锁钥学说”

(lockandkeythoery)：

Fischer，(1890）：酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。3酶作用专一性机理生物化学：第三章酶学诱导嵌合学说

(induced-fithypothesis)：Koshland，(1958）：酶活性中心的结构有一定的柔性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。生物化学：第三章酶学生物化学：第三章酶学1底物与酶的邻近效应和定向效应2底物分子的形变和扭曲3酸碱催化4共价催化5金属离子的作用6活性部位的微环境的影响酶高效催化的分子基础酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为分子内的催化反应。生物化学：第三章酶学邻近效应：指两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近，才能反应。

定向效应:指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定向。

1邻近效应与定向效应（proximityandorientationeffect）

productiveunproductive生物化学：第三章酶学生物化学：第三章酶学2、张力效应和底物形变（strainanddistortion）生物化学：第三章酶学ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物羧肽酶结合底物前后构象变化生物化学：第三章酶学酚吡啶α－羟基吡啶3、酸碱催化（acid-basecatalysis）

生物化学：第三章酶学生物化学：第三章酶学4、共价催化（covalentcatalysis）

什么是共价催化？

共价催化

亲电子催化

亲核催化生物化学：第三章酶学生物化学：第三章酶学羧肽酶活性中心的共价催化机理

145生物化学：第三章酶学

影响酶促反应速度的因素

1底物浓度2酶浓度3pH4温度

5激活剂6抑制剂

酶的活力与测定四、酶促反应动力学

(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。生物化学：第三章酶学酶促反应速度的测定与酶的活力单位

酶促反应速度的测定

初速度的概念酶活力

检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。生物化学：第三章酶学1酶促反应初速度的概念斜率=[P]/

t=V（初速度）[P]t用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度。测定反应的初速度。生物化学：第三章酶学

2酶活力的表示方法

活力单位（activeunit）

习惯单位（U）:底物(或产物)变化量/

单位时间国际单位（IU）:1μmoL变化量/

分钟

Katal（Kat）：1moL变化量/

秒比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小转换系数（Kcat）底物（μmoL）/秒·每个酶分子量度酶纯度比活力（specificactivity）量度转换效率生物化学：第三章酶学3酶活力测定方法

终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。

动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。生物化学：第三章酶学1.称取25mg蛋白酶配成25ml溶液，取2ml溶液测得含蛋白氮0.2mg，另取0.1ml溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生1500ug酪氨酸，假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1ug酪氨酸的酶量。请计算：(1)酶溶液的蛋白浓度及比活力(2)每克酶制剂的总蛋白含量及总活力。解：(1)酶液蛋白浓度：0.2×6.25/2=0.625mg/ml,0.1ml酶液中含1500/60=25u.

比活力：25u/0.1×0.625=400u/mg(2)每克酶制剂中总蛋白：0.625克蛋白。那么总活力：400u/mg×0.625g=250000u生物化学：第三章酶学2.甘油醛-3-磷酸脱氢酶，相对分子质量4万，由4个相同亚基组成，每个亚基上有一个活性位点，在最适条件下，5μg纯酶制品每分钟可以催化2.8μmol甘油醛-3-磷酸转化为甘油酸-3-磷酸。请计算酶的比活力和单个活性位点的转换数。解：依据活力单位的定义：每分钟催化1μmol的酶量为一个活力单位。上述纯酶含2.8个活力单位。依据比活力的定义：每毫克酶蛋白所含的活力单位数。该酶的比活力：2.8/5×10-3=560IU/mg

依据转换数定义：每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数。W=2.8/60×4=0.01167生物化学：第三章酶学1.底物浓度对酶反应速度的影响

影响酶促反应速度的因素

Michaelis—Menten曲线方程米氏常数的意义米氏常数的求解米氏常数的应用生物化学：第三章酶学1.底物浓度对酶反应速度的影响生物化学：第三章酶学

在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。生物化学：第三章酶学

为解释酶被底物饱和现象，Michaelis和Menten做了大量的定量研究，积累了足够的实验数据，提出了酶促反应的动力学方程：米氏（Michaelis—Menten）方程生物化学：第三章酶学Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，VO是在某一底物浓度时相应的反应速度。从米氏方程可知：当底物浓度很低时，

[S]<<Km,则V≌Vmax[S]/Km，反应速度与底物浓度呈正比;

当底物浓度很高时，

[S]>>Km，此时V≌Vmax，反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。米氏方程的解释生物化学：第三章酶学米氏常数的意义物理意义：Km值等于酶反应速度为最大速度一半的底物浓度。Km-酶与底物亲和力的关系值：Km愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1-10-6M之间。生物化学：第三章酶学Km在实际应用中的重要意义（1）.鉴定酶：通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。（2）.判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物,就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),两者相比，蔗糖为该酶的天然底物。（3）.计算一定速度下的底物浓度：如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则[S]=99Km生物化学：第三章酶学Km求解法生物化学：第三章酶学

用1/V0对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/Vmax,，在纵轴上的截距为1/Vmax,横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值。

双倒数作图法生物化学：第三章酶学双倒数作图法生物化学：第三章酶学2.酶浓度的影响在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大大超过酶浓度时，速度与酶的浓度呈正比。酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，[ES]也增加，而V0=k3[ES]，故反应速度增加。生物化学：第三章酶学3.pH对酶促反应速度的影响

大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力的pH称为酶的最适pH(optimumpHpHm)。典型的酶速度-pH曲线是较窄的钟罩型曲线，但有的酶的速度-pH曲线并非一定呈钟罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度-pH曲线。

生物化学：第三章酶学

动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH约1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8(见下表)。

一些酶的最适pH

生物化学：第三章酶学4.温度对酶促反应速度的影响

酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应速度加快。化学反应中温度每增加10℃反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。一般的化学反应的Q10为2-3，而酶促反应的Q10为1-2。在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度（optimumtemperatureTm）.一般动物组织中的酶其最适温度为35-40℃，植物与微生物中的酶其最适温度为30-60℃，少数酶可达60℃以上，如细菌淀粉水解酶的最适温度90℃以上。生物化学：第三章酶学生物化学：第三章酶学5.激活剂对酶反应速度的影响

能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(activator)，其中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg++是多种激酶和合成酶的激活剂，动物唾液中的α-淀粉酶则受Cl-的激活。

通常，酶对激活剂有一定的选择性，且有一定的浓度要求，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂，当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂。

生物化学：第三章酶学激活剂类别金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+

阴离子：

Cl-、Br-

有机分子还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金属螯合剂：EDTA生物化学：第三章酶学6.抑制剂对反应速度的影响

凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂(inhibitor)。使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。

类型：可逆抑制剂不可逆抑制剂

应用：研制杀虫剂、药物研究酶的作用机理，确定代谢途径生物化学：第三章酶学抑制的类型和特点

竞争性抑制可逆抑制非竞争性抑制

反竞争性抑制

非专一性不可逆抑制不可逆抑制

专一性不可逆抑制生物化学：第三章酶学6.1不可逆性抑制作用(irreversibleinhibition)

不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性。常见的不可逆抑制剂如下图所示。按其作用特点，又分专一性及非专一性两种。

生物化学：第三章酶学专一性不可逆抑制剂

这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX生物化学：第三章酶学非专一性不可逆抑制剂

抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型：生物化学：第三章酶学6.2可逆性抑制(reversibleinhibition)

抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。这类抑制剂大致可分为以下三类：竞争性抑制

非竞争性抑制

反竞争性抑制生物化学：第三章酶学竞争性抑制(competitiveinhibition)

抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。

实例：磺胺药物的药用机理生物化学：第三章酶学竞争性抑制曲线

生物化学：第三章酶学非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)

抑制剂I和底物S与酶E的结合完全互不相关，既不排斥，也不促进结合，抑制剂I可以和酶E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。底物S和酶E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。

生物化学：第三章酶学非竞争性抑制作用

+IEI+SESIESP+EE+S+I实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）生物化学：第三章酶学非竞争性抑制曲线Vi＝Vmax〔S〕(1+)〔I〕KiKm+()〔S〕生物化学：第三章酶学反竞争性抑制

反竞争性抑制剂必须在酶结合了底物之后才能与酶与底物的中间产物结合，该抑制剂与单独的酶不结合。

生物化学：第三章酶学反竞争性抑制曲线

生物化学：第三章酶学竞争性抑制作用非竞争性抑制作用竞争性非竞争性抑制作用机理示意图底物与酶专一性结合生物化学：第三章酶学有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程

生物化学：第三章酶学五、重要的酶类及酶活性的调节控制

多酶体系(multienzymesystem)别构酶(allostericenzyme)共价调节酶(covalentregulatoryenzyme)酶原(enzymogen或proenzyme)的激活同工酶(isoenzyme)抗体酶(abzyme)多功能酶(

multifunctionalenzyme)或串联酶(tandemenzyme)模拟酶、固定化酶等生物化学：第三章酶学多酶体系和多酶复合体

细胞中的许多酶常常是在一个连续的反应链中起作用，即前一个反应的产物是后一个反应的底物，在完整细胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的反应体系，称为多酶体系（multienzymesystem）。如果体系中几种酶彼此有机地组合在一起。精巧地镶嵌成一定的结构，即形成多酶复合体。这种结构即能提高反应途径的效率，又能增强调控的准确性。分散多酶体系与中间物示意图多酶复合体示意图生物化学：第三章酶学酶的别构（变构）效应和别构酶

概念：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调节(allostericregulation)，具有这种调节作用的酶称别构酶(allostericenzyme)。别构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S型曲线。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物(effector)，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物(positiveeffector)或别构激活剂，反之称负效应物(negativeeffector)或别构抑制剂。别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。

实例：天冬氨酸转氨甲酰酶（anspartatetranscarbamoylase，ATCase）

别构酶活性调节机理：序变模型和齐变模型生物化学：第三章酶学酶的别构（变构）效应示意图效应剂别构中心活性中心

别构酶的反馈调控机理A

（产物或中间产物）EDCB关键酶

—生物化学：第三章酶学A--非调节酶B--正协同别构酶的S形曲线

别构酶与米氏酶的动力学曲线比较

生物化学：第三章酶学1--非调节酶2--正协同别构酶3--负协同别构酶

正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较

生物化学：第三章酶学ATCase变构效应的动力学特征ATP（正效应剂）CTP（负效应剂）低催化活性构象T(tense)-态CCCCCC

RRRRRRCCCCCC高催化活性构象R(relax)-态RRRRRRVmax1/2VmaxKm生物化学：第三章酶学别构酶的序变模型SSSSSSSSSSSSSS亚基全部处于R型亚基全部处于T型依次序变化生物化学：第三章酶学别构酶的齐变模型SSSSSSSSSST状态（对称亚基）T状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基齐步变化生物化学：第三章酶学酶的共价修饰

某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶。

由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）P2生物化学：第三章酶学蛋白质的磷酸化和脱磷酸化

蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型

第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型第三类：双重底物型生物化学：第三章酶学反应类型共价修饰被修饰的氨基酸残基共价修饰反应的例子磷酸化腺苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型

Cys生物化学：第三章酶学

级联系统调控糖原分解示意图意义：由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应。这种调节方式快速、效率极高。肾上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸环化酶（无活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（无活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶（无活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶b（无活性）磷酸化酶a（活性）6、糖原6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖血液ATPADPATPADP肾上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456（极微量）（大量）生物化学：第三章酶学

有些酶在细胞内合成时，或初分泌时，没有催化活性，这种无活性状态的酶的前体称为酶原(zymogen)。酶原向活性的酶转化的过程称为酶原的激活。酶原激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。

酶原激活及意义生物化学：第三章酶学

胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。

例如，胰蛋白酶原进入小肠后，受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活，第6位赖氨酸与第7位异亮氨酸残基之间的肽键被切断，水解掉一个六肽，酶分子空间构象发生改变，产生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原变成了有活性的胰蛋白酶。

在于避免细胞内产生的蛋白酶对细胞进行自身消化，并可使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢的正常进行.生物化学：第三章酶学胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意图

生物化学：第三章酶学生物化学：第三章酶学生物化学：第三章酶学

概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）。乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶。

生物学功能

遗传的标志

和个体发育及组织分化密切相关

适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要

同工酶(isoenzyme)生物化学：第三章酶学乳酸脱氢酶同工酶形成示意图

多肽亚基mRNA四聚体结构基因ab乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+–H4MH3M2H2M3HM4点样线生物化学：第三章酶学不同组织中LDH同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌肾肝骨骼肌血清-+原点生物化学：第三章酶学同工酶在各学科中的应用

(1)遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。(2)发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。(3)生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。（4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。生物化学：第三章酶学抗体酶

抗体酶（abzyme）又称催化抗体（catalyticantibody）,是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子向结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能,达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。生物化学：第三章酶学O–C–A.酯酶的底物–酯B.酯的羧基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态C.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物磷酸酯类似物(半抗原)对酯水解反应有催化作用的单克隆抗体免疫免疫反应诱导法制备具有酯酶活性的抗体生物化学：第三章酶学基因工程抗体酶的制备

对已产生的单抗，分析氨基酸的组成或相应基因的碱基序列，对抗体结合的部位的基因进行定位突变，在抗体结合部位换上有催化活性的氨基酸，基因工程的技术使得建立抗体基因的组合文库，并根据需要构建适当程序的基因片段成为可能。生物化学：第三章酶学抗体酶的筛选

在抗体酶研究中，一个不可少的步骤是在细胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的细胞克隆，再从纯化的抗体中筛选出有催化能力的单抗。主要筛选方法有生物学筛选法和纯化学筛选法。生物化学：第三章酶学抗体酶的研究和