分子生物学研究技术

Module1:分子生物学研究技术cDNA文库cDNA文库，代表了生物体某一器官或组织mRNA中所有的或绝大部分的遗传信息。其构建过程总共有5个步骤（5项技术）：1、总RNA的提取；2、mRNA的纯化；3、cDNA的合成；4、cDNA文库构建；5、基因文库筛选。详细：1、总RNA的提取：目前常用的提取方法是异硫氰酸胍-苯酚提取法（Trizol提取法），提取步骤：（1）首先用液氮研磨材料成匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎并溶解细胞；（2）加入氯仿抽提，离心，收集含有RNA的水相；（3）用异丙醇沉淀，初步纯化RNA，获得样品用于下一步mRNA的纯化；（PS：实验中还常将含有RNA的细胞破碎物液通过硅胶膜纯化柱后，再通过低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱RNA，获得纯度较高的总RNA）；总RNA的浓度、纯度测定：通过分光光度计测其OD260和OD280值，OD260为1时相当于RNA总量为40μg/ml；而OD260/OD280的比值如果在1.8~2.0之间，则表示所提取的RNA纯度较好。 2、mRNA的纯化：纯化原理，将真核细胞的mRNA分子具有5‘端帽子（m7G）和3’端poly（A）尾巴的特征结构，作为提取时的选择性标记。纯化提取方法：常用寡-纤维素柱层析法获，该方法利用mRNA3‘末端的poly（A）尾巴的特点，当RNA流经寡-纤维柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA或特异性结合到柱子上，之后再用低盐溶液洗脱mRNA，经过两次层析后可获得较高纯度的mRNA。 3、cDNA的合成：利用RT-PCR技术，常以oligo（dT）为引物，甲基化的dCTP（保证新合成的cDNA链被甲基化，防止构架克隆时被限制性内切酶切割）。合成基本过程：以mRNA为模板链，在逆转录酶的催化下以甲基化dCTP为原料合成第一条cDNA链；之后再以第一条cDNA链为模板，在DNA聚合酶催化下合成第二条cDNA（常用RNaseH切割mRNA-cDNA杂链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成的第二条cDNA片段，再同过连接酶的作用连接成完整的DNA链。（PS：最后，cDNA两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得的cDNA具有方向性） 4、cDNA文库的构建：由于cDNA的长度一般为0.5~8Kb，所以常用质粒载体和噬菌体类的载体便能用于承载cDNA。基本过程：将合成的cDNA连接到特定的载体上，然后将载体转入宿主细胞（一般为大肠杆菌），然后筛选阳性克隆，最终获得cDNA文库。PS：一般而言，cDNA文库的载体选择要根据文库的用途来确定，例如Uni-zapXR载体是一种噬菌粒载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0~10kbDNA片段插入。 5、基因文库筛选：是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需要的重组DNA分子的特定克隆的过程。目前主要的筛选方法有：核酸杂交法、PCR筛选法和免疫筛选法。核酸杂交法（最常用的筛选方法之一）：（1）将圆形硝酸纤维素膜放在含有琼脂培养基的培养皿表面，将待筛选的菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，后进行适当的温育（同时保留原菌板作为对照。）（2）取出已长有菌落的硝酸纤维素膜，用碱液处理，裂解细菌并使DNA变性；（3）接着用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜上的蛋白质，形成菌落DNA印迹；（4）80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上；（5）将滤膜与放射性同位素标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射自显影显示杂交结果。（X射线底片上显黑色斑点的就是试验中寻找的目的克隆）（6）通过比对显影的结果，可在对应的原菌板上获得相对应的克隆。PCR筛选法：使用前提，已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。基本过程：（a）将整个文库（以质粒或菌落的形式均可）保存到多孔培养板上；（b）用设计好的目的基因探针对每个样孔进行PCR筛选，鉴定出阳性孔；（c）把每个阳性孔中的克隆在稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出于目的基因对应的单个克隆为止。免疫筛选法：基本步骤与核酸杂交检测类似，主要过程：先将菌落或噬菌斑影印到硝酸纤维素膜上，再原位溶解菌落释放抗原蛋白，后用抗体与固定了抗原的膜杂交，抗原抗体结合后，再用标记好的二抗与之反应，最后通过对标记物的检测便可找到阳性克隆。基因组DNA文库的构建基因组DNA文库：是指把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合后导入微生物细胞，所形成的所有DNA序列的克隆汇总。应用：1、分离特定的基因片段；2、分析特定的基因结构；3、研究基因表达调控；4、构建全基因组物理图谱和全基因组序列测定。主要过程：1、提取样品DNA，将所提取的DNA制备成大小适合的随机DNA片段2、体外将这些DNA片段与适当的载体连接成重组子3、将重组子转化到大肠杆菌或其他受体细胞4、从转化克隆群中筛选出含有靶基因的阳性克隆。基因组文库的基本要求：必须具有一定的代表性和随机性，以保证能从文库中筛选到某个特定基因。提高基因组文库代表性的策略：1、用机械切割法或限制性内切核酸酶切割法随机断裂DNA，保证克隆的随机性；2、增加文库重组克隆的数目，以提高覆盖基因组的倍数。实例：一般常用限制性内切酶部分消化法和ƛ噬菌体载体来构建基因文库，具体：①提取真核基因组DNA，用可识别4个核苷酸的限制性内切核酸酶Sau3A部分消化基因组DNA，②消化的产物经过琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心，收集15~20kb范围的片段；④同时用BamHI消化噬菌体载体（Sau3A和BamHI是同尾酶，前者产生的片段可插入后者切割的缺口）；⑤用T4连接酶将载体与DNA片段相连接，形成重组子；⑥体外包装后用重组噬菌体侵染大肠杆菌受体细胞；产生噬菌斑，组成包含该真核生物基因组绝大部分序列的DNA文库。酵母杂交系统1、酵母单杂交系统：原理：将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimalpromoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游；然后将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子使报告基因表达。作用：（1）用于确定某个DNA分子与某个蛋白质分子之间是否存在相互作用；（2）用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因；（3）验证反式转录调控因子的DNA结合域；（4）准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。2、酵母双杂交系统：原理：利用酵母细胞转录调控因子具有组件式结构的特征，即该种蛋白由两种相互独立的结构域组成（DNA结合结构域-BD；转录激活结构域-AD），转录因子要发挥功能需要两种蛋白相连接。实验基本过程：首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调控因子BD编码区的表达载体上；然后，导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区域结合作为“诱饵”来捕获与已知蛋白相互作用的基因产物；再然后，将已知的编码AD的DNA分别与带筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得AD“猎物”载体去转化含有“诱饵”的酵母细胞；一旦，酵母细胞中表达的“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，不同转录调控因子的AD和BD就会被牵引靠拢，进而激活报告基因的表达。蛋白质相互作用技术1、等离子表面共振技术（SPR）原理：该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，将葡聚糖层固定于纳米级厚度的金属膜表面，当有蛋白混合物进过时，如果有蛋白同诱饵蛋白发生相互作用，那么两者的结合将会使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度改变；而共振角度改变与该处蛋白质浓度成正比关系，由此检测蛋白质之间的相互作用。优点：不需要标记物和染料，安全、灵敏、快速还可做定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。2、免疫共沉淀技术（co-immunoprecipitation，CoIP）基本原理：该技术核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。基本过程：首先，将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的大筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固定基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管底部或微膜上。如果靶蛋白与带筛选蛋白发生了相互作用，则这个带筛选蛋白就会通过靶蛋白与抗体和固体基质相互作用而被分离出来。3、GST及GAD融合蛋白沉降技术基本原理：该技术是利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用的蛋白质。应用：1、确定探针蛋白与未知蛋白间的相互作用；2、确定探针蛋白与某个已知蛋白之间的相互作用。基本过程：将GST与探针蛋白相结合，然后与谷胱甘肽-琼脂糖球珠、待测蛋白混合物一起在4℃条件下反应；离心，收集沉淀物；之后用SDS分析。4、荧光共振能量转移法（FRET）—细胞内蛋白质相互作用研究方法常用探针：荧光蛋白、传统有机染料和镧系染料。研究蛋白质间相互作用时，FRET一般与荧光成像技术联用，将蛋白标记上探针，当蛋白质之间不发生相互作用时，其相对距离较大，无荧光共振能量转移现象，而有蛋白质相互作用时，由于相对距离小，则会出现荧光共振能量转移现象，该过程可直接根据成像照片色彩变化观察并记录。5、噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将基因表达产物与亲和选择相结合的技术，其基本原理是将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组的噬菌体在侵染大肠杆菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，这样便可直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质。DNA-蛋白质相互作用研究技术染色质免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation，ChIP）—研究活体细胞内染色质DNA与蛋白质相互作用主要实验流程：1、在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并通过超声波或酶处理将其随机切断为一定长度的染色质小片段；2、然后通过抗原抗体的特异性识别反应，沉淀该复合物，从而富集与目的蛋白质相结合的DNA片段；3、最后通过对目的片段的纯化及PCR检测，获得该蛋白与DNA相互作用的信息（DNA序列特征、位置、结合时间、亲和程度以及基因表达的影响）凝胶滞缓实验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）—体外分析DNA与蛋白质的相互作用基本原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加相对分子质量，而凝胶电泳中DNA朝正电极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，与蛋白质形成复合物的DNA会由于受阻滞而跑得慢。EMSA实验中：用放射性同位素标记待检测的DNA片段，然后与细胞提取物共温育，然再添加到非变性的聚丙烯酰氨凝胶中电泳。通常用32P标记DNA片段，电泳结束后，如果细胞提取物中不存在与DNA相互作用的蛋白质，那么所有放射性标记都会出现在凝胶底部；反之，由于结合蛋白质而受阻滞的原因，放射性标记的DNA条带会出现在凝胶的不同部位。三种研究基因功能的研究方法基因定点突变技术（site-directedmutagenesis）、基因敲除技术和RNAi技术是当前研究基因功能的三种主要研究方法（技术），基本原理：主要通过全部或部分一直基因的表达，再通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化，从而确定所研究基因的功能。（1）基因定点突变技术：当前基因定点突变技术主要采用基于PCR技术的两种方法：重叠延伸技术和大引物诱变法。其中（a）重叠延伸技术主要过程：1、首先将模板DNA分别与引物1（正向诱变引物FM和反向诱变引物R2）和引物2（正向引物F2和反向诱变引物RM）退火；2、通过PCR1和PCR2扩增出两种靶基因片段；3、FM-R2和RM-F2片段在重叠区发生退火，用DNA聚合酶补平缺口，形成全场双链DNA后进行PCR3扩增；4、最后，用引物F2和R2通过PCR4扩增出带有突变位点的全长DNA片段。（b）大引物诱变法基本过程：1、首先通过正向突变引物（M）和反向引物（R1），通过PCR1扩增模板DNA产生双链大引物；2、将大引物与野生型DNA分子混合后退火并使之复性，在第二轮PCR中加入正向引物（F2），与PCR1中产生的第一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA；3、获取定点PCR产物后，进行DNA序列分析以验证突变位点。（PS：PCR介导的定点突变方法具有的优势：1、突变体回收效率高，以至于不需要再进行突变体筛；2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突变；3、可在同一试管中完成所有的反应；4、快速简便，无需在M13载体上进行分子克隆。）（2）基因敲除技术：原理：通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，来进行精确的定点修饰和基因改在。基因敲除分类：完全基因敲除、条件型基因敲除；基本操作过程：（a）完全基因敲除，通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中靶基因的活性：实验中一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据正-负筛选（P-N-S）原理进行完全基因敲除实验。正向选择基因neo通常被插入载体靶基因DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组置换靶基因的功能区。（neo基因有双重作用，一方面形成把位点的插入突变，同时可以作为正向选择的标记；负向选择基因HSV-tk（疱疹病毒熊腺嘧啶激酶基因）则被置于目的基因片段外侧，含有该基因的重组细胞无法在培养基上生长。）由于遗传重组的自然发生概率极低，即使采用双向选择法（上述）也难保证一次筛选出真正发生同源重组的胚胎干细胞，之后还需要用PCR及southern印迹法等分子筛选技术验证目的基因被敲除了的细胞系。（b）条件基因敲除：通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除：条件基因敲除常应用Cre/LoxP和FLP/FRT系统开展；大致过程：构建条件型基因敲除时，常将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要的功能域两侧内含子中插入方向相同的LoxP位点；当实验需要消除靶基因活性时，只需要与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre重组酶就能把两个LoxP位点中间的DNA偏段切除，导致靶基因失活（PS：标记基因两侧也常常带有LoxP序列，因为许多时候即使标记基因位于内含子中也会阻断靶基因的转录，一旦发生这种情况，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶ES细胞，通过LoxP位点重组将neo抗性基因敲除。）高等动物基因敲除技术：主要技术路线包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法将重组DNA导入胚胎干细胞纯系中（使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组）；主要全基因敲除实验流程（以碱性磷酸酶（IAP）基因敲除为例）：（1）利用Neo基因替换目的基因，得到碱性磷酸酶基因敲除的ES细胞；（2）用显微注射或电穿孔法将IAP基因敲除的ES细胞注入早期胚胎的囊腔中；（3）诱导胚胎分化，获得嵌合体后再与野生纯合体回交，最终可获得由ES细胞分化产生的IAP基因敲除小鼠。条件型基因敲除主要实验过程（肝组织S6基因为例）：（1）首先构建带有S6基因的LoxP打靶载体的ES细胞；（2）经过杂交筛选获得纯合体小鼠；（3）再与带有肝组织特异性、受INF-α诱导的Mx-Cre转基因小鼠杂交；（4）删除neo基因和外显子3~5后变得到肝组织特异性敲除S6基因的小鼠。十七、基因工程操作全过程（目的基因获取、构建表达载体、转基因操作、阳性克隆的筛选与鉴定）植物基因敲除技术：植物基因敲除常采用T-DNA插入失活技术；原理：利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达从而使该基因“失活”。（PS：T-DNA无专一性位点，在植物基因组中发生随机整合，所以理论上只要突变株数量足够大，就可能获得任何一个功能基因都发生突变的基因敲除植物库）植物基因敲除突变体筛选：由于基因内部或附近插入了一段一直序列的DNA，可据此设计引物用PCR的方法将被破坏的靶基因分离出来；若将靶基因两端引物LP、RP及插入载体上的引物LB加入同一反应提体系中进行PCR，理论上能得到三条类型的条带：在野生型植株中只有LP和RP引物配对扩增出来的靶基因条带；纯合型基因敲除植株，只有靶基因一端的引物可以与LB引物配对完成PCR扩增；如果是杂合型基因敲除植株，PCR扩增或会出现两种条带。（3）RNAi干涉技术：原理：利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的作用机制：前体miRNA被释放到细胞质后，经过Dicer（一种具有RNAaseⅢ活性的核酸酶）加工成双链miRNA，较长的双链RNA（30bp以上）首先被Dicer降解成21~35个核苷酸的小分子干扰核糖核苷酸（siRNA）；siRNA中反义链指导合成RNA诱导沉默复合体蛋白（RISC），再有RISC介导切割目的mRNA中与siRNA反义链互补的区域（部分同源性-翻译受阻；高度同源性-直接降解），从而实现干扰靶基因表达的功能。PS：少量的siRNA信号也可能被迅速放大的原因：siRNA可作为特殊引物，在依赖RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，dsRNA可被降解成siRNA后进入上述循环。PS2：哺乳动物，较长的dsRNA会导致非特异性基因沉默，短的siRNA才能有效引发特异性基因沉默；非哺乳动物可直接利用较长的dsRNA诱导RNAi而无需合成siRNA。基因克隆技术克隆在分子生物学上的定义：将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制的过程。主要有5种方法（技术）：RACE技术、cDNA差示分析法、Gateway大规模克隆技术、基因图位克隆法、热不对称多聚酶链式反应（用于克隆T-DNA）。（1）RACE技术：RACE，即cDNA末端快速扩增法，是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列的技术。主要操作步骤：a、获得高质量总RNA（含有大量完整mRNA、tRNA、rRNA、和部分不完整的mRNA）；b、去磷酸化作用（带帽子结构的mRNA不受影响）；c、去掉mRNA的5’端帽子结构，加上特异性RNA寡聚接头并用RNA连接酶相连接；d、以特异性寡dT为引物，在反转录酶的作用下，反转录合成第一条cDNA（包含了寡接头的互补序列）；e、分别以第一条cDNA链为模板进行REAC反应：（1）5’REAC以5’端RNA寡聚接头的部分序列和基因特异的3’端反向引物进行PCR扩增，获得基因的5’端序列。（2）3’REAC以5’端基因特异的引物和3’端寡dT下游部分序列为引物进行PCR扩增，获得基因的3’端序列。（PS:如果只对3’端序列感兴趣，可直接从倒数第二步开始进行3’REAC）f、将纯化后的PCR产物克隆到载体DNA中，进行序列分析。（PS：REAC技术还被用于获得5’和3’端非转录序列，研究起始转录位点的不均一性，研究启动子区的不保守性）十八、由cDNA证明基因含有内含子、确定内含子比例（2）cDNA差示分析法（RDA）？？？作为染色体步移技术和定位克隆技术等方法的补充，RAD充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体的复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。（3）Gateway大规模克隆技术？？？该技术利用ƛ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的可读框提供了保障。该技术主要包括TOPO反应和LR反应两步：TOPO反应将目的基因PCR产物连入Entry载体；LR反应被用于将目的片段从Entry载体中重组入表达载体。(4)基因图位克隆法（map-basedcloning）—分离位置性状基因基本过程：首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在位点两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记；其次，通过对许多不同生态型个体的大量限制性内切核酸酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段分离克隆出来；最后，再根据基因功能互作原理鉴定目的基因。（5）热不对称多聚酶链式反应—用于克隆T-DNA作用：TAIL-PCR常用于扩增T-DNA插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据。主要过程：该方法使用一套巢式特异性引物（T-DNA边界引物，TR）和一个短的随机简并引物（AD）。第一轮反应（PCR1）是TAIL-PCR的重要环节，先进行5个高严谨性的循环，特异性引物TR1与模板退火，只能发生单引物循环，T-DNA上游侧翼序列得到线性扩增；再者，大幅度降低退火温度，使AD及TR1均与模板DNA相结合，指数扩增一个循环；此后，两个高严谨、一个低严谨循环交替进行，共15个循环（结果，特异性序列（两端分别有TR1和AD序列）和非特异性序列1（只有TR1）大大超过非特异性序列2（两端均为AD））；第二轮反应（PCR2）以特异性引物TR2和AD配对，进行12个TAIL-PCR循环，特异性序列再次被优先扩增，非特异性序列1也大大降低，此时没有明显的背景片段。第三轮反应（PCR3）是真正意义上的PCR，用TR3为特异性引物与AD配对，共2个循环，进一步扩增特异性序列。多聚酶链式反应（PCR）基本原理：将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链，之后在DNA聚合酶的作用下以单链DNA为模板利用反应体系中的四种脱氧核糖核苷酸合成新的DNA互补链。（反应体系：模板DNA、PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、缓冲液）反应的基本过程：双链模板DNA首先在高温下解开成长单链，之后断链引物迅速与模板特定序列结合产生双链区，DNA聚合酶从引物处开始复制合成其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。整个过程：DNA解链（变性）—引物与DNA模板结合（退火）—DNA合成（延伸）。几项常用的PCR技术：1、实时定量PCR（realtimequantitativePCR），一项利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数问题的PCR技术。基本原理：荧光探针实现混合在PCR溶液中，只有与DNA结合后才能够激发出荧光。随着新合成的DNA片段的增加，结合到DNA片段上的荧光探针数量也在增加，被激发的荧光也相应增加—所以荧光强度直接反映了被扩增的靶基因总量。PS：常用的荧光探针：1、SYBRGreen1，非特异性，520nm，只能与双链DNA结合。重亚硫酸盐测序技术—DNA甲基化检测主要过程：1、将待测DNA样品用限制性内切酶处理或超声波破碎等方法打断成500~1000bp碎片；2、再用重亚硫酸盐处理使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶发生脱氨作用转变成尿嘧啶（被甲基化的胞嘧啶由于甲基化保护而不受影响）；3、PCR扩增后该尿嘧啶被测序仪读取为胸腺嘧啶；4、最后参考原始序列即可判断源C位点是否发生甲基化。注意事项：1、重亚硫酸盐测序分析时必须对同一目标片段进行多次测序（通常为11次），以免产生同源测序（siblingsequencing，是指实验中所挑取的克隆来源于同一原始DNA模板分子，形成了完全相同的没有代表性的甲基化模型）；2、由于重亚硫酸盐测序引物常有简并位点，造成PCR扩增过程中引物对不同甲基化程度DNA模板分子的亲和力不同，使亲和力高的模板分子在PCR产物中占高比例，所以经常需要用其他方法做平行试验。其他检测甲基化的方法：1、甲基化敏感限制性内切核酸酶法（MS-RE）；2、甲基化特异性PCR（MS-PCR）；3、DNA微阵列法；4、甲基化敏感性斑点分析法（MS-DBA）。其他相关知识概念：1、DNA甲基化（DNAmethylation）：具体指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体将甲基转移到特定的碱基上的过程。（DNA甲基化会抑制基因的表达）2、细胞中DNA甲基化的3种状态：1、持续的低甲基化状态，如管家基因；2、去甲基化状态，如一些发育阶段特异表达的基因；3、高度甲基化，如女性一条失活的X染色体。3、CpG岛（CpGisland）：指在基因组的某些区域中，CpG序列密度达均值的5倍以上所形成的鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区。通常位于基因启动子区或第一个外显子区。核酸的分离与纯化1、凝胶电泳基本原理：在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链实际上是呈多聚阴离子状态，所以将DNA或RNA放入电场中，它们会由负极向正极移动，且在一定电场强度下，核酸分子的电泳迁移率取决于分子本身大小和结构。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关：琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围：0.2kb~50kb；聚丙烯酰胺凝胶：1~1000bp；脉冲电场凝胶电泳（PFGE）：>50kb,max=107bp。2、DNA提取纯化首先必须破碎或溶解细胞，再用NaCl将DNP抽提出来，再把其中的蛋白质、RNA等杂质除去，即可获得DNA。主要步骤：（1）细胞裂解和DNA溶解：一般采用机械破碎细胞释放DNA，另外由于破碎后细胞质中释放的酶容易使DNA失活，所以该步骤的另一项任务就是对DNA实施快速保护（1、利用液氮在超低温下研磨，使酶失活；2、快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中的DNA进行保护（如缓冲液中的EDTA可以螯合DNA酶辅助因子使酶活性降低等）。（2）去除蛋白质、RNA等杂质：主要利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差异，通过加入离子变性剂、去污剂是蛋白质多糖变性，核蛋白解聚；常用苯酚/氯仿抽提法去除蛋白质多糖，而RNA极易在溶液中降解，必要时可以加入不含DNA酶的RNA酶。（3）DNA的沉淀与纯化：将进过除杂的DNA溶液中加入异丙醇沉淀DNA，同时除去残留的蛋白质多糖；后在用无水乙醇在此沉淀纯化；用75%乙醇清洗除去各种离子，再将沉淀DNA溶于TE溶液中，或采用密度梯度离心等方法加以纯化，最后便可得到总DNA溶液。常用方法：1、浓盐法；2、SDS法，SDS能与蛋白质变性结合形成复合物，通过乙酸甲可使复合溶解度变小，从而与DNA分离。3、CATB法，该方法是一种快速提取总DNA的方法，在细胞破碎后即可加入CATB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后就可得到总DNA。4、苯酚抽提法，苯酚作为蛋白变性剂同时可以抑制DNA酶的降解，用苯酚处理匀浆时，蛋白质分子溶于酚相，而DNA溶于水相；离心分层后取出水相，多次反复操作，再合并含DNA的水相，最后用乙醇沉淀DNA。蛋白免疫印迹法（westernblotting）-蛋白质检测基本原理：被测蛋白只能与标记的特异性抗体相结合，而这种结合不改变该蛋白在凝胶电泳中的相对分子质量。作用：检测样品中是否存在某一特定蛋白。主要过程：蛋白质样品制备；SDS电泳分离样品；将已分离的蛋白质转移到尼龙膜或硝酸纤维膜等膜上，转移后首先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性结合；用固定在膜上的蛋白质作为抗原，结合对应的非标记抗体一；洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中蛋白质成分。SouthernBlotting-DNA检测原理：将待检测的DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳后在碱性条件下变性，再以1.5mol/LNaCl、1mol/LTris（PH=7.4）条件下中和，是DNA保持单联状态，然后通过毛细管作用或电泳转移等方式将DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与标记探针杂交，放射自显影即可显示该样品中是否含有目的基因。NorthernBlotting-RNA检测原理与方法同Southernblotting相似，不同在于实验分析材料为总RNA或mRNA，无需经过酶切步骤可直接变性、电泳、转膜然后杂交检测。抗体制备制备主要过程：1、抗原准备；2、动物选择：常依据抗体的用途和用量来决定，如需要大量制备抗体则选择体型较大的动物，如果期望获得直接用于标记诊断的抗体，则应采用与诊断目标相同的动物；3、动物免疫：针对不同的动物及要求的抗体特性不同，需采用不同的免疫剂量、免疫周期来进行动物免疫；在一定范围内，抗体的效价随免疫的剂量增加而提高，较长的免疫周期有利于获得较高效价的抗体血清；4、效价检测：可采用试管凝集法、琼脂扩散实验、酶联免疫吸附实验（ELISA）等检测效价；5、采集血清，纯化抗体；6、获得抗体并进行纯度及特异性鉴定。基因表达研究技术1.基因芯片技术—基因组水平上各转录物变化规律基因芯片（DNAchip）又称DNA微阵列技术（DNAmicroarray），是利用一种小型装置，来快速和精确地研究生物体、组织、器官或细胞内基因组的遗传信息。基本过程原理：1、制作芯片时，可用机械臂将大量已知或未知基因序列的DNA片段点在玻璃片、金属片或尼龙膜上，在经过物理吸附作用使其固定化。（也可以直接在玻璃板或金属板表面基因化学合成，从而得到寡核苷酸芯片）2、将芯片与待研究的cDNA或其他样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可观察到成千上万基因在不同组织或同一组织不同发育时间或不同生理条件下的表达情况。（PS：原理2：荧光标记的cDNA与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，信号强度和基因的表达丰度成正相关）基因芯片技术研究的一般的5步骤：提出问题、制备样品、生化反应、检测和数据模型分析。十三、操纵子携带基因导入大肠杆菌的遗传操作2.原位杂交技术—核酸定位、定量研究原位杂交（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常分为：RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类；RNA原位杂交：用放射性或非放射性（如生物素）标记的特异性探针与固定的组织切片反应，若细胞中存在于探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，从而对该基因表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。荧光原位杂交（FISH）：首先对寡核苷酸探针做特殊处的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶基因染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子向偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。3.转录组测序—基因表达系列分析（SAGE）SAGE是一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。原理依据：1、一个9~10碱基的短核苷酸序列标签包含有足够信息，能够唯一确认一种转录物；2、如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。SAGE操作的主要过程：分离提取mRNA—反转录反应合成cDNA—用特定的限制性核酸内切酶（锚定酶）酶切—分离3’端酶解片段，分两份，分别与接头相连—用标签酶酶切，形成双标签—根据连接子设计引物，进行PCR扩增—经PAGE电泳回收目的条带，用锚定酶酶切，分离纯化双标签并串联入载体中—筛选，测序，进行基因的鉴定和表达频率分析。优点：高灵敏度，能大规模检测；能检测所有基因（包括位置基因）的定量数据；避免了扩增时的偏倚；大量数据可用于多重比对。RNA选择性剪切技术选择性剪接（alternativesplicing）是指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA前体产生mRNA剪接异构体的技术过程。一般剪接分为：平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、外显子遗漏性剪接和相互排斥性剪接。最后可以用RT-PCR来研究基因是否存在选择性剪接。蛋白质磷酸化分析技术蛋白激酶体外磷酸化活性分析，主要分为获取底物蛋白或待检测蛋白激酶和进行蛋白质体外磷酸化反应两步：①直接从组织中提取，也可以由原核或真核表达载体诱导表达得到底物蛋白或待检测蛋白激酶；②将底物蛋白聚合到聚丙烯酰胺分子中，再将待检测的蛋白激酶上样后电泳，结束后洗去SDS，再加入γ-32P-ATP的反应液孵育12h（γ-32P-ATP的γ基团会在蛋白激酶的作用下转移到底物蛋白上）；③用三氯乙酸终止反应，洗去未反应的γ-32P-ATP，再用放射自显影法检测与P标记的γ磷酸基团相结合的底物蛋白，确定蛋白激酶及其活性。细胞定位及染色技术常用的定位方法有荧光蛋白标记法和免疫荧光法。荧光蛋白标记法的基本原理：将绿色荧光蛋白编码基因与目的基因的启动子融合形成嵌合基因，或者与目的基因编码序列融合，构成融合基因，转入受体细胞后通过荧光蛋白的荧光效应在荧光显微镜下便可观察并确定目的蛋白在细胞中分布情况。免疫荧光法基本原理：用针对特异蛋白抗原的荧光标记抗体作为分子探针检测细胞或组织内的相应抗原，利用荧光效应对抗原蛋白进行细胞定位。基因工程与操作技术基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作过程。基因操作：泛指对基因进行分离、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。基因工程技术流程：（1）克隆目的基因，从特定的生物基因组或cDNA中通过各种方法分离和PCR扩大繁殖获得足够量目的基因或cDNA序列；（2）载体准备，选择合适的载体，并对载体DNA进行克隆，制备足够的且达到一定纯度的载体DNA；（3）目的基因与载体连接，通过限制酶剪切和连接酶的连接作用，将目的基因连接于载体的多克隆位点或启动子和终止子之间，实现DNA重组；（4）重组DNA导入受体细胞，通过转化、转导、转染或显微注射等方法将重组DNA导入受体细胞中；（5）重组体的筛选与鉴定，利用载体上的选择标记基因进行筛选，以获得具有重组DNA分子的重组细胞，此外还需对所获得的转化细胞（转基因动植物）进行分子鉴定；（6）重组体的大量培养，外源基因表达效应分析，将经筛选和鉴定出来的大肠杆菌等转化细胞进行大量繁殖，对外源基因表达蛋白进行分离纯化并进行后续结构功能分析的研究；分析外源基因表达对情况及其对动植物性状的影响。基因工程主要应用技术：1、DNA、RNA的分离与检测；2、凝胶电泳分析技术；3、分子杂交技术；4、DNA的酶切、连接与细菌的转化技术（基因操作技术）；5、PCR；6、DNA序列分析技术；7、核苷酸合成技术；8、基因定点突变技术；9、分子相互作用分析技术；10、细胞培养与再生技术。转基因动植物的检测鉴定答：一、个体水平检测：如所导入的基因可改变转基因个体的外观形状则可通过直接观察来初步确定该个体是否为转基因个体；二、分子水平检测：（1）DNA分子检测1、Southern杂交：提取基因组DNA，进行酶切消化，电泳后将DNA转印至膜上，用外源目的基因的一些片段作探针与之杂交，通过放射自显影，在膜上便可获知该基因组DNA中是否含有外源转入的基因。此法虽然复杂，对低拷贝转基因动物易漏检，但通过适当的酶切消化可确定整合的外源基因的完整性，且在转基因动物的内源性基因和外源性基因的同源性较高时，Southern杂交是最为可靠的方法。2.斑点杂交法：较Southern杂交方法简单，提取转基因动物的基因组DNA后，直接点在载体膜上，用外源目的基因片段作为探针进行杂交，通过显影获得杂交结果。此法杂交结果不可靠，在转基因动物的内源性基因和外源性基因的同源性高时，检测结果的假阳性高。3、PCR法提取基因组DNA，根据外源基因设计特异的检测引物，对转基因动物的基因组DNA进行PCR扩增，电泳