免疫组化与杂交组化课件

免疫组化与杂交组化免疫组化与杂交组化

免疫组化与杂交组化第一章理论基础theoreticbasis

免疫组织化学和杂交组织化学是一门原位示踪染色技术。学科交叉的产物。免疫组化与杂交组化理论基础是基于利用放射性核素和其他标记物（荧光素，酶，重金属离子等）作为示踪剂，通过免疫亲和（抗原-抗体特异性结合）和核酸杂交（碱基配对特异性连接）途径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技术。免疫组化与杂交组化

基本特点是“特异,灵敏，准确，形态、机能、代谢三位一体”，系分子病理学研究的常用手段。免疫组化与杂交组化学习的重点有四：

1.名词概念；

2.技术原理；

3.操作要领；

4.结果判断原则

（尤其是对照染色和假阳性假阴性的判别）。免疫组化与杂交组化第一节抗原1.抗原的概念凡能在机体内引起体液免疫和/或细胞免疫反应的物质,称为抗原。

免疫组化与杂交组化抗原主要具有两方面的特性，抗原能引起机体产生抗体和/或致敏淋巴细胞，称之为免疫原性；抗原还与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异性结合或反应，称为免疫反应性。免疫组化与杂交组化有免疫原反应性而缺乏免疫原性的抗原称为半抗原，半抗原与载体（通常是大分子物质）结合，可变为全抗原，载体不仅增加半抗原的大小，可在体内激发免疫反应，而且还直接与免疫记忆有关。免疫组化与杂交组化2.抗原的化学结构

一个天然抗原具有二种结构，一是高分子的载体（抗原性）；二是抗原决定簇（特异性）。免疫组化与杂交组化

抗原决定簇（antigenicdeterminant）又称抗原表位（epitope.)是指抗原分子上具有决定和控制抗原特异性的特殊化学基团,可与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位。大多数蛋白质抗原可有多个抗原决定簇,但由于空间位阻作用,在同一时间内仅有部分抗原决定簇暴露和相应的抗体结合。免疫组化与杂交组化3.抗原的性质及种类异性`大分子`特异为抗原的共同性质，凡种系越远`分子量越大`构型越复杂`抗原决定簇暴露越多，则其抗原性越强，特异性越高。抗原的特异性是临床诊断`预防`治疗的基础。

免疫组化与杂交组化

抗原的类型繁多，分类方法也很多，故抗原的名称各种各样（表1-1-1）。

抗原有可溶和不溶性两类，后者主要包括一些颗粒性抗原，如细胞`细胞器`某些病原体等。根据性质，抗原又可分为：

免疫组化与杂交组化①结构抗原，为组成细胞结构的成分，如细胞骨架蛋白；②分泌抗原，为细胞所产生和分泌的酶`激素`粘液蛋白等；③沉淀抗原，如肾小球肾炎时，沉淀在肾小球基膜的免疫球蛋白`补体和免疫复合物等；④入侵抗原，主要指病原微生物。免疫组化与杂交组化4.抗原分离纯化的一般原则

免疫组化方法检测的抗原中，蛋白质占了大多数，故此处叙述的一般原则以蛋白抗原为主要对象。

免疫组化与杂交组化⑴首先选择和建立抗原的检测方法目的是跟踪监测一系列提纯过程中抗原是否存在，其含量和活性如何。方法有特异和非特异之分，前者利用抗原的特异反应，后者利用抗原已知的理化特性。免疫组化与杂交组化⑵选择抗原含量高的组织为材料

组织中欲提抗原含量越高，提纯也越容易，且得率越高。免疫组化与杂交组化⑶操作中应保持抗原分子的稳定性

如低温、严格pH、防止巯基氧化、在缓冲液中加入浓度1―3×10ˉ4M的EDTA（乙二胺四乙酸）以螯合除去重金属离子、防止蛋白酶的水解作用，等等。免疫组化与杂交组化5.抗原分离纯化的一般步骤

⑴增溶溶解

常用的方法有①渗透溶胞;②研磨;③绞切;④超声波;⑤挤压,等。⑵分离纯化

原则是“先粗后细，先简后繁，先盐析后层析”。⑶抗原纯度的鉴定方法有：琼脂双扩散、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、等电点聚焦电泳等。免疫组化与杂交组化6.常用的分离纯化方法计有：⑴差别溶解法其中最常用的是盐析法，又以中性盐硫酸铵最为常用。免疫组化与杂交组化⑵层析法其中有①离子交换层析（DEAE、CM、QAE等）；②选择性吸附层析，如羟基磷灰石可选择性地吸附中性和酸性蛋白而排除硷性蛋白；③分子筛层析（葡聚糖凝胶）；④亲和层析。⑶制备电泳法如PAGE制备电泳的分离条带切割等。免疫组化与杂交组化第二节抗体1.抗体的概念抗体（antibody）是机体通过体液免疫，由B淋巴细胞活化、增殖、分化的浆细胞合成并分泌与刺激抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。免疫组化与杂交组化抗体是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都具有抗体活性。两者在概念上并不完全等同，抗体是生物学和功能上的命名，而Ig是结构和化学本质上的概念。免疫组化与杂交组化2.抗体的基本结构①由于无抗体话性的Ig一般很少见，故抗体与Ig可认作为同义词。人类Ig有五类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，是由其分子结构中相应的重链（H链）—α.δ.ξ.γ和μ决定的。重链不同，Ig的类型就不同。轻链（L链）则在同一抗体分子（Ig）中是相同的，或为κ，或为λ。免疫组化与杂交组化若轻链不同表明该Ig和抗体是杂系、多克隆的；反之，轻链单一、同型则表示该Ig或抗体是单克隆的。②Ig单体的基本结构是由二条相同的轻链和二条相同的重链组成，各自链间（轻–重或重–重链）由二硫键（–S–S–）相连接，呈Y字构型（图解）免疫组化与杂交组化③Ig分子的氨基酸构型可分为可变区（N-端）和恒定区（C-端）两部份。⒊抗体的特性①Ig都是大分子蛋白质，既具有免疫原性，又具有能与相应抗原结合的抗体活性。

免疫组化与杂交组化②免疫原性的类属特异性是由Ig分子的重链和轻链恒定区特定的氨基酸序列所决定，而免疫原性的型属特异性（独特性或遗传性idiotype）则是由重链和轻链可变区特定的氨基酸序列所决定。抗体活性位点存在于Ig的可变区。免疫组化与杂交组化酶切所形成的片段――Fab或F（ab’）2只保持抗体活性，而无抗原活性；

Fc段主要由Ig两条不完整的重链的恒定区序列构成（-S-S-连接），只具抗原或免疫原活性，而无抗体活性。Ig结合补体或巨噬细胞的位点也存在于H-链的恒定区。免疫组化与杂交组化③Ig由B淋巴细胞衍生的浆细胞生成，主要以可溶性蛋白的形式存在于体液中。④Ig的主要生物学功能有：特异性结合抗原；活化补体；结合Fc受体等。⑤一个抗体（Ig）分子具有两个结合位点（两价）。免疫组化与杂交组化⒋抗体的种类⑴依来源分━①免疫抗体；②天然抗体；③自身抗体。⑵依反应分━①完全抗体；②不完全抗体。⑶依制剂或制备方法分——①多克隆抗体；②单克隆抗体；③基因工程抗体。免疫组化与杂交组化⒌抗体的制备

⑴抗血清（多克隆抗体——针对同一抗原多个抗原决定簇的抗体）的制备流程①免疫原（抗原或抗原+佐剂）准备。包括抗原的抽提、纯化和剂量核算（1mg/ml）；佐剂乳化；半抗原的处理等。免疫组化与杂交组化*佐剂是一种非特异免疫增强剂，可增强免疫反应，提高抗体效价，常用福氏佐剂由85%石蜡油和15%羊毛脂组成（半佐剂），如加卡介苗(100ml佐剂中含卡介苗200mg）则为完全佐剂（FCA）。一般首次注射时用其1/2体积与等量抗原进行乳化。免疫组化与杂交组化第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上，如能长时间保持园珠形而不散开，表示乳化达到要求。免疫组化与杂交组化*半抗原的处理半抗原只有免疫反应性而无免疫原性，半抗原必须与大分子载体结合才能激发机体产生抗体，常用的载体有血兰蛋白、卵白蛋白、牛血清白蛋白等。两者交联的方法和原理是：免疫组化与杂交组化利用-NH2，-COOH等功能基团，用戊二醛或碳化二亚胺（R′-N=C=N=R″）作为交联剂可将半抗原结合到载体上，其结合比例为5KD结合5—25个分子的小肽，交联完成后，还必须纯化与载体结合的半抗原。免疫组化与杂交组化

②动物的选择选择什么动物来免疫取决于所需抗血清的量，小白鼠只能提供1.0-1.5ml的血液，而山羊却能提供好几升；其次看你有多少抗原用于免疫动物，小白鼠不到50微克就足够，而山羊却要几毫克；免疫组化与杂交组化另外，还要考虑动物的品系，免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好，比如哺乳动物的比较保守的蛋白抗原可选择非哺乳动物（鸡）来制备抗体。常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，要求：年青，健壮，体重在2.5公斤左右，雄性）为最常用。免疫组化与杂交组化③免疫方法*途径：可以肌肉、静脉、皮内、皮下或腹腔注射，一般以皮内注射效果最好，多部位比单部位好，大动物一般不用腹腔注射，颗粒抗原和使用佐剂时不能I.V.。另外还可用淋巴结内注射来免疫，此法可大大减少抗原用量。免疫组化与杂交组化

*次数及间隔时间：次数一般为2-3次，首次注射后，10-15天再加强注射，剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂；至于间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长，豚鼠、大鼠为7-8天；兔子为10-15天；羊为14-28天；有时第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。免疫组化与杂交组化由于各动物之间的个体差异颇大，故应多免疫几个动物从中选择效价高的。*效价测定：常用的方法有“琼脂免疫双扩散、免疫电泳、ELISA、免疫组化”等方法。免疫组化与杂交组化*放血或定期抽血：兔子和羊是从颈动脉插管来放血，豚鼠和大鼠则可从心脏穿刺抽血，小鼠可采取眼球摘除来采血，鸡往往从腋动脉取血。血液凝固后，及时离心收集血清。加叠氮钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如牛血清白蛋白、甘油等。免疫组化与杂交组化

⑵单克隆抗体（针对单一抗原决定簇的抗体）的制备流程——一般分六个步骤：①免疫动物

绝大多数McAb是用小鼠的免疫活性细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合而建立的杂交瘤细胞所产生的。一般用腹腔注射的途径来免疫雄性BALB/c小鼠。免疫组化与杂交组化可溶性蛋白抗原的剂量，最低每次1μg，常用10-20μg/次，抗原充足时，可用到每次50μg，但不要超过每次200μg，总量不超过500μg；如抗原为细胞，每次用量为106个细胞，一般注射2-3次，取尾静脉血测效价，用效价高的小鼠作细胞融合。免疫组化与杂交组化②细胞融合常用聚乙二醇（PEG）作融合剂，PEG分子量为1000-3000，常用1500，其浓度为50%（W/V），如用离心法融合，则用30%的PEG。融合时，骨髓榴细胞与小鼠脾细胞的比例在1：4-1：12之间，免疫后的小鼠脾赃约含5×107-2×108个淋巴细胞，每次融合需骨髓瘤细胞2×107，融合前培养细胞的密度2×105为宜。免疫组化与杂交组化③选择培养常用HAT（次黄嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷）培养液来进行选择培养，其原理是HAT培养液抑制细胞正常途径的DNA合成，由于骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK），不能进行补救途径的DNA合成，在HAT培养液中正常途径DNA合成被抑制后就无法生存；免疫组化与杂交组化脾细胞虽含有这两种酶，在HAT培养液中能够生存，但没有致裂原和其它生长因子，脾细胞也不能分裂；只有脾细胞和骨髓瘤细胞融合后生成的杂交瘤细胞，既有这两种酶又能无限制生长，在HAT培养液中可顺利增殖。但经选择后生长的杂交榴可能是多克隆的，故必须进行克隆化。免疫组化与杂交组化④克隆化常用方法有软琼脂培养、有限稀释法、显微操作法。软琼脂培养就是将高度稀释的杂交瘤细胞培养在低浓度的琼脂中，单个细胞增生后可形成界限清楚的克隆，将单个克隆挑出进行再培养；免疫组化与杂交组化有限稀释法，即将含一定数量细胞的悬液，经多次倍比稀释，直至于96孔培养板的每个孔可能只含一个细胞，再进行培养，但一次操作常不能达到目的，一般要重复三次以上；显微镜法是在显微镜下用微吸管吸出单个细胞进行培养。免疫组化与杂交组化

检验克隆化是否成功，判断的方法是，当把一个产生所需抗体的阳性培养孔中的细胞经有限稀释移至于96孔板上生长时，若所有的孔都产生同样的抗体，说明克隆化已经完成；如部分孔分泌抗体，部分孔不分泌抗体，说明至少有两个不同的克隆同时存在，还需进一步克隆化。免疫组化与杂交组化⑤抗体的检测抗体检测的目的是筛选分泌所需抗体的单克隆杂交瘤株，检测的方法应事先建立。常用方法有ELASA法、放射免疫法和免疫组织化学法等。免疫组化与杂交组化⑥扩大培养有两种途径，一是体外培养，其优点是可大量生产，缺点是培养上清液中单抗含量低，仅5-40μg/ml，而且培养液中常含血清，纯化带来麻烦，而且长期培养污染不易控制；免疫组化与杂交组化二是体内方法，即在小鼠腹腔接种杂交瘤细胞，方法是先用石蜡油腹腔注射以刺激腹水产生，七天后，在腹腔中接种地107的细胞（细胞密度最好在2×107/ml）。体内方法的优点是单抗的浓度高，可达10mg/ml腹水，还可定期、持续抽取腹水，并不易污染，缺点是一旦小鼠死亡或患病，将一无所得。免疫组化与杂交组化

⑶基因工程抗体的特点和制备

基因工程抗体又称重组抗体，它是在充分认识Ig基因结构与功能基础上，应用DNA重组技术和蛋白质工程技术，按照客观需求在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的新型抗体分子。特点是既保留了天然免疫抗体的特异性和主要生物学活性，并去除或减少了无关结构。免疫组化与杂交组化6.抗体的纯化抗体所在的抗血清、腹水或培养液中，其它成分甚多，如要标记抗体时，必须提纯抗体，以免受杂蛋白的干扰。用不同的方法，可得到不同纯度的抗体：中性盐盐析法只能得到粗的IgG；离子交换层析法（DEAE-52）可得到较纯的IgG组分；免疫组化与杂交组化一般来说，抗体试剂的纯度可按以下制剂顺序逐步递增：全血清或腹水-γ球蛋白-IgG（粗提-细提）-特异性抗体（免疫纯IgG）-特异性抗体片段（Fab或F（ab´）2）。免疫组化与杂交组化葡萄球菌蛋白A（SPA）亲和层析法可得到更纯的IgG组分；而用抗原亲和层析柱进行亲和层析或用免疫沉淀法则可得到只针对该抗原的特异性IgG；如再将这特异性的IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行酶解，则可得到特异性抗体的Fab段，葡萄球菌蛋白A（SPA）亲和层析法可得到更纯的IgG组分；而用抗原亲和层析柱进行亲和层析或用免疫沉淀法则可得到只针对该抗原的特异性IgG；如再将这特异性的IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行酶解，则可得到特异性抗体的Fab片段。其中：免疫组化与杂交组化前者酶解产生二分子的Fab和一个完整的Fc段，后者酶解则产生一个F（ab′）2和Fc段的碎片。Fab的优点是分子量小，易渗透，而且也可进行标记，同时因无Fc段，可消除抗体与具有Fc受体的无关细胞的结合，从而大大减少假阳性。免疫组化与杂交组化

⑶基因工程抗体的特点和制备

基因工程抗体又称重组抗体，它是应用DNA重组技术和蛋白质工程技术制备的抗体，特点是：①无种系异源性，不会诱发宿主的免疫反应；②能直接制备人源性的抗体；免疫组化与杂交组化③不仅保持鼠源性单抗的特异性和亲和力等优点，而且其免疫作用更强；④应用范围加宽，使用途径增多，针对性更强，可广泛应用于免疫学研究和肿瘤的免疫基因治疗；⑤可作为建立“抗体库”的筛选试剂。免疫组化与杂交组化

*“

抗体库（antibodicbank）”是指通过将某种生物体的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，再利用不同的抗原与其反应，从而筛选出携带特异抗体基因的克隆，并由此而获得相应的高亲和力特异性抗体的一项基因工程技术。免疫组化与杂交组化第三节补体系统

⒈补体（complement）的概念

补体是一类存在于人和动物血清中具有酶活性、能与任何抗原抗体复合物发生结合反应的复合蛋白质。免疫组化与杂交组化⒉补体的性质补体由9个成分11种血清蛋白质组成，即C1┄C9及C1q、C1r和C1s。C1q可通过两种激活途径即经典激活途径和旁路激活途径，并按一定的补体激活顺序呈现连锁的酶促反应，最终成为一种化学介质或免疫效应物质参与机体的免疫病理过程。在免疫组化工作中，主要作为制备证明有无免疫复合物存在的桥连抗体示踪试剂。免疫组化与杂交组化第四节核酸⒈核酸是组成一切生物细胞生命活性物质的基本成分，由多个核苷酸分子连接而成，为此，核酸又叫多聚核苷酸。核酸是由碱基、戊糖和磷酸三种成分组成的大分子化合物，可分二大类：去氧核糖核酸（DNA）及核糖核酸（RNA）。

免疫组化与杂交组化⒉DNA

主要以双股链存在于细胞核内，其基本成分为碱基（A、G、T、C）、去氧戊（核）糖及磷酸。DNA的分子结构有三级：一级结构为长核苷酸单链；二级结构为双股核苷酸链组成的双螺旋模型；三级结构为超螺旋结构。免疫组化与杂交组化DNA的复制和转录均是在其双股链解聚成单链后，按照碱基互补规律（A-G，T-C，G-A，C-T或U-C，C-U）进行的。链间的氢键能量相对较低，体外高温即可解链，这是核酸杂交的理论基础。免疫组化与杂交组化⒊核糖核酸（RNA）

主要存在于细胞浆内，以单链的形式存在，由碱基（A、G、U、C）、戊糖和磷酸分子所组成，依其功能可分为四类：转运核糖核酸（tRNA）、信使核糖核酸（mRNA）、核蛋白体核糖核酸（rRNA）和小核核糖核酸（snRNA）。免疫组化与杂交组化①tRNA

在细胞内含量居中，分子量较小，半衰期24h以上，细胞含量居中，是遗传信息翻译成蛋白质合成语言（氨基酸）的执行者，主要通过其反密码子与mRNA的相应密码子碱基配对，从而对模板mRNA携带