桑黄菌丝液体培养及多糖提取工艺优化研究报告

第一篇桑黄菌丝培养及多糖提取工艺优化第1章绪论1.1前言桑黄是目前国际公认的抗肿瘤效果最好的大型真菌之一，巴西蘑菇即姬松茸与其疗效相近。由于用于一般化学疗法的抗癌剂的毒性强，对癌症患者正常体细胞也具有杀伤作用，而桑黄多糖则几乎没有毒性，其通过提高机体免疫能力，杀伤癌细胞，这是真菌多糖抗癌的一大优点。桑黄多糖能明显提高患者的免疫能力，当与一般的抗癌化学疗法并行使用时，可以进一步提高治疗效果。因此桑黄的研究以及开发利用越来越热[1]。桑黄最早在日本及韩国得到开发利用，现已开始小批量人工栽培。由于天然的桑黄数量非常稀少，难以成为稳定的工业产品来源，韩国一制药公司已率先开发出桑黄菌丝体培养法新技术，人工生产桑黄活性物质，并将其提取物用冻干法加工成粉末。由于抗癌效果显著，桑黄提取物干粉在韩国市场的售价高达每克2000多美元。日本一家专门从事生药加工的医药企业“津村株式会社”将人工培植的桑黄子实体加工成“破壁细胞超微粉末”，生产的“桑黄”(超微)粉末胶囊每瓶(288粒)售价高达3万日元。据统计，仅日、韩两国市场2002年各种桑黄剂的销售额合计已逾100亿日元。美国在本世纪初开始从日本进口桑黄制剂作为膳食补充剂在本土销售。我国吉林省延吉市凭借独有的地域优势，现已开发出复合桑黄口服液，主要销往日本及韩国，在当地也有一定的消费市场。根据目前所掌握的资料，由于外商需求量大，价格高，致使国内各产地进行掠夺性开采，子实体孢子无法大量形成。结果造成该资源在东北地区已经难觅踪影，西北也即将枯竭。再加上我国天然的桑黄数量本来就非常稀少，子实体的人工栽培尚处于起步阶段，所以要想形成稳定的医药工业产品来源，就必须充分挖掘桑黄的自然资源，深入开展桑黄的人工栽培；另外还要进行菌种的分离培养，利用现代生物技术进行深层发酵。同时，应进一步测定桑黄提取物中的有效成分，探索其与菌种、菌龄以及培养条件的关系，确定桑黄有效成分在提高人体免疫机能、疾病的预防和治疗等方面的作用机制，使桑黄能够早日应用于人类的医疗保健事业[2]。1.2简介桑黄1.2.1桑黄的名称及分类桑黄（Phellinusigniarius、Phellinuslinteus和Phellinusbaumi）别名：火木层孔菌、针裂蹄（裂蹄）和鲍氏层孔菌。桑黄菌是一种多年生珍稀药用真菌，属担子菌纲(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)，木层孔菌属(Phellinus)[3]。桑黄子实体中等至较大，无柄。菌盖半球形，剖面扁平至马蹄形，深烟色至黑色，有同心纹和环棱，初期有微细绒毛，后变光滑、稍龟裂，硬而木质化，2~12cm×3~21cm，厚1.5~10cm，边缘锐或钝，其下侧无子实层。菌肉深咖啡色、锈褐色或浅咖啡色，厚2~7mm。桑黄生于杨、柳、桦、桃等阔叶树的枯立木及立木上及树干上[4]。固因其着生树种不同，分为桑树桑黄、杨树桑黄和桦树桑黄等品种。其中，桑树桑黄子实体入药最佳。1.2.2桑黄的分布桑黄主要分布于中国、日本、菲律宾、澳大利亚、北美、中南美等地。在国内，桑黄分布于河北、山西、内蒙古、黑龙江、吉林、台湾、河南、广东、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆、四川、云南等地，即集中分布区在黑龙江省东部乌苏里江与兴凯湖之间，西北地区陕西与甘肃交界的“子午岭”自然保护区，国外主要在日本、韩国、俄罗斯等国家分布。1.3桑黄的研究进展1.3.1桑黄药用功能的研究进展（1）抗肿瘤作用桑黄的抗癌功能最早被日本学者等发现，研究表明桑黄野生子实体的提取物对小鼠肉瘤180的抑制率为96.7%。研究还表明具有抗癌作用的物质是桑黄子实体中的多糖。（2）提高免疫力Hwan-MookKIM等用P.linteus的菌丝体胞外多糖（EPS）进行免疫学实验，发现EPS不仅能够使T细胞增殖，而且对不同同类抗原的T细胞也有增殖作用，并且毒性T淋巴细胞的毒性在加桑黄胞外多糖（EPS）后大大增强。Yun-HeeShon等发现桑黄提取物可以诱导相解毒酶包括苯醌氧化还原酶（QR）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）的活性，并且提高了谷胱甘肽的水平。张万国[5]等对桑黄子实体提取物对人外周血单个核细胞（PMNCs）产生C-干扰素（IFN-C）的研究表明桑黄具有诱生IFN-C的能力，能显著增高小鼠的血清IFN-C水平，有利于其发挥调节机体免疫力，抑制肿瘤细胞增殖的作用。（3）抗突变作用Shon[6]等用桑黄提取物的抗突变实验中发现，提取物可有效的抑制诱变剂对沙门氏菌的诱变作用。（4）抗血管生成试验Yun-SeonSong等在小鸡胚胎绒膜尿囊膜（CAM）试验中，发现随桑黄提取物加量的增加抑制效果增加，说明提取物有较好的抗血管生成活性。（5）清除自由基的功能Yun-SeonSong等在清除自由基1-(2，6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙氨基)丙烷盐酸盐(DDPH)的试验和体外抑制脂类过氧化反应的试验中，发现提取物有较好的清除自由基DDPH活性。（6）抑制黄嘌呤氧化酶活性（治疗痛风）Yun-SeonSong等在黄嘌呤氧化酶抑制试验中，发现提取物能够完全抑制尿酸（尿酸盐微结晶沉积于关节而引起局部粒细胞浸润及炎症反应的生成），有效的抑制黄嘌呤氧化酶的活性。（7）肝纤维化抑制作用张万国等发现桑黄子实体提取物能显著降低血浆粘度和红细胞聚集指数，并且能提高肝损伤大鼠的蛋白质合成能力，显著降低血清氨基酸转移酶水平和胶原成分含量，使桑黄组肝细胞变性减轻，肝纤维增生减少。（8）抗脂质过氧化作用用CCl4诱导大鼠肝纤维化过程中，脂质过氧化是其主要的肝损伤机制。模型组大鼠血清活性氧显著升高，肝组织脂质过氧化产物MDA大量生成SOD活性受到明显抑制。桑黄虽然不能明显减少MDA的生成，但可以一定程度提高SOD活性，并且使血清中活性氧明显降低，表现出较好的清除氧自由基作用。（9）降血糖作用Kim[7]等用桑黄多糖喂用链脲霉素导致的糖尿病大鼠，结果显示：桑黄多糖能够降低血糖，同时减少总胆固醇、三酰甘油和天冬氨酸转氨酶。这个结果让我们相信桑黄多糖在治疗人类糖尿病上将有所作为。（10）抗肺炎作用Beon-SuJang[8]等用桑黄提取物预处理大鼠的实验中，发现桑黄提取物能够抑制肺炎大鼠炎症细胞包括嗜中性粒细胞的数量及白介素(IL)-1β的水平。这个结果表明：桑黄提取物在抑制人类急性肺炎方面可能会有很大的作用。1.3.2桑黄化学成分的研究进展研究发现桑黄的菌丝体多糖和胞外多糖的分子量及分子结构是不同的。（1）子实体中的化学成分有资料报道P.1igniarius的菌体内含落叶松蕈酸(菌丝体内不含该成分)、藜芦碱、蘑菇酸、间位二甲氧苯二甲酸等脂肪酸、麦角甾醇、过氧化物酶、氨基酸等成分，还有报道说P.1igniarius中木质纤维素的生物转化。莫顺燕等首次从P.1igniarius中分离得到5个黄酮和2个香豆素类化合物，分别为柚皮素(4′，5，7-三羟基二氢黄酮)、樱花亭(4′，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮)、二氢莰非素(4′，5，7-三羟基二氢黄酮醇)、7-甲氧基二氢莰非素(4′，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮醇)、北美圣草素(3′，4′，5，7-四羟基二氢黄酮醇)、香豆素(苯并吡喃-2-酮)及莨菪亭(7-羟基-6-甲氧基苯并吡喃-2-酮)；后来又分离得到两个新的二氢黄酮衍生物，分别为5，7，4′-三羟基-6-邻羟苄基二氢黄酮和5，7，4′-2三羟基-8-邻羟苄基二氢黄酮。Gi-YoungKim等在桑黄子实体中通过DEAE纤维素阴离子交换和凝胶层析提取得到一种酸性蛋白多糖，在琼脂糖凝胶CL-4B层析色谱分析中可以测得该多糖分子量在150kDa左右。其氨基酸种类主要有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸。用高压气相色谱仪测得该蛋白杂多糖中的糖链主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、树胶醛醣和木糖组成，其中碳链主链为己糖，戊糖为小部分构成侧链。用红外吸收光谱分析其官能团，并进行1H和13C核磁共振测定。得知该多糖同时存在α-糖苷键和β-糖苷键，多糖以B-(1→3)-D-葡萄糖为主链，以B-(1→6)-D-葡萄糖为侧链，是一种蛋白杂多糖。（2）菌丝体及发酵液中的化学成分据资料报道，液体培养P.1igniarius菌丝体中含有甾醇类物质、虫草酸等，其液体发酵培养菌丝体中经分析得到二丁基羟基甲苯、棕榈酸、9，12-十八碳二烯酸甲酯、二十碳烷、二十六碳烷5种化学物质。Lee等实验发现桑黄胞外多糖有四种组分，分子量范围为9400～15000，其单糖成分主要由甘露糖(3%～12%)、半乳糖(2%～10%)、葡萄糖(80%～95%)组成，该多糖还存在少量由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸组成的蛋白质。Hye-JinHwang等对桑黄胞外多糖的组分及分子结构作了进一步的研究，实验中用体积排除色谱(SEC)和多角度激光散射仪(MALLS)联用测定桑黄菌丝体胞外多糖(EPS)。实验中发现EPS中有三种组分(Fr-Ⅰ，Fr-Ⅱ和Fr-Ⅲ)。用气相色谱测定EPS组成得出EPS的三种组分为不含蛋白质部分的多糖，主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。根据洗脱体积对组分分布量的图中得出Fr-Ⅰ，Fr-Ⅱ和Fr-Ⅲ的分子量分别为433400(±7801)Da，31470(±283)Da和12950(±90)Da，并计算出各组分的分子量分布，得出Fr-Ⅰ为多分散组分，分子量分布跨度较大，Fr-Ⅱ和Fr-Ⅲ为单分散组分，分子量分布跨度较狭窄。根据每时刻的组分分布量可得出各组分分子的均方根半径(RMS，分子重心到分子边缘的距离)。根据各组分的RMS对分子量的图，可知Fr-Ⅰ分子结构为球形，Fr-Ⅱ分子结构为无规则线团形，Fr-Ⅲ无定形。1.3.3桑黄的人工培养由于自然条件和自身生长周期长等因素的限制，野生的桑黄菌数量极其稀少，而且难以采集，为进一步研究和开发好桑黄，很有必要进行人工培养方面的研究工作。（1）桑黄子实体的人工栽培野生桑黄多生于杨、柳、桦、桃等阔叶树的枯立木及立木树干上，多年生。我国大部分地区均有分布，但产量很少。国内外各大药厂最近几年纷纷投入巨资研制桑黄系列抗癌新药，对桑黄的需求越来越大，价格越来越高，人工栽培桑黄菌，已成为当务之急。目前桑黄人工栽培在国内刚刚起步，国内仅有一家研究所在吉林省延吉市已与外商合作，引进桑黄菌种，于1995年6月至1996年6月进行了菌种驯化及出菇试验。但只是进行小面积试验栽培，生长期在1.5~2年。国内外市场对桑黄的需求越来越大，野生桑黄资源逐渐枯竭，远远不能满足市场需求[10]。（2）桑黄多糖的固体培养固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。微生物贴附在营养基质表面生长，所以又称为表面培养。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。桑黄是丝状真菌，可进行生产规模的固体发酵。但大规模的固体发酵桑黄还未见报道。（3）桑黄多糖的液体培养液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。具体包括（1）浅层液体培养：在好氧微生物静止培养中常常将培养液装成浅层以增大培养液与空气的接触面积，使氧不至于成为限制因子；（2）利用摇床作三角瓶的液体振荡培养；（4）深层培养大规模液体培养都是采用更先进的深层培养。从深层液体培养器底部通入加压空气，并用气体分布器使空气以小气泡形式均匀喷出。由于天然的桑黄子实体很少，目前子实体的工栽培仅小批量获得成功，满足不了市场需求，能借助于菌丝体发酵来大量获得桑黄多糖，因此桑黄的深层发酵目前占主流地位。杨全采用液体发酵技术，人工培养获得了具有一定生物活性的菌丝体。而日本及韩国开发利用桑黄最早，并已开始人工栽培，批量生产。韩国通过试验获取了桑黄人工栽培的基本资料。韩国坡尔玛制药公司已率先开发出桑黄菌丝体培养法新技术，人工生产桑黄活性物质产品桑黄元。将桑黄的PL2、PL5等菌丝体放在特制培养罐中进行发酵，最后将其提取物用冻干法加工成粉末[11]。

第2章实验部分2.1桑黄菌丝液体培养工艺优化2.1.1桑黄培养条件的确定查阅相关文献，除碳源、氮源和pH值外，其它影响液体培养桑黄的发酵条件有无机盐、生长因子、培养温度、培养转速、培养基的装液量等，本实验具体设定的值如下。（1）无机盐无机盐是微生物生长所不可缺少的物质。其主要功能是：①构成细胞的组成成分；②作为酶的组成成分；③维持酶的活性；④调节渗透压，氢离子浓度和氧化还原电位；⑤作为某些自养菌的能源[12]。对于真菌来说，液体培养基中缺乏磷、硫、钾、镁，菌丝体生长发育不良，菌丝体产量低。其中磷是合成核酸、磷脂、一些重要的辅酶（NAD，NADP，辅酶A等）及高能磷酸化合物的重要原料。硫是蛋白质中某些氨基酸（如半胱氨酸和蛋氨酸）的组成成分，也是谷胱甘肽的组成成分。钾不参加细胞结构物质的组成，但它是细胞是重要的阳离子之一。它是许多酶的激活剂，也与原生质的胶体特性和细胞膜的透性有关。镁是一些酶（如已糖激酶，异柠檬酸脱氢酶，羧化酶等）的激活剂；镁还起到稳定核糖体、细胞膜和核酸的作用。但这四种元素对菌丝体生长作用大小不存在显著差异，同等重要。本实验选取常用的磷酸二氢钾和硫酸镁作为矿物质元素添加。少量微量元素往往也是与酶活性有关，或参与酶的组成，或是许多酶的调节因子。铁是过氧化氢酶、乳酸脱氢酶、细胞色素氧化酶的组成元素；钴参与维生素B12的组成；铜是多酚氧化锌酶和抗坏血酸氧化酶的成分；锌是肽酶和脱羧酶等的辅助因子等。在本实验中，用自来水配制成培养基，就可满足桑黄生长对铁、钴、铜、锌等微量元素的需要。所以，本实验的无机盐具体用量为：磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%，用自来水配制。（2）生长因子生长因子为某些微生物不能从普通的碳源、氮源合成，而需要另外少量加入来满足生长有机物质，包括氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱及其衍生物，有时也包括一些脂肪酸及其他膜成分。必须指出的是各种微生物所需的生长因子互不相同。真菌是维生素B1、维生素B2的天然缺陷型，必须外界添加才能生长良好。维生素B1、维生素B2对真菌的生长相当重要，他们以一种辅酶的形式存在，对菌丝的生长起促进的作用。而他们的需要量甚少。根据杨全等[13]人的试验结果，在液体培养基中，当维生素B1的用量20μg/100mL，维生素B2用量30μg/100mL时，菌丝体的产量最高。因此在本实验中维生素B1的用量20μg/100mL、维生素B2用量30μg/100mL。（3）培养温度温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。一方面，随着温度的升高，细胞内酶反应速度加快，代谢和生长也相应的加快；另一方面，随着温度进一步增高，生物活性物质（如蛋白质、核酸等）发生变性，细胞功能下降，甚至死亡。而且，温度是保证酶活性的重要条件。微生物的生长和产物合成均需在其各自适合的温度下进行[13]。温度对桑黄菌丝产量的影响较大，对液体培养而言，桑黄菌丝体生长的最适温度是30±1℃，所以本实验在30℃下培养桑黄。（4）转速在摇瓶培养过程中，转速对菌丝体的生长也有很大的影响。转速太低，菌球形成数量少，导致单个菌球长势过大，菌球中间出现中空状态，而且出现菌丝体自溶现象，另一方面培养基内的溶解氧减少，则桑黄菌菌丝球内部生长不足，结果菌丝体产量降低。转速过高，桑黄的菌丝短，而且培养基容易飞溅到棉塞上引起污染，对设备和电能都有损耗，造成不必要的人力、物力等的浪费。根据胡文彬等人报道，130r/min是培养桑黄的合适转速。本实验采用的转速是130r/min。（5）培养基装量培养基的装量不仅影响着摇瓶中溶解氧的含量，还会影响微生物生长的营养。装液量过多会影响菌丝体的好氧需求，从而影响菌丝的产量，而装液量过少，菌丝体所能吸收利用的营养不足而影响菌丝的产量。陈瑞蕊等的实验表明250mL的锥形瓶装70mL时的菌丝体产量最高。本次实验采用250mL的锥形瓶，其中培养基的装量为70mL。2.1.2测定方法（1）菌丝体干重的测定发酵液用布氏漏斗过滤，蒸馏水冲洗菌丝体3次，冲洗干净后，转入已知重量的培养皿中，置60℃烘箱烘干至恒重，称量。（2）胞外粗多糖重量的测定过滤后滤液浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的95％的酒精，4℃沉淀24h，离心后取沉淀，置60℃真空干燥箱至恒重，称重。（3）胞内粗多糖重量的测定取干燥的菌丝粉碎，置90℃热水中浸提2h，离心后取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的95％的酒精，4℃沉淀24h，离心后取沉淀，置60℃真空干燥箱至恒重，称重[14]。2.1.3实验材料（1）菌种本实验采用的是由长白山桑黄子实体分离纯化得到的桑黄菌种。（2）原料与药品土豆、玉米粉、可溶性淀粉、蛋白胨、黄豆粉、酵母浸出汁、葡萄糖、蔗糖、乳糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、维生素B1、维生素B2、硫酸铵，具体规格见表2.1-1。表2.1-1主要药品名称级别、规格生产厂家氢氧化钠AR，500g/瓶山东省化工研究院磷酸二氢钾AR，500g/瓶沈阳市新西试剂厂七水硫酸镁AR，500g/瓶天津市化学试剂一厂葡萄糖AR，500g/瓶天津市化学试剂三厂蔗糖AR，500g/瓶天津市化学试剂三厂乳糖AR，500g/瓶天津市化学试剂一厂可溶性淀粉AR，500g/瓶沈阳市新西试剂厂黄豆饼粉AR，500g/瓶天津市北方化玻购销中心蛋白胨AR，500g/瓶天津市大茂化学仪器供应站琼脂粉AR，500g/瓶天津市珠江卫生材料厂酵母浸出汁500g/瓶上海冠生园添加剂制品有限公司维生素B1市售东北制药总厂维生素B2市售吉林省辽源亚东药业股份有限公司土豆市售吉林玉米粉市售吉林（3）实验仪器灭菌锅、无菌操作台、恒温生化培养箱、电热鼓风干燥箱、旋转式摇床、试管、锥形瓶、培养皿等，具体见表2.1-2。表2.1-2主要仪器名称型号、规格生产厂家立式压力蒸汽灭菌锅LS-B50L上海华线医用核子仪器有限公司垂直净化工作台SP-DJ系列上海浦东物理光学仪器厂双人双面净化工作台SW-CJ-2F型苏州净化设备有限公司恒温生化培养箱LRH-250A广东省医疗器械厂电热鼓风干燥箱CS101-2AB重庆试验设备厂三角瓶250mL长春市玻璃仪器厂回转恒温调速摇瓶柜HYG-A余姚市金电仪表有限公司培养皿Φ9、15cm天津市玻璃仪器厂烧杯25mL-500mL天津市玻璃仪器厂量筒100、500mL天津市玻璃仪器厂2.1.4试验过程（1）活化菌种将原种在无菌条件下接到PDA固体培养基上进行活化。①配制PDA培养基（按表2.1-3的配方配制）。以配制500MlPDA为例：将土豆去皮、去芽眼，切成丝后，称100g置于1000mL搪瓷缸中，加入200～300mL自来水后，于电炉上煮沸30min。在此过程上，注意用玻璃棒搅拌以防止糊底。待土豆汁稍冷却后，用四层纱布过滤。取其滤液，并在滤液中加入1.5g磷酸二氢钾、0.75g硫酸镁、0.1g维生素B1、0.15g维生素B2，充分溶解后加自来水至500mL，加入5g琼脂粉，煮沸。注：本实验中所有的培养基都加入维生素B1和维生素B2，其配比分别为20μg/100mL和30μg/100mL。表2.1-3PDA固体培养基配方品名葡萄糖土豆KH2PO4MgSO4琼脂pH配比(g/100mL)2200.30.150.5自然②分装：煮沸后趁热分装于试管内，管口塞上棉塞并用牛皮纸包好。装入试管中的培养基量应为试管高度的1/5。注意，分装的时候，不要将培养基洒在试管口，棉塞上尤其不能沾有培养基，否则容易染菌。③灭菌：本实验中采用高压蒸气灭菌法灭菌。④制作斜面：趁热摆斜面，冷却凝固后即为斜面培养基。⑤在无菌的环境下接种：⑥将接完种的试管再次用牛皮纸包好，放入生化培养箱中，于32℃下培养。（2）固体扩大培养实验①按照表2.1-3配制PDA固体培养基：步骤如（1）中步骤。②分装：将培养基分装到250mL锥形瓶中，为了使灭菌的效果好，装入锥形瓶的培养基量最好不要超过培养基容积的一半。塞上棉塞，用牛皮纸包扎好。③灭菌：在压力为0.1MPa、温度为121℃的情况下灭菌20min，与此同时，将70个培养皿和接种针也灭菌。具体步骤见2.3.1中步骤3。④制作平板：在无菌操作台上将倒平板，冷却凝固。平板中倒入的培养基量要适当，培养基太少会导致所培养菌种营养不良，而太多则会造成营养的浪费。⑤接种：在火焰旁完成接种。⑥将接完种的培养皿用牛皮纸包好，放入生化培养箱中，于32℃下培养。（3）液体种子摇瓶培养①按照表2.1-4配制2L液体种子培养基，分装于250mL的锥形瓶中，每个装液量为70mL，在压力为0.1MPa、温度为121℃的情况下灭菌20min。表2.1-4液体种子培养基配方品名葡萄糖酵母膏蛋白胨KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)20.20.20.20.1②将灭好菌的物品放入无菌操作台中，并将酒精灯等用酒精棉擦拭后也放在无菌操作台上。③点燃酒精灯，在无菌操作台中的火焰旁接种。④接种完毕后，将锥形瓶放在摇床中培养，培养条件为：温度30℃、转速为130rpm。培养5天即得液体种子。（4）桑黄菌丝体生长曲线和多糖积累曲线实验①按照表2.1-5配制5LPDA液体培养基，分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为70mL。灭菌，接种，于温度30℃、转速为130rpm下培养，并开始计时。表2.1-5PDA液体培养基配方品名葡萄糖土豆KH2PO4MgSO4pH配比(g/100mL)2200.30.15自然②桑黄培养3天（即72小时）时，取5瓶未染菌的桑黄培养液。a.菌丝体干重的测定：发酵液用布氏漏斗过滤，蒸馏水冲洗菌丝体3次，冲洗干净后，转入已知重量的培养皿中，置60℃烘箱烘干至恒重，称量。根据公式2-1可得出菌丝体干重。m菌丝体＝〔m菌丝体2－m菌丝体1〕×1000÷〔70×5〕公式2-1m菌丝体1：盛菌丝体的培养皿质量，g；m菌丝体2：干燥后的菌丝体和培养皿质量，g；m菌丝体：1L培养液中菌丝体的干重，g。b.胞外粗多糖重量的测定：过滤后滤液浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的95%的酒精，4℃沉淀24h，离心后将沉淀转入已知重量的培养皿中，置60℃真空干燥箱至恒重，称重。根据公式2-2可得出胞外粗多糖重量。m胞外多糖＝〔m胞外多糖2－m胞外多糖1〕×1000÷〔70×5〕公式2-2m胞外多糖1：盛胞外多糖的培养皿质量，g；m胞外多糖2：干燥后的胞外多糖和培养皿质量，g；m胞外多糖：1L培养液中胞外多糖的质量，g。c.胞内粗多糖重量的测定：取干燥的菌丝粉碎，置90℃热水中浸提2h，离心后取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的95％的酒精，4℃沉淀24h，离心后将沉淀转入已知重量的培养皿中，置60℃真空干燥箱至恒重，称重。根据公式2-3可得出胞外粗多糖重量。m胞内多糖＝〔m胞内多糖2－m胞内多糖1〕×1000÷〔70×5〕公式2-3m胞内多糖1：盛胞内多糖的培养皿质量，g；m胞内多糖2：干燥后的胞内多糖和培养皿质量，g；m胞内多糖：1L培养液中胞内多糖的质量，g。③用同样的方法，每隔2天（48小时）测一次桑黄菌丝体的干重、胞外粗多糖及胞内粗多糖的质量。④连续测13天（312小时）。5.此实验要进行三次重复实验，菌丝体干重、胞内、外多糖质量均为三次实验的平均值。（5）液体培养基初始pH的筛选影响实验对初始pH分别为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5进行筛选。①按照表2-6，配制2LPDA液体培养基，然后平均分成五份，每份400mL，用稀盐酸或稀氢氧化钠分别调pH为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。②将各培养基分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为70mL。在压力为0.1MPa、温度为121℃的情况下灭菌20min，冷却后接种，并于温度30℃、转速为130rpm下在摇床中培养。③培养7天，按照2.3.4中步骤2的操作，计算出各种培养基中菌丝体的干重。④此实验要进行三次重复实验。桑黄菌丝体的干重为三次重复实验的平均值。（6）桑黄培养基碳源筛选实验对葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、小麦粉和玉米粉五种碳源进行筛选。①配制五种培养基，其碳源分别为葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉，配比都为3%，其余物质见表2.1-6。配制培养基时，首先要将碳源、蛋白胨以及各无机盐和维生素都溶于水中，最后将水定容至所需体积即可。表2.1-6不同碳源的培养基配方品名蛋白胨KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)10.30.15②将各培养基分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为70mL。在压力为0.1MPa、温度为121℃的情况下灭菌20min后冷却接种，于温度30℃、转速为130rpm下在摇床中培养。③培养7d，按照2.1.2中步骤操作，称出各种培养基中菌丝体的干重。④此实验进行三次重复实验。菌丝体干重为三次实验的平均值。（7）桑黄培养基氮源筛选实验对土豆、蛋白胨、黄豆饼粉、牛肉膏+酵母浸出汁和(NH4)2SO4进行筛选。①配制四种培养基，其氮源及配比分别为土豆（20%）、蛋白胨（1%）、黄豆饼粉（1%）、牛肉膏（0.8%）+酵母浸出汁（0.2%）和(NH4)2SO4（1%），其余物质见表2.1-7。配制培养基时，首先要将碳源、蛋白胨以及各无机盐和维生素都溶于水中，最后将水定容至所需体积即可。表2.1-7不同碳源的培养基配方品名玉米粉KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)30.30.15②将各培养基分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为70mL。灭菌后接种，于温度30℃、转速为130rpm下在摇床中培养。③培养7天，按照2.1.2中步骤操作，计算出各种培养基中菌丝体的干重。④此实验要进行三次重复实验。菌丝体干重为三次实验的平均值。（8）优化培养基验证实验由以上实验可知：最优碳源为玉米粉、最优氮源为黄豆饼粉、最适pH在5.5～6.5之间。利用优化得来的结果，按照表2.1-8配制培养基，分装，在压力为0.1MPa、温度为121℃的情况下灭菌20min，待冷却后接种，并在温度为30℃、转速为130r/min的条件下用摇床培养7天后，按照2.3.4中步骤操作测桑黄菌丝体的干重。重复三次实验，桑黄菌丝体干重为三次重复实验的平均值。与此同时，用PDA液体培养基作为对照组，并重复三次实验。表2.1-8优化培养基的配方品名玉米粉黄豆饼粉KH2PO4MgSO4维生素B1维生素B2pH配比(g/100mL)310.30.150.020.035.5～6.52.2多糖提取工艺优化2.2.1乙醇浓度对多糖收率的影响（1）培养液浓缩将培养液定量，用反渗透膜浓缩为原体积的1/2，浓缩压力0.5MPa。反渗透膜浓缩操作：接通电源，电源指示灯亮，打开工作泵，调节浓缩液调压阀将压力调节到0.5Mpa，开始工作。（2）向浓缩后的培养液加入原体积3倍的乙醇，产生灰白色沉淀，将上述提取液放入冷藏柜，在4℃下静置一夜。以发酵液中多糖含量为依据，改变乙醇的浓度，以确定最佳提取工艺。见表2.2-1表2.2-1改变乙醇浓度组别123乙醇浓度（%）758595（3）将上述提取液用离心机分离，3000r/min，离心10min，得到桑黄多糖，离心得到上清液（乙醇）回收。（4）将离心所得沉淀（桑黄多糖）用冷冻干燥机中干燥，得到的产品用精密电子天平称量，记录数据。2.2.2胞内多糖提取实验优化采用单因素实验法，选择影响提取多糖含量的3个主要因素煎煮时间、固液比和水煮次数，其他因素不变，称取等量的干菌丝体粉末，每个因素3个水平，以提取多糖的质量为标准，对比分析，从而优化得到菌丝体提取多糖的最佳工艺。步骤： （1）将分离出来的菌丝体放入恒温干燥机中，在60～65℃下干燥；恒温干燥机的操作：首先插上电源，打开开关，设定干燥的温度，干燥菌丝体需要60℃，同时设定温度的上限65（2）干燥结束，将菌丝体研磨成粉状，然后称取9份等量的菌丝体粉末4.0g，进行优化实验。分别按照表2.2-2、表2.2-3和表2.2-4的设计进行蒸煮实验。表2.2-2改变水煮时间组别123水煮时间（h）11.52表2.2-3改变水煮次数组别456水煮次数（次）123表2.2-4改变固液比组别789固液比1:7.51:101:12.5③将水煮液3000r/min离心10min，分离得到上清液。④将上述上清液用反渗透膜浓缩为原体积的1/2，操作同上。⑤下面用胞外多糖提取的方法提取菌丝体多糖并记录数据及结果。2.2.3超声波处理时间对多糖收率的影响本实验将除时间外的其他提取条件设置为料液比1:10，超声波提取温度60℃，功率400W。（1）称取5份桑黄菌丝体粉末，每份10g，置于烧杯中，编号1～5，加入蒸馏水并加热到60℃。（2）将上述5组混合物进行超声波处理，时间分别为10min、15min、20min、25min、30min。（3）水煮1h，冷却后（4℃）分别加入95%乙醇。（4）离心去除上清液，所的沉淀冷冻干燥并称量。

第3章试验数据及分析3.1桑黄菌丝液体培养工艺数据及分析3.1.1桑黄生长曲线与桑黄多糖积累曲线的绘制（1）实验记录表测定桑黄生长曲线时，桑黄菌丝体干重以及胞内外多糖随培养时间的记录表见表3-1。表3.1-1桑黄菌丝体干重、胞内、胞外多糖随培养时间的变化培养时间(d)35791113菌丝体干重(g/L)0.7522.1012.9873.0282.9022.886胞外多糖(g/L)0.1480.2780.4790.6420.6710.659胞内多糖(g/L)0.0310.0890.1320.1190.0810.072（2）桑黄生长曲线和多糖积累曲线①根据表3.1-1，绘制桑黄的生长曲线，如图3.1-1。图3.1-1桑黄菌和生长曲线②根据表3.1-1，绘制桑黄多糖积累曲线，如图3.1-2。胞内多糖胞外胞内多糖胞外多糖图3.1-2桑黄胞内、胞外多糖的积累曲线（3）结果分析从图3.1-1可以看出：液体培养的桑黄初期生长比较缓慢，从第3天开始，随着发酵进程的不断深入，菌丝体的生长越来越旺盛，到第7、8天，菌丝体产量达到最高峰，之后生长趋于稳定，到第10天，桑黄生物量有所下降。也就是说，液体培养的桑黄第1～2天为迟滞期，第3～7天为对数生长期，第8～10天为稳定期，从第11天开始进入衰亡期。因此，在接种时，尽量接培养了5～7天的桑黄菌种。结合图3-1和图3-2，可以看出胞内多糖的多少和菌丝体产量有着直接的关系，随着菌丝体量而变化，到第7天时的胞内多糖达到最大，以后则随着菌丝体的减少也相应的减少，但减少得更快一些，这主要是因为桑黄菌丝的自溶。胞外多糖也与菌丝体的量有密切的关系：培养前期，胞外多糖随菌丝体的增加而增加，第8天以后虽然菌丝体的重量已经稳定，并逐渐进入衰亡期，但胞外多糖依然是增加的，这主要是因为菌丝体内多糖的溶出，但这以后的增幅有限，而且不久开始下降。正是由于桑黄菌丝产量的大小可以反映多糖产量的高低，我们在优化培养基实验的过程中，可以用菌丝体的产量来评估多糖的产量。此外，为获取较高的菌丝及多糖产量，桑黄菌的发酵培养应为7天为宜。3.1.2培养基初始pH值的筛选（1）试验数据表3.1-2列出了不同初始pH值的培养基中桑黄菌丝体干重的质量。表3.1-2不同初始pH值对菌丝体产量的影响初始pH值4.55.56.57.58.5菌丝体干重(g/L)12.6642.9873.2201.8810.98622.5463.4253.2011.7900.99832.8503.6653.4161.9891.079平均值2.6873.3593.2791.8791.021不同初始pH值与菌丝体干重的曲线见图3-3。图3.1-3菌丝体随培养基初始pH值的变化曲线图（2）结果分析液体培养基作为菌丝体生活的外部环境，pH值的高低直接影响菌丝体的新陈代谢。图3.1-3可以看出，可知桑黄菌在弱酸性培养液中生长较好，而在碱性培养液中很难生长；最适的pH在5.5～6.5之间。在PDA培养基中，自然pH为5.9～6.1，固在配制PDA培养基时，自然pH即可。3.1.3培养基碳源的筛选（1）实验数据表中3.1-3列出了不同碳源的培养基中桑黄菌丝体干重的质量。表3.1-3不同碳源对菌丝体产量的影响碳源葡萄糖蔗糖乳糖可溶性淀粉玉米粉菌丝体产量(g/L)14.5434.1093.3494.3345.28324.6774.3973.3604.6005.09734.7434.4603.3914.5915.323平均值4.6544.3223.3674.5095.234不同碳源对菌丝体干重的影响图见图3.1-4。图3.1-4不同碳源对菌丝体干重的影响图上图中1、2、3、4、5分别代表葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉。（2）结果分析碳元素是真菌最重要的营养，它不仅是碳水化合物和蛋白质的基本组成元素，同时又是重要的能量来源。凡是可以作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，即称为碳源。可作为微生物营养的碳源物质种类极其广泛，从简单的无机物到复杂的有机含碳化合物。但不同的微生物利用碳源的能力不同。由表3.1-3可知，桑黄对碳的利用相当广泛，对单糖、寡糖、多糖均可利用。就实验的5种碳源来讲，玉米粉作为碳源时最有利于菌丝体的生长和多糖的合成，葡萄糖次之。而且从经济上考虑，玉米粉比较廉价易得，因此，玉米粉可作为桑黄菌丝工业化液体发酵的廉价碳源。3.1.4培养基氮源的筛选（1）试验数据表中3.1-4列出了不同氮源的培养基中桑黄菌丝体干重的质量。不同氮源对菌丝体干重的影响图见图3.1-5。表3.1-5不同氮源对菌丝体产量的影响氮源土豆蛋白胨黄豆饼粉牛肉膏+酵母浸出汁(NH4)2SO4菌丝体产量(g/L)13.8345.2835.7613.0121.86024.1805.0975.9213.2342.04634.5665.3236.0033.3872.097平均值4.1935.2345.8953.2112.001图3.1-5不同氮源对菌丝体干重的影响图上图中1、2、3、4、5分别代表土豆、蛋白胨、黄豆饼粉、牛肉膏+酵母浸出汁和(NH4)2SO4。（2）结果分析凡是构成微生物细胞物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质，称为氮源。细胞的干物质中氮含量仅次于碳和氧。氮素是真菌合成蛋白质、核酸的必要原料，对菌丝的生长发育至关重要。从表3.1-4可知，5种氮源中，蛋白胨和黄豆饼粉作为氮源对桑黄菌丝生长都很好，但从工业化角度来说，选黄豆饼粉作为氮源较实际，因为黄豆饼粉比较廉价而且易得。3.1.5验证培养基实验数据（1）试验数据优化培养基及对照组中桑黄菌丝体的产量见表3.1-5。表3.1-5优化培养基及其对照组中桑黄菌丝体的产量实验1实验2实验3平均值优化培养基菌丝体干重(g/L)6.8027.1227.3437.089对照组菌丝体干重(g/L)3.7454.1923.8163.981（2）结果分析根据表3.1-5，优化后的培养基菌丝干重比对照组菌丝干重超出1.78倍，足以说明优化培养基的高产的有效性。由于所用的实验材料均为农副产品，价格低廉、资源丰富，便于工业化。3.2多糖提取工艺数据及分析3.2.1乙醇浓度对多糖得率的影响（1）试验数据根据实验数据计算桑黄胞外多糖的得率：发酵液100ml，收率=多糖产量/100(ml)，如表3.2-1表3.2-1胞外多糖收率数据记录组别123乙醇浓度（%）758595多糖(g)1.98642.39772.4736单位收率(g/ml)0.0198640.0239770.024736（2）结果分析通过表3.2-1数据表明，95%浓度的乙醇溶液粗多糖的析出量最多，单位收率最高.85%及95%乙醇溶液的粗多糖的收率方差显著性较小，而对75%的乙醇溶液的粗多糖的收率方差显著性较大。说明使用85%的乙醇溶液进行粗多糖的收率与使用95%的乙醇溶液进行粗多糖的收率接近。在工业化生产过程中醇沉使用的乙醇需要回收利用，回收的乙醇达到85%浓度比达到95%浓度要节省动力消耗，为工业化生产上使用回收的乙醇提供了理论依据。3.2.2桑黄胞内多糖提取实验（1）试验数据根据实验数据计算桑黄包内多糖的产率：菌丝体4g，产率=多糖产量/4(g多糖/g菌丝体)表3.2-2蒸煮时间不同组别123蒸煮时间（h）11.52多糖产量(g)0.29940.32070.4355单位产量(g/g)0.074850.0801750.108875粗多糖提取率%7.4858.017510.8875表3.2-3蒸煮次数不同组别456蒸煮次数123多糖产量(g)0.37650.46530.4021单位产量(g/g)0.0941250.1163250.100525粗多糖提取率%9.412511.632510.0525表3.2-4固液比不同组别789加水量（倍）1:7.51:101:12.5多糖产量(g)0.36740.40530.4326单位产量(g/g)0.091850.1013250.10815粗多糖提取率%9.18510.132510.815（2）结果分析根据表3.2-2可知，随着水煮时间的延长，多糖的提取率也随之提高，并且差异比较显著。根据表3.2-3可知，每次水煮1h，随着水煮时间的延长，多糖的提取率也随之提高，并且差异比较显著。如果采用逆流式连续提取可能效果会更好，这在以后的工作中再详细地研究。根据表3.2-4可知，随着固液比的增大，多糖的提取率也随之提高，并且差异比较显著。但是固液比增大后期浓缩的能耗也会增大，在本试验的条件下采用1:10比例较好。3.2.3超声波处理时间对多糖收率的影响（1）试验数据在超声波处理时间的确定实验中，5组方案的桑黄多糖产率见表3.2-5：表3.2-5不同超声时间桑黄多糖产率组别超声处理时间（min）多糖（g）得率（%）1101.08110.82151.25512.553201.69316.934251.91319.135301.79217.93图3.2-1超声时间多桑黄多糖产率的影响（2）结果分析由图3.2-1可以看出，在超声处理时间小于20min时，桑黄多糖的产率随时间的延长而增加，在超声处理25min时，达到提取最大值，而后随超声时间延长，多糖提取率有所下降，这是由于超声处理数分钟，细胞破碎程度增大后，细胞内部的多糖物质开始向外扩散，多糖的提取率开始上升较快，达到最大值。但是超声波具有较强的机械剪切作用，长时间作用会使多糖结构被破坏，导致多糖提取率有所下降。另外，超声时间过长，细胞进一步破碎，杂质溶出，这也是多糖提取率有所下降的原因之一。因此确定本实验超声时间为25min。3.3桑黄菌丝生长形态在平板上观察桑黄菌丝体生长的形态，菌盖半球形，表面浅黄线至深，有同心纹和环棱，初期有微细绒毛，后变光滑，稍龟裂，硬而木质化，均边缘锐或钝，其下侧无子实层，剖面扁平至马蹄形，而幼嫩子实体呈黄色，边缘（生长轮）鲜黄色，成熟时菌肉颜色加深呈浅咖啡色至锈褐色。液体培养的桑黄主要是生长在液体中，聚集成球状，但仍有一部分菌丝为贴壁生长。

结论本项目分为三个部分，分别是菌丝培养、多糖提取、发酵设计，分别加以总结。4.1桑黄菌丝液体培养工艺优化（1）桑黄多糖产量与菌丝体产量有密切的关系，因此，在实验中可以用菌丝体产量的大小来评估多糖产量的高低。与此同时，我们可以得出：作为培养发酵菌种，培养5～7天是最佳的接种时间；若为微生物发酵，则根据所要的产物来确定发酵时间。在桑黄的液体培养实验中，若要求高产的菌丝体或胞内多糖，则发酵时间为7天，若要求得到胞外多糖，就要在桑黄菌丝体开始自溶后的1～2天停止发酵。（2）pH对桑黄培养的实验中表明：桑黄菌在弱酸性培养液中生长较好，而在碱性培养液中很难生长；最适的pH在5.5～6.5之间。（3）桑黄对糖类的利用很广泛，单糖、双糖以及多糖都可以利用。实验表明，桑黄对玉米粉的利用最佳，是我们筛选出来的最佳碳源。（4）桑黄菌丝对氮源的利用有较强的选择性，黄豆饼粉是五种供试氮源中最佳的氮源，而桑黄对硝态氮的利用率差。（6）将筛选出来的最佳碳源（玉米粉）、最佳氮源（豆饼粉碳）以及最适pH（5.5～6.5）用于实验，即优化的培养基为：3%玉米粉、1.2%黄豆饼粉、0.3%KH2PO4、0.15%MgSO4、20μg/100mL维生素B1和30μg/100mL维生素B2，pH为5.5～6.5；250mL的三角瓶中装液量为70mL，接种后于温度为30℃、转速为130r/min的条件下用摇床培养发酵时间为7天。利用优化的培养基培养桑黄，菌丝体干重达到7.089g/L，与PDA培养基相比，桑黄菌丝体产量提高了80.93%。4.2多糖提取工艺优化（1）95%浓度的乙醇溶液粗多糖的析出量最多，单位收率最高85%及95%乙醇溶液的粗多糖的收率方差显著性较小，而对75%的乙醇溶液的粗多糖的收率方差显著性较大。如果采用85%的乙醇溶液进行粗多糖的收率与使用95%的乙醇溶液进行粗多糖的收率接近。在工业化生产过程中醇沉使用的乙醇需要回收利用，回收的乙醇达到85%浓度比达到95%浓度要节省动力消耗，为多糖工业化生产上使用回收的乙醇提供了理论依据。（2）桑黄菌丝体采用水煎煮的方法来提取多糖，水提时间、水提次数、水提温度对多糖的提取有非常显著影响。经分析，桑黄菌丝体最佳的提取工艺为:蒸煮时间2h；蒸煮次数为2次；用水量为菌丝体的50倍；水提温度为100℃，得到最高胞内多糖产量为0.108g多糖/g菌丝体。（3）采用超声波预处理提取多糖可以减少水提时间，减少能耗。在超声波预处理25min时，达到提取最大值，而后随超声时间延长，多糖提取率有所下降，这是由于超声处理数分钟，细胞破碎程度增大后，细胞内部的多糖物质开始向外扩散，多糖的提取率开始上升较快，达到最大值。但是超声波具有较强的机械剪切作用，长时间作用会使多糖结构被破坏，导致多糖提取率有所下降。另外，超声时间过长，细胞进一步破碎，杂质溶出，这也是多糖提取率有所下降的原因之一。因此确定本实验超声时间为25min。由于桑黄菌的人工培养研究在国内刚刚起步，还有许多问题没有搞清，我们在实验中发现：桑黄菌的生长速度和生长量的差异较大，重现性不好；在培养过程中出现不同形态的菌丝，培养液颜色也会出现差异；这些说明桑黄菌的培养过程还有许多潜在的影响因素有待进一步研究，液体培养条件有待进一步优化。同时，桑黄是一种药用真菌，含有落叶松酸、脂肪酸、麦角甾醇等多种药用成分，而主要成分是多糖，因此有必要在保证菌丝高产的同时，增加液体发酵条件下菌丝体中多糖及其它成分的含量，提高药用价值和经济价值。总之，利用液体发酵技术，不仅能在短期内能获得大量的桑黄的菌丝体，而且周期短不受季节和环境的限制，为工业化生产菌丝体提供了依据，为进一步研究其发酵液的生物活性奠定了基础，且可以大幅度地降低桑黄作为新药开发的成本，采用液体发酵技术生产桑黄菌丝体将是一种重要的方法，具有广阔的前景。

第二篇桑黄菌丝发酵工艺放大设计第1章发酵过程的说明书工业发酵过程的研究，一般分为三种规模或三个阶段：1实验室规模，进行菌种的筛选和培养基的研究；2中试工厂规模，确定菌种培养的最佳操作条件；3工厂生产规模，进行大规模的生产，取得经济效益的过程。微生物培养过程的研究有两个主要作用：一是将科研所的的新方法应用于工业生产；二是通过试验找到更好的菌种、最佳的培养基和培养条件以及更好的设备去改进现行的生产。因此，一个工业微生物学家，首先就要在实验室对已筛出的心菌种（或改良的新菌株）进行开发研究，获得高产基因表达的最佳条件，在逐步转移到工厂生产中去，并能得到重显，也就是所说的新发酵工艺的放大；或者是，在现有生产中如何将实验室所得的培养数据转化（或放大）成生产工艺，达到工艺改革的目的。1.1工业发酵研究过程1.1.1实验室规模实验室规模进行基本的生物细胞（菌种）的筛选和培养基的研究，确定该生物发酵技术工艺的可行性，初步选择最优的培养基配方和培养条件。实验室内进行发酵培养，常用大小不同的小发酵罐，见下表。有的罐体是玻璃制作的，有的是不锈钢制作的。它们附有温度、pH值、溶氧、氧化还原电位、泡沫、和液位等参数的传感器，有的还有微型电子计算机，用于监测和自动控制发酵过程。因此，可以用这样的设备考察通气、温度、培养基组成、pH值发酵时间等参数对发酵过程和速率的影响，也可考查对产物产量的影响。一般1L发酵罐用于制备种子和适应性试验；4～28L发酵罐适用于基础考查实验；30～150L或更大的发酵罐适用于中间放大试验等。经过这样的试验，即可为生产放大提供试验数据。本设计就是以这样的思路，先进行实验室小试研究，找到最佳工艺，在以此为基础，经中试等进行逐步放大设计。最终，得到生产规模的最佳工艺条件和操作条件。表1.1-1发酵装置的类型1.摇瓶培养装置烧瓶大小每台震荡机500ml烧瓶的装置转速用途锥形大筛选和开发烧瓶小2.实验室—中间工厂设备搅拌工作容积搅拌器用途发酵罐大小（L）（直径；转速）小，研究试验中开发和制备大开发和提取注1）发酵装置的类型续表1.1.2中试规模中试是放大过程中重要的阶段：（1）参考摇瓶的结果，用中小型的发酵反应器进行生物培养或发酵，进一步确定最优的培养基配方和培养条件；（2）进行环境因素的最佳操作条件的研究，以掌握细胞生长动力学及产物生成动力学等特性；（3）试验影响溶氧速率的因素及其关系，发酵热及其降温控制条件等反应器设计参数，为反应器的工业化放大提供依据。大多用50～500L规模的发酵反应器进行试验。中试不是一次性的验证行为，而是一个从小批量验证到逐渐放大产品验证数量的循序渐进的过程。中试分为三个小阶段：（1）小量中试：主要针对硬件、结构、软件设计验证，初步验证可生产性，可能包含一次或者数次生产，直到无重大硬件、结构、软件问题为止；（2）放量中试：主要针对硬件、结构、软件、工艺、测试、维修、物料的验证，主要验证设计遗留问题以及批量可生产性验证，直到无重大可生产性问题为止；（3）小批量生产：主要对硬件、结构、软件、工艺、测试、维修、物料、质量以及相关生产文件进行全面验证，以可生产性验证为主；直到生产质量管理成本、合格率到达企业目标为止。1.1.3工厂生产规模工厂生产规模依据第一、二阶段取得的数据，进行生产规模的设计、试验、修正，直至在商业化生产中，再现甚至超过研究水平，向社会化、产业化提供技术和产品，获得社会和经济效益。工业化反应器20～2000m3不等，一般也需要逐级放大。本设计根据相关知识和经验，逐步放大到100m3，具体过程：5L→250L→5→50→100。放大倍数依次为：50倍、20倍、10倍、2倍。1.2生物反应器的比拟放大1.2.1放大的概念所谓生物反应过程的放大，就是指以实验室或中试反应器所取得的试验数据和规律为依据，设计、制造大规模的反应器，以实现工业规模。在反应器放大过程中，维持细胞生长与生物反应速率相似生产。生物发酵过程的复杂性远大于普通的化工过程，影响过程的参变数很多。即使对同一发酵生产使用不同规模的发酵罐中所进行的生物反应是相同的，但反应溶液的混合状态、传质与传热速率等不尽相同。因此，发酵过程的放大问题，仍存在很多问题。根据文献和相关资料表明，在工业化放大发酵过程，大多采用经验放大法。在生物反应器的反应系统中，存在3种不同类型的重要过程，即热力学过程、微观动力学过程和传递过程。传递过程受系统规模的影响很大。在发酵过程中游离分散状态的生物细胞的生长与代谢产物的生成是环境条件（如基质和生长因子的浓度、pH、温度等）的函数，这些是培养基的组成与环境因素，与反应器的规模基本无关。随着反应器规模的改变，系统内的动量传递过程就相应变化，尤其是搅拌器对生物细胞的搅拌剪切作用随反应器规模增大而增强，不仅影响细胞（团）的分散状态如絮凝、悬浮、结成团块等，而且严重时还会使细胞本身产生剪切损伤作用。因此传递过程是放大的核心问题。小型生物反应器往往表现为反应动力学模式即反应速度控制，而大型生物反应系统则受传递现象控制，其原因是小型反应装置的tc＞tf（或tD），而大型反应器的tc＜tf（或tD）。1.2.2生物反应器放大的目的任务应用理论分析和实验研究相结合的方法，总结生物反应系统的内在规律及影响因素，重点研究解决有关的质量传递、动量传递和热量传递问题，以便在反应器的放大过程中尽可能维持生物细胞的生长速率、代谢产物的生成速率，这就是生物反应器的放大目的。概括：以实验室或中试反应器的实验数据为依据，确定大规模反应器的结构尺寸和操作参数。1.2.3生物反应器放大的方法生物反应器放大的放大有许多种，主要有理论放大方法、半理论放大方法、因次分析法、经验放大方法。本设计根据设计方案采用经验放大法。经验法就是以试验为基础，按照主导因素相等或接近的原则进行放大的方法。表1.2-1通气发酵罐放大准则放大准则所占比例维持不变30%维持不变30%维持搅拌器叶端速度不变20%维持培养液溶氧浓度不变20%1.3机械搅拌通风发酵罐的比拟放大1.3.1放大计算程序（1）明确试验条件和结果，明确放大要求和放大依据；（2）计算试验条件下的P0、Pg、、V线；（3）按几何相似计算大罐的几何尺寸；（4）按经验选择通气空截流速（1.7—2m/min)，根据P0、Pg、关系式，按或P0/VL相等，求解大罐的转速N；（5）对于丝状菌丝体或对搅拌剪切敏感的生物反应，还要根据搅拌叶尖线速度调整N与Di，使和V线均能符合要求；（6）列出放大前后对照表。1.3.2以体积溶氧系数或相等为基准的放大法许多好氧发酵，特别是生物细胞浓度较高时耗氧很快，故溶氧速率是否能满足生物细胞的代谢与生长就成为生物发酵生产的限制性因素。生物发酵的耗氧速率可通过实验测定。实践证明，高好氧发酵应用等的原则进行反应器放大通常可获得良好结果。（1）主要参数及计算公式不通气的搅拌功率通气搅拌功率循环时间循环速率搅拌器泵送能力混合时间体积溶氧系数（2）放大步骤（l）计算试验罐的值：求搅拌雷诺准数→判断发酵系统状态→功率系数→求不通气时搅拌功率→通气时搅拌功率→根据空截面气速算出试验罐的溶氧系数（2）按几何相似原则确定试验罐的尺寸（3）确定大罐的通气流速，计算通风强度（4）按相等原则计算放大罐的搅拌转速和搅拌轴功率（5）将计算结果列成表放大过程框图见附录1尽管试验罐和放大罐的溶氧系数相同，其几何尺寸也相似，但经放大后，大罐的通气强度和搅拌转速均大大下降。1.2单体发酵罐设计1.2.1本设计的是一台100机械搅拌通风发酵罐，发酵生产桑黄菌丝。经查阅资料得知生产桑黄菌丝的最佳工艺条件是：摇瓶发酵最佳发酵条件为温度32.3℃，pH5.1，摇床转速176r/min，此时桑黄菌丝产量达到167.10mg/ml。得出最佳发酵培养基组成为初始糖蜜43.0%、玉米浆2.1%、KH2PO44.7g/L。发酵罐主要由罐体和冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置，轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。这次设计就是要对机械搅拌通风发酵罐的几何尺寸进行计算；考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料，确定罐体外形、罐体和封头的壁厚；根据发酵微生物产生的发酵热、发酵罐的装液量、冷却方式等进行冷却装置的设计、计算；根据上面的一系列计算选择适合的搅拌装置，传动装置，和人孔等一些附件的确定，完成整个装备图，完成这次设计。表1.2-1

发酵罐主要设计条件步骤项目及代号参数及结果备注1发酵菌种高渗假丝酵母RH-UV-L4-F9由工艺条件确定2工作压力0—0.1MPa由工艺条件确定3设计压力0.2—0.3MPa由工艺条件确定4发酵温度30由工艺条件确定5设计温度100~140由工艺条件确定6冷却方式蛇管冷却由工艺条件确定设计工程中发酵罐的罐体尺寸设计根据、、、量值不变进行计算，最终确定生产罐的尺寸大小。根据比拟放大法核算出生产罐的功率大小。发酵罐的附属设备设计中采用相应的标准进行设计计算，最终确定生产罐的冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置，轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。1.2.2罐体有灌顶、圆柱体与锥底3部分组成，其中：灌顶：为圆拱形，中央开孔用于可拆卸大直径法兰，以安装CO2与CIP管道及其连接件，灌顶还装有真空阀，安全阀与压力传感器。圆柱体：为发酵罐主体，发酵罐的高度主要决定于圆柱体的直径与径高比，由于大直径的光耐压低，考虑到使用钢板的厚度，一般直径＜6.0m。圆锥底：它的夹角多为60~90°，也有90~120°，但这多用于大直径的罐及大容量的罐；如夹角过小会使椎体部分很高。圆锥底的外壁一般安装冷却夹套、阀门与视镜、取样管阀、测温、测压的传感元件或温度计，CO2洗涤装置等。发酵罐尺寸设计根据试验罐的相应参数，采用几何相似进行设计。主要计算罐的直径DT、高度H、搅拌器涡轮直径D。桑黄菌丝发酵是好氧发酵，因此，在发酵过程中通气和搅拌是十分重要的影响因素。好氧发酵需要通入充沛的空气，以满足微生物需氧要求，因而空气量通入量越大，微生物获得氧有可能越多;其次培养液层高度越大，空气在培养基停留时间就有可能增加，有益于微生物利用空气中的氧;但是空气中氧是通过培养基传递给微生物，传递速率很大程度上取决气液相的传质面积，也就是说取决气泡大小和气泡的停留时间，气泡越小和越分散就使微生物可以越充沛获得氧气，但是强化气泡的粉碎单靠气体分布器的形式和结构是不够的，或者说效果是不明显的，只有通过发酵罐内的叶轮转动将气泡粉碎，才可获得最佳的发酵供氧条件。通过搅拌器的搅拌作用，使培养基在发酵罐内得到充分宏观混和，尽可能使微生物在罐内每一处均能得到充足氧气和培养基中的营养物质，此外良好的搅拌有利于微生物发酵过程产生的热量传递给冷却管和发酵罐的冷却内表面。这就是具有通气和搅拌的标准式发酵罐普遍使用在生化工程的原因。通气装置是指将无菌空气导入培养基中的装置，最简单的装置是一单孔管，单孔管的出口位于罐的中央，开口向下，以免培养基中的固体物质在开口处堆积和罐底固形物沉淀。近年来由于发酵罐的容积的增大，为了保证搅拌系统的稳定运行，在罐底设置了底轴承，因而占去了空气管的位置，为了使空气分布仍居中央，提出了将空气管在罐内分散成3-4个口，使其均匀分布在罐中央附近的设计方案。发酵罐内安装搅拌器首先用来分散气泡以得到尽可能高的传质系数KLa。此外还要使被搅拌的发酵液循环来增加气泡的平均停留时间，并在整个系统中均匀分布，阻止其聚并。近来发酵罐的搅拌系统多采用在罐底部安装一个用来分散空气的涡轮搅拌器，其上再安装一组轴流式搅拌器，用来循环培养介质、均匀分布气泡、加强热量传递和消除罐内上、下部之间含氧量梯度差。根据文献]，本设计所选择的搅拌器为径流涡轮/高效轴流搅拌器组合，其是20世纪80年代中期推出，其特点如下：罐底部装径向涡轮搅拌器，上部装轴向流搅拌器；总体流形（flowpattern）较好，无死角，无分层现象对“气泛”和混合时间有改善。将径向流涡轮搅拌器与高效轴向流搅拌叶组合起来是较佳选择。在分散气体作业的罐内，搅拌叶的数目取决于通气的液面高度和罐直径之比。搅拌器之间的距离一般为搅拌器直径的1.4～2.0倍，而搅拌叶之间的距离不得小于最小搅拌叶的直径。轴流式搅拌叶的直径约为径流式搅拌叶直径的1.3倍。径流式搅拌叶直径为罐直径的0.3～0.4倍，高效轴流搅拌叶直径为罐直径的0.4～0.65倍。空气分配器位于最底部的搅拌叶之下。罐内安装4～6块挡板；挡板宽度取罐径，一般以罐径较普遍，挡板离罐壁的距离为挡板宽度，这样可以减少死角。气-液反应器的流动型式决定分散的均匀度，并且影响气体的截留率(gasholdup)、传质速率和局部溶氧浓度。第二章发酵放大设计计算2.1设计计算条件2.1.1设计主要条件及技术参数（1）放大倍数：依次为50倍、20倍、10倍、2倍。（2）放大次数：进行四次逐级放大，并逐级优化（3）设计罐容积：250L、5、50、100（4）放大方法：以（或）为基准的放大方法（5）试验罐参数：表2.1-1试验罐基础参数项目数值试验罐参数罐直径（DT）145mm搅拌叶轮直径（D）60mm高径比H：DT2.07:1液深HL210mm装液量70%通气强度Q2.0vvm转速（N）800发酵液参数发酵液配比葡萄糖300g/L，酵母膏5g/L，脲1g/L，MgSO4·7H2O5g/L黏度密度（6）生产罐设计参数：表2.1-2生产罐设计要求参数步骤项目及代号参数及结果备注1发酵菌种高渗假丝酵母RH-UV-L4-F9由工艺条件确定2工作压力0~3MPa由工艺条件确定3设计压力0~3MPa由工艺条件确定4发酵温度32由工艺条件确定5设计温度100~140由工艺条件确定6冷却方式蛇管冷却由工艺条件确定2.2设计基础数据表2.2-1生产发酵罐参数项目数值罐体总体积（L）357工作体积（L）235罐体尺寸（含冷凝器）高度（mm）580580680通风流量（SLPM）0~50~100~10气体分布器r环形气体分布器（SUS316L）入口过滤器0.2空气过滤器空气压缩机空气压力冷凝器安装在顶盘上的水冷冷凝器搅拌范围50~1200rpm搅拌桨2只圆盘六弯叶涡轮，1个破泡浆传感器磁性霍耳传感器驱动顶部驱动功率为60W电机（可选100W）控制基于PID微处理器显示以10为增量的数字显示温度范围冷水温度+3~80（精度0.1）控制PID加热器200watt传感器RTD（Pt-100）pH设定范围pH2.0~12.0控制PID电极MettlerTolede或Hamiltonelectrode电源电源100V~240V/50~60Hz熔丝电流DC24V6A尺寸重量5表2.2-2水的物性数据物质分子式相对分子量比热容（）2040水H2O18.024.1834.174表2.2-3不同型号单壁罐参数商品号总体积（工作体积）内径（mm）内高（mm）电极长度（mm）最小工作体积（L）N搅拌桨直径（mm）D/P（%）H：DTDTHPPF1G2SL021.5L（1L）1101501200.360551.36:1PF1G2SL033L（2.5L）1302201200.560451.7:1PF1G2SL055L（3L）1453002251.560422.07:1PF1G2SL077L（5L）1703102253.272451.82:1PF1G2SL1010L（7L）190355320680421.87:12.3初步放大设计计算发酵放大过程中必须遵循的前提是在大型发酵设备和小型设备中的菌体所处的整个环境条件，包括化学因素（基质浓度、前体浓度等）和物理因素（温度、黏度、pH等）必须是完全相同的。放大倍数实际上就是发酵罐体积的增加倍数。2.3.1发酵液流形的确定发酵液的组成[9]为：葡萄糖300g/L，酵母膏5g/L，脲1g/L，MgSO4·7H2O5g/L，pH5，32℃，摇床转速800r/min，接种量10%。根据实验测得该发酵液满足牛顿粘性定律，属于牛顿流体。其中悬浮固体与悬浮液总体积之比为0.10。2.3.2发酵罐尺寸的计算根据几何相似法计算发酵生产罐的尺寸：试验罐的几何尺寸由表1-1得知：试验罐：四块垂直挡板：（为挡板宽度）按几何相似原则确定250L罐主尺寸：取有效容积70%，若忽略封底的容积，计算：则2.3.3通气量的计算（1）试验罐的通气量计算因为：式中：因为试验罐：vvm=2.0根据上式可以求得：（2）放大罐的通气量计算确定放大后通气流量Q：按几何相似原则放大设备，放大倍数越高，单位容积液体具有的罐的横截面积愈小，如果以vvm表示的通气流量相等，则放大罐的比原型罐的要显著增大。过大的将造成太多的泡沫盒带出液体。因此，在确定放大罐的通气流量Q时，必须考虑这个因素。通气量的放大过程中，有三种放大原则：（1）（2）（3）本设计采用第三种放大原则，此时，选用公式，来关联与其它量的关系时，则有：又因为：，并且，将此3式代入上式，得到：及将相应数据代入上式，可以计算出，因为设计压力与试验压力之比为1.5，所以：代入公式、、计算的：2.3.4搅拌器功率、转速的计算（1）试验罐的值计算根据搅拌器类型相等进行设计计算。试验罐采用两只圆盘六弯叶涡轮，因此设计罐同样采用两只圆盘六弯叶涡轮。通过试验，认为此菌株是高耗氧速率菌，体系对剪切速率不敏感。故按等进行设计计算。因为：所以应用和是等量的。Rushton关于单位传质面积上的传质速率的因次分析式[25]为：Calderbank关于通气搅拌罐内单位液体体积所具有的气-液两相界面的实验式[26]为：Richards将两式结合起来。在亚硫酸钠水溶液中，液相的黏度、密度、表面张力、气体溶质在液相中的扩散度、气泡最终上升速率可视为常量。又根据实验求的，得Richards关联式[27]：福田秀雄等人对上式进行修正，用60组实验数据进行实验验证，得福田秀雄修正式：式中——以氧分压为推动力的体积溶解氧系数，——通气时搅拌器轴功率，——装液体积，——搅拌转速，——空截面气速，——涡轮只数试验罐装有两只圆盘六弯叶涡轮，转速为所以，试验罐的亚硫酸盐氧化值法值可求。由图1-1得=4.7试验罐双涡轮搅拌器功率：图2.3-1几种搅拌桨的曲线本图是Rushton原图的简化，原图中共有14条曲线表2.3-2搅拌桨的曲线曲线号搅拌桨型号比例尺寸挡板数量/只1螺旋桨2.5~62~410.142圆盘平直叶涡轮2~72~40.7~1.60.143圆盘弯叶涡轮2~72~40.7~1.60.144圆盘箭叶涡轮2~72~40.7~1.60.14注：——分别为罐与涡轮桨叶直径（m）——罐内液面高度（m）——底部涡轮只罐底距离（m）——挡板宽度（m）同一搅拌器在相同的转速下输入的通气液体的功率比输入的不通气液体的较低。常见的解释就是通气时液体的重度降低，导致搅拌功率的降低。Michel等人根据实验资料得出Michel经验式。福田秀雄在Michel经验式的基础上，在100~40000L的五只设备对Michel经验式进行了校正。获得：根据五只发酵设备的尺寸大小，搅拌涡轮数位1~3只。福田秀雄将60组实验数据在双对数坐标纸标绘，得出未知参量A、m，得修正的Michel式为：式中——通气、不通气时搅拌器的轴功率，——搅拌器转速，——搅拌器直径，——通气流量，将试验罐的尺寸、转速等代入修正的Michel式，得：则试验罐的值计算结果如下：（2）放大罐功率及转速的计算按相等准则决定放大罐的搅拌器的转速及搅拌器的轴功率：按相等，则放大罐的将上式进行化简，得：放大罐的：是放大罐两只涡轮通气时的搅拌功率。一个方程式中有两个未知数，无法求解。故在从修正的Michel式列出的另一个算式，两式中的相等。所以：是两只涡轮不通气时的搅拌轴功率。又知：联立求解：解得：2.4逐步放大设计计算根据实际生产的过程，并参照谷氨酸发酵，通用式发酵罐尺寸，见下表[31]，进行经验优化过程。为保障桑黄菌丝发酵的顺利进行，使搅拌器的转速略大一些，其功率也略大一些。依据相同的计算原理，分别计算出5、50、100的发酵罐的搅拌器的转速和轴功率。在计算工程中同样对5、50、100的发酵罐进行实验验证和优化过程，保证桑黄菌丝的发酵以最高的转化率进行发酵。表2.4-1通用式发酵罐系列尺寸公称容积罐内径DT/mm搅拌桨直径D/mm搅拌转速r/min电动机功率/kW冷却方式50L3201124700.4夹套100L4001354000.4200L5001683600.6500L7002452651.11.09003152201.55.015005251605.510180063014513夹套或列管20230077012523列管续表1-7公称容积罐内径DT/mm搅拌桨直径D/mm搅拌转速r/min电动机功率/kW冷却方式503100105011055列管10040001350AA20050001700AA注：（1）本表以谷氨酸发酵罐为依据（采用两组六弯叶搅拌桨）。（2）100m3以上的发酵罐要考虑传到的方式，故有Δ的几项为列入。2.4.1二次放大计算根据上面计算250L发酵罐的搅拌器的转速和轴功率，实际中试生产过程中，参照表1-8，对易观测参量进行优化。发酵罐的尺寸按设计计算量。优化结果：表2.4-2250L发酵罐中试生产优化结果参量