分子生物学(化工1版)教案：第五章-分子生物学的研究方法

PAGEPAGE1第五章分子生物学的研究方法本单元或章节的教学目的与要求掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理、萨瑟恩DNA印迹杂交、诺塞恩RNA印迹杂交、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交、Westernblot的基本原理；掌握感受态菌的制备；了解ddNTP链终止法原理；掌握限制性内切酶和DNA聚合酶的原理；了解碱性磷酸酶和逆转录酶的作用；了解重要的大肠杆菌质粒载体、克隆载体的种类和植物的克隆载体辅助教学情况（多媒体课件、板书、绘图、标本、示教等）授课主要内容及学时分配5学时分子生物学从20世纪中叶开始得到高速发展，主要原因之一是现代分子生物学研究方法的进步，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子中，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，但我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与表达。5.1重组DNA技术发展史上的重大事件最近数十年来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有3大成就：(1)在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；(2)50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。自孟德尔以来，遗传学研究的有效手段就是让具有不同对应性状的两个个体进行交配。然后，根据子代出现的性状的分离比来确定染色体上基因的排列。在这类研究中，有时候出现这种情况：即原来推断在同一染色体上的基因，在子代中却显示在不同的染色休上。之所以出现这种情况，就是因为在杂交时，亲本的一部分染色体发生交换所致。这样一来，在后代会出现双亲所没有的基因的组合。这种现象称为遗传性的重组，或者基因的重组(图6．1)。第一个实验美国斯坦福大学的伯格(P.Berg)进行了第一个重组DNA实验。他是一位曾经在有关RNA和蛋白质合成的研究上做过出色贡献的生物化学家。自六十年代后期，人们对SV40病毒发生兴趣。所谓SV，即为simianvirus(猿猴病毒)之简称。顾名思义，是从猿猴分离的病毒，它能够使仓鼠、人、大鼠、兔子及猴类等许多动物的细胞发生癌变。其DNA很小，呈环状，易侵染培养的肾细胞。1972年，伯格等做了把SV40与其他的DNA片段相连接的实验。首先，分别用限制酶EcoRI切断想要连接的两种DNA。由于当时在市场上尚来出售EcoRI，所以，伯格是从在附近的加州大学正从事该酶研究的博耶(H.W.Boyer)那里得到转让的。所用的两种环状DNA都只存在一个EcoRI的切点。其次，用核酸外切酶进行处理，使两个末端失去单链结构，然后再加别的酶及核苷酸，分别使SV40一方产生一AAAAA一链，使λdvgal一方产生一TTTTT一那样的互补链。最后，为了使二者互相结合，用DNA聚合酶和DNA连接酶等进行处理。经过这样复杂的操作，形成了出两种DNA连接而成的环状的DNA(图6.2)。伯格并没有把如此制成的重组DNA(由于这是由两种不同的DNA连接而成的，所以也叫做杂种DNA)拿来感染大肠杆菌，并让它们在大肠杆菌中繁殖。他只是使用超速离心机等手段，确证了环状DNA(如图6.2所示)的产生。因此，虽然不能说伯格等的实验是首次基因转移的实际实验，但至少可以说这是制造重组DNA的第一次实验。伯格的这些成就受到高度的评价，遂与吉尔伯特(W.Gilbert)、桑格(F.Sanger)一起获得了1980年度的诺贝尔化学奖。与伯格同样在斯坦福大学工作的科恩(S.N．Cohen)等，开创了重组DNA实验的基础技术。他们选用了pSC101质粒作为基因的“搬运工”。根据1973年发表的研究，他们使用限制酶EcoRI切割pSC101的环状DNA，同时，也使用EcoRI切割拟转移的DNA，将两个样品混合起来，再使用DNA连接酶把二者连接起来。然后，将经过这种处理的质粒加入到含有钙盐的大肠杆菌的培养液中，先保持一段时间的低温，再加温数分钟，就可使质粒侵染大肠杆菌。由于pSCl01中含有抗四环素的基因，所以可以通过把细菌接种在含有四环素的培养基中观察细菌能否生存下来以判断细菌是否受到了质粒的侵染。这样，凡存活下来的细菌，也就是侵染了质粒的细菌，随着这种细菌的增殖，菌体内的质粒也增加了(图6.3)。科恩等使用的这种方法，是一种将基因从某种生物转移到另一种生物的基本方法，已成为基因工程的基础技术。翌年，即1974年，斯坦福大学和加州大学共同进行了令人感到奇妙的实验。那就是，将非洲爪蟾的DNA切断，把它连接到pSC101中，再转移到大肠杆菌里的实验(图6.4)。5.2DNA操作技术5.2.1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(po1yacrylamide)凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分部分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。同时也是现在通用的许多分子生物学研究方法，例如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制酶切分析以及限制酶切作图等的技术基础，因此受到了有关科学工作者的高度重视。1.基本原理凝胶电泳的原理比较简单。我们知道当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。从这种意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子(polyanions)。因此，当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。经过化学修饰的低熔点(LMP)的琼脂糖，在结构上比较脆弱，由此在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段的制备电泳。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关(表2-1)。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范因为0.2～50kb之间；而要分辨较小分子量的DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。例如，20％的聚丙烯酰胺凝胶的分辨力可达1～6bpDNA小片段，而要分离1000bp的DNA片段，则要用3％的聚丙烯酰胺的凝胶。再如，2％的琼脂糖凝胶可分辨小到300bp的双链DNA分子，而对于较大片段的DNA，则要用低浓度(0.3％～1.0％)的琼脂糖凝胶。在凝胶电泳中，加入溴化乙锭〔ethidiumbromide，简称EtBr〕染料对核酸分子染色之后，将电泳标本放置在紫外光下观察，便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA也可以被清晰地检测出来。溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的大小（或数量）成正比。3.脉冲电场凝胶电泳根据表2-1所列的数据可以看到，随着浓度的降低凝胶的孔径也就相应变大，故原则上讲可用低浓度的琼脂糖凝胶分离高分子量的DNA片段。但是实验表明，即便是浓度为0.1％～0.2％的琼脂糖凝胶，亦不能分离分子量大于750kb的DNA大分子，况且处于这种情况的凝胶十分脆弱，极难操作。然而我们知道，像大肠杆菌这样的原核生物，其染色体基因组DNA的长度超过4000kb，再如哺乳动物主要组织相容性基因座(locus)所占的DNA长度亦达数千kb。由此可见，运用普通的凝胶电泳技术显然是无法分离如此超大分子量的DNA分子的。1984年，D．C．Schwarts和C．R．Cantor发明的脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis，简称PFGE)技术，可以成功地用来分离整条染色体这样的超大分子量的DNA分子。在常规的琼脂糖凝胶电泳中，超过一定大小范围的所有的双链DNA分子，都是按相同的速率迁移的。这是因为它们在单向恒定电场的作用下，仅以“一端向前”(end-on)的方式游动穿过整个胶板。而在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向是随着所用的电场方向的周期性变化而不断改变的。在标准的PFGE中，头一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45o夹角，而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧亦成45o夹角(图2-3)。由于加压在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小、及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子能够随时地调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量较小的DNA分子相比，较大分子量的DNA分子需要更多的次数来更换其构型和方位，以使其可以按新的方向游动。因此，在琼脂搪介质中的迁移速率也就显得更慢一些，从而达到了分离超大分子量DNA分子的目的。已报道，应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功地分离到分子量高达107bp的DNA大分子。5.2.2核酸的分子杂交核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院(CavnegieInstituteofWashington)的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构，如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲绿关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA／DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系。而形成DNA／DNA或DNA／RNA杂种分子的这种能力，可以用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。这种核酸杂交技术，如同DNA快速分离法以及凝胶电泳技术一样，都是分子生物学中DNA分析方法的基础。在大多数的核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用被转移到滤漠上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸(DBM)和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。之所以采用滤膜进行核酸杂交，是因为它们易于操作，同时比脆弱的凝胶也容易保藏。一般来说，在核酸杂交中究竞选用哪一种滤膜，这是由核酸的特殊性、分子大小和在杂交过程中所涉及的步骤的多寡、以及敏感性等参数来决定的。在早期。是比较喜欢选用硝酸纤维素滤膜，但由于它不能滞留小于150bp的DNA片段，又不能同RNA结合，所以在使用上受到一定的限制。1980年G．E．Smith等人发现，应用1mol/L的醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液，改善了硝酸纤维素滤膜对小片段DNA的滞留能力。随后P.S.Thomas(1983)报道，经广泛变性之后的RNA，也可十分容易地转移到硝酸纤维素滤膜上去。J.C.Alwine等人(1977、1979)应用DBM滤纸转移和共价结合DNA和RNA。不久之后便有人发现，小片段DNA能够转移到这种滤纸上。其办法是在通过毛细管作用或电导作用之前，小片段的DNA先在低浓度（＜4％）的聚丙烯酰胺凝胶上作分部分离。表2-2列举了若干种用于核酸转移和杂交的滤膜的主要性能。此种通常是在尼龙滤膜或硝酸纤维素滤膜上进行的核酸分子杂交实验，包括如下两个不同的步骤：第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleicacidblotting)转移，主要的有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colonyandplaqueblotting)；第二是将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。1.萨瑟恩DNA印迹杂交综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可以准确地绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因的序列测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类的数据资料则要应用萨瑟恩印迹杂交技术(Southernblotting)才能获得。根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫做SouthernDNA印迹转移技术。已经观察到，如果应用硝酸纤维素滤膜进行Southern印迹转移，那么只要当滤膜结合上DNA两条互补链之一，便能够成功地发生核酸的杂交作用。具体步骤是将作了DNA电泳分离的琼脂糖凝胶，经过碱变性等预处理之后平铺在已用电泳缓冲液饱和了的两张滤纸上，在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜，接着加一叠干滤纸，最后再压上一重物。这样由于干滤纸的吸引作用，凝胶中的单链DNA便随着电泳缓冲液一起转移。这些DNA分子一旦同硝酸纤维素滤膜接触，就会牢牢地缚结在它的上面，而且是严格地按照它们在凝胶中的谱带模式，原祥地被吸印到滤膜上的。在80℃下烘烤1～2小时，DNA片段就会稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。另一种办法是应用紫外线交联法固定DNA。其基本原理是，DNA分子上的一小部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面上的带正电荷的氨基基团之间形成交联键(crosslinks)。然后将此滤膜移放在加有放射性同位素标记探针的溶液中进行核酸杂交。这些探针是同被吸印的DNA序列互补的RNA或单链DNA，一旦同滤膜上的单链DNA杂交之后，就很难再解链。因此，可以用漂洗法去掉游离的没有杂交上的探针分子。用X光底片曝光后所得的放射自显影图片(图2-4)，同溴化乙锭染色的凝胶谱带作对照比较，便可鉴定出究竟哪一条限制片段是同探针的核苷酸序列同源的。萨瑟恩印迹杂交方法十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来，它几乎可以同时用于构建出DNA分子的酶切图谱和遗传图，在分子生物学及基因克隆实验中的应用极为普遍。早期是使用硝酸纤维素滤膜进行Southern印迹转移，但它的主要缺点是容易碎裂，因而近年来常被尼龙滤膜所取代。后者不仅具有很强的抗张性易于操作，而且亦有更大的同核酸分子的结合能力。然而，为了消除尼龙膜所带的正电荷，需要延长电泳凝胶的预处理时间。值得指出的是，在使用尼龙膜的情况下，DNA是以天然的形式，而不是变性的形式，从电泳凝胶中转移到膜上的。因此，DNA是在尼龙膜上进行原位碱变性的。2．诺塞恩RNA印迹杂交关于印迹杂交技术的应用，最初只局限于DNA的转移杂交，后来逐步扩展到包括RNA和蛋白质转移杂交在内的更加广泛的领域。由于RNA分子不能够同硝酸纤维素滤膜结合，所以萨瑟恩技术不能直接地应用于RNA的吸印转移。1979年，J.C.Alwine等人发展出了一种新的方法，其基本步骤是将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其它化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起。由此可见，这种方法同萨瑟恩的DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺塞恩RNA吸印杂交技术(Norhernblotting)。而将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术(Westernblotting)。在诺塞恩RNA吸印杂交中，RNA分子同活性滤纸共价结合得十分牢固。所以，在杂种核酸分子呈不稳定状态的温度条件下漂洗杂交滤纸，便可以将上次杂交反应中已同RNA分子同源结合的放射性探针分子洗脱掉。因此，这类吸印转移的滤纸，是可以反复使用的。应当指出，活性滤纸不光能够同RNA分子牢固地结合，而目也能够相当有效地结合变性的DNA分子。事实上，叠氮化的活性滤纸，比硝酸纤维素滤膜能够更加有效地转移并结合小片段的DNA。l980年，P.S.Thomas发现，在适当的实验条件下，硝酸纤维素滤膜也能够直接用来转移RNA分子。之后，人们还发展出可以用来转移RNA的适用的尼龙滤膜。因为这种形式的诺塞恩吸印技术，已不需要预先制备活性滤纸，显得简单省事，所以得到广泛的采用。现在关于诺塞恩吸印转移技术更全面的定义应该是：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。3．斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交(dotblotting)和狭线印迹杂交(slotblotting)，是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种类似的快速检测特异核酸(DNA或RNA)分子的核酸杂交技术。它们的基本原理和操作步骤是相同的，都是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后再按如同Southern或Northern印迹杂交一样的方式同核酸探针分子进行杂交。由于在实验的加样过程中，使用了特殊设计的加样装置，使众多待测的核酸样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。因此，人们通常又称此两种核酸杂交方法分别为斑点印迹杂交和狭线印迹杂交。无论是斑点印迹杂交还是狭线印迹杂交，都更适用于核酸样品的定量检测，而不是定性检测。例如，在实验中补加有已知其浓度的靶核酸序列作为对照样品的情况下，此类技术便可用来检测核酸混合物中某种特殊DNA(或RNA)序列的相对含量；同时使用光密度测定法亦可对核酸斑点印迹或狭线印迹的相应杂交信号作定量分析。已有许多研究者，都使用RNA斑点印迹杂交技术，测定目的基因在某种特定组织或培养细胞中的相对表达强度。实践表明，它们在核酸定量测定中有着相当广泛的用途。4．菌落(或噬菌斑)杂交1975年，M．Grunstein和D．Hogness根据检测重组体DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern吸印技术作了一些修改，发展出了一种菌落杂交技术。之后，在1977年，W．D．Benton和R．W．DNAvis又发展出了与此类似的筛选含有克隆DNA的噬菌斑的杂交技术。这类技术是把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上，使溶菌变性的DNA同滤膜原位结合。这些带有DNA印迹的滤膜烤干后，再与放射性同位素标记的特异性DNA或RNA探针杂交。漂洗除去未杂交的探针，同X光底片一道曝光。根据放射自显影所揭示的同探针序列具有同源性的DNA的印迹位置，对照原来的平板，便可以从中挑选出含有插入序列的菌落或噬菌斑(图2-6)。菌落杂交或噬菌斑杂交有时也叫做原位杂交(insituhybridization)，因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。要从由成千上万大量的菌落或噬菌斑组成的真核基因组克隆库中，鉴定出含有期望的重组体分子的苗落或噬菌斑，菌落原位杂交技术有着特殊的应用价值。这样的实验中往往要检测大量的菌落或噬菌斑，可以想象其工作量是相当大的。•

WesternblotWesternblot是转移蛋白质到硝酸纤维薄膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质的技术。蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳并染色，然后，以电泳法或非电泳法进行蛋白质带的转移。电泳法的转移效率和转移速度都比较高，—般多用电泳法。转膜装置按如下顺序进行装配：电极，一层吸收泡沫，三层滤纸，电泳后的凝胶，硝酸纤维薄膜，三层滤纸，一层吸收泡沫，电极。安装前，每层材料均需用缓冲液浸透，并排除每层材料间的气泡。所有材料放在磁盘中，加转移缓冲液。如电冰凝胶为SDS，则转移缓冲液为：20mmol／LTri碱，150mmol／L甘氨酸和20％甲醇。6～8V／cm，转移16～22小时。如果凝胶中含尿素无SDS，仅用0.7％醋酸作转移缓冲液即可，6～8V／cm，时间3～4小时(图8.8)。5.2.3细菌转化所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的菌株叫作受体菌株。细菌转化常用低渗的氯化钙溶液进行。转化反应⑴感受态菌的制备（DH5α、JM109）整个过程均应在无菌条件下进行，动作要温柔、准确，严格按无菌操作规程进行。•

将-70℃冻存的JM109菌、DH5α菌在LB琼脂培养基平板上划线，37℃培养16~20小时。•

从平板中取出一环新鲜的菌落（2~3mm），移至含2ml（或4~5ml）LB培养基的15ml试管中，37℃振荡培养过夜，约16~20小时。注意，LB中无Amp+，否则JM109菌或DH5α菌不能生长。•

取上述1ml菌液，加入到100mlLB液体培养基中（接菌浓度为1%），37℃，摇床（225r/min），强烈振荡培养2~3小时，测定A600值为0.4~0.6时停止，使细胞的浓度达到5×107个/ml，此时细胞为对数生长期。注意，测定A600值取菌液时，要在无菌室超净工作台上进行，避免细菌污染。•

无菌下，将菌液转移至无菌的、一次性使用的、用冰预冷的50ml离心管中，将培养物于冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。•

4000r/min，4℃，离心10min，回收沉淀。•

倒出上清液，将管倒置1min（无菌干燥的滤纸上），以使最后残留的痕量培养物流尽。•

使用10ml用冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬每份细胞，放置于冰上20~30min。•

4000r/min，4℃，离心10min，回收细胞。•

倒出上清液，将管倒置1min（无菌干燥的滤纸上），以使最后残留的痕量培养物流尽。每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬每份细胞。若不立即使用，可采用下述方法冷冻保存该感受态菌。取0.5ml无菌的、一次性使用的EP管，每管内加入100μl感受态菌，再在每管内加入100μl30~50%的甘油（甘油需湿热灭菌），混匀后，放置于冰浴中15min，再放到-70℃冰箱中冻存备用，当需要时将其从冰箱中取出，把管握在手心，使细胞快速融化，细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10min。⑵转化反应

①从上述新制备的或冻存的感受态菌中，取6个EP管，四管加入已连接好的重组DNA5~10μl（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰水中放置30min。另两个管不加重组DNA。②将管放在42℃水浴中90sec，不要摇动EP管。③快速将管转至冰浴中2min，使细胞冷却。④每份EP管加入350μlLB液体培养基，用水浴或温箱将培养基加温至37℃，或直接放在摇床上，225r/min，37℃，温育1~2小时，使细胞复苏。⑤涂平板（用LB固体培养基）⑥将平板涂好后半开盖，在超净台上吹风，直至液体被吸收。⑦倒置平板，37℃，温育12~16小时后即可个观察到有无重组子菌落。⑧若采用蓝白筛选，则更利于直接观察到有无重组子菌落，方法如下：T-载体（包括PUC系列）含有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有β-半乳糖苷基因（LacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息（N端）。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。这种载体适用于编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种互补现象叫作α互补。载体与宿主结合后可产生有活性的β-半乳糖苷酶，在底物中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）存在下，形成蓝色菌落，而插入有目的基因的重组子菌落无此酶活性，故呈白色。所以选重组子菌落时挑选白色菌落。培养基中涂X-gal方法如下：A.在事先准备好的含相应抗生素的LB固体培养基上（内含100IU/ml的Amp+），已凉干。B.X-gal（20mg/ml）40μl与IPTG（200mg/ml）4μl,在0.5mlEP管中混合均匀，用Tip头吸上，在培养皿几个位点上滴几滴，用涂布棒将X-gal与IPTG涂均匀，应从中间开始向外缘涂布。C.涂均匀后培养皿半开盖，关掉超净台上的紫外灯打开风机，20min左右直至液体被吸收。D.将培养皿放在温箱中，37℃，1小时。E.此平板即可用于上述转化反应，挑选重组子菌落。若转化完成后，阴阳对照正常，可进行下一步的鉴定工作。5.2.4核苷酸序列分析核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项难度较大而重要的技术。1963年，Sanger和Thompson第一次完成了胰岛素51个氨基酸的顺序测定。1965年Ho11ey用经典法测定了酵母tRNAala的75个核苷酸顺序。同年，Sanger提出了指纹图谱法测定小RNA序列。1975年，Sanger又提出了测定DNA序列的加减法，经过2年的努力，排出了ΦXl74的5375bp序列。1977年，Maxam和Gilbert发展了化学直读法；1978年，Fiers，就用此法测出了SV40的5224bp序列。Sanger于l977年又创立了测定DNA序列的双脱氧核苷酸(ddNTP)链终止法；不久，Messing等组建了一系列的噬菌体M13载体系统，为ddNTP链终止法提供了天然模板和万能引物。因此，Messing的M13克隆系统与Sanger的ddNTP顺序法相结合，成为较完整的测序系统，使DNA序列的测定工作提高到了一个崭新的水平。DNA序列测定的ddNTP链终止法1ddNTP链终止法原理DNA的复制有4个基本条件，即：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（DNATP，dCTP，dGTP，dTTP）。DNA聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。当在低温下进行反应时，新链的合成是不同步的，用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以测出各种不同长度的DNA片段。DNA的两个核苷酸之间是通过3',5'磷酸二酯键连接的。Sanger指出，如果能找到一种特殊核苷酸，其5'末端是正常的，在合成中，它能加到正常核苷酸的末端；但其3'-OH位点由于脱氧或取代，下一个核苷酸不能通过5'磷酸与之形成3',5'磷酸二酯键，使DNA链的延伸被终止在这个不正常的核苷酸处。这类核苷酸称链终止剂(chain-terminator)。

链终止剂被找到了，如2'，3'-双脱氧核苷5'-三磷酸(ddNTP)和3'-阿拉伯糖脱氧核苷酸。DNA顺序测定中常用的终止剂是ddNTP。在DNA合成时，链终止剂以其正常的5'末端掺入生长的DNA链，一经掺入，由于3'位无羟基存在，链的进一步延伸被终止(图9.1)。从图9.1看出，当加双脱氧TTP(ddT)到4种核苷酸的正常混合物中时，在与模板的A相对应处，DNA聚合酶催化一个T加入。如果ddT被利用，则下一个核苷酸不能加上来；如果掺入的是dT，生长链仍可继续延伸到下一个T的位置。在这里，聚合酶又面临着两种选择：掺入ddT或掺入dT，因而，各种不同长度的DNA链就可被合成出来，并且它们的3'末端都被ddT终止。其他三种核苷酸链终止剂如dDNA，ddC，ddG也能以同样的方式终止新生的DNA链。所以，如果用相同的4组引物-模板混合物，每一组加4种dNTP，其中1种用32P标记，加1种ddNTP。每组将产生以一种特异性的ddNTP为末端的不同长度的核苷酸链。用PAGE电泳分离，即可读出被测定的DNA的全部顺序。2DNA链终止法测定系统有几种系统可用于ddNTP链终止法的序列测定，如M13／ddNTP单链测定系统，pUC／pBluescript双链测定系统，PCR银染测定系统等。其中M13／ddNTP单链测定系统是最基本、最主要的程序，掌握了M13单链测定系统，对其他系统的理解也就容易了。(1)M13／ddNTP法单链测定系统①M13噬菌体载体M13载体系统是Messing等1977年构建的，可以说是专门为Sanger的ddNTP链终止序列测定配套的载体，这个系统的载体有如下特点。M13系列中的载体都是成对的，如M13mp8和9，M13mpl0和11，M13mpl8和19等等。成对的M13载体有同样的Polylinker，即限制位点的数目和排列顺序相同，但方向相反。M13载体系列的编号与Polylinker的长短和限制位点数有关，编号从小到大，则Polylinker愈长，所含限制位点愈多，用途愈广。相对应的载体在序列测定中的用途不同，双号载体(M13mp8，M13mp10，M13mp18)用于克隆负链，单号载体(M13mp9，M13mp11，M13mp19)用于克隆正链。由于它们的引物位点区是固定的，所以前者用于测定DNA的正链，后者用于测定DNA的负链。②外源DNA片段在M13载体中的克隆Messing和Viera(1982)构建的一对新的M13mp8和M13mp9载体是专门用于定向克隆战略，以便测定DNA全序列的，它们具有同样的限制性酶切位点和顺序，但方向正好相反，即EcoRI，XmaI，BamHI，HindII，SalI，PstI，HindIII。那么同一个外源片段如何与成对的M13载体DNA连接?连接方法是比较简单的，但理解是不容易的。M13克隆一般均需采用双酶消化——定向克隆法，若用BamHI和SalI消化待测DNA，得到不同长度的小片段，大部分片段都有BamHI和SalI两个粘性末端，再以BamHI和SalI分别混合消化这一对载体，并同已消化的待测DNA片段连接，插入片段与M13mp8和M13mp9的克隆方式见图9.2。从图9.2看出，在DNA片段与M13mp9复制型克隆时，片段按照下式方向插入，从噬菌体颗粒可分离5'SalI====BamHI3'克隆了正链的单链M13mp9模板，在这个载体的EcoRI位点附近有一个正向的引物结合位点，经与引物融合后，DNA聚合酶沿5'→3'方向，以此插入的正链为模板合成新的负链，故以M13mp9为载体，测定的是此DNA的负链的顺序，阅读方向是从5'→3'。如以M13mp8为载体，同样用BamHI和SalI消化，则上述片段将按5'BamHI====SalI5'的方向插入，因而，从噬菌体颗粒可分离出克隆了负链的单链Ml3mp8模板。通俗地说，这种插入，需要打个筋斗再翻个身才能实现。这两个载体的引物位点是相同的，因此新生链的合成方向仍然是5'→3'，DNA聚合酶以此插入的负链为模板合成新的正链，阅读方向是从正链的5'→3'，将测定结果换成对应的互补碱基，即可得到负链3'末端的顺序。

所以，以M13mp8为载体，在放射自显影图谱上核苷酸顺序的阅读是其互补碱基的3'→5'方向。于是，从待测DNA(负链)的3'，5'两端阅读，一个大的DNA片段的顺序即可全部测出。③M13-ddNTP链终止法的程序设计9.5DNA序列的激光测定法应用生物系统（AppliedBiosystems）公司1987年推出—种快速、准确的自动测定DNA序列的新方法——激光测定法。这种方法是在ddNTP链终止法的基础上的进一步发展，但却具有ddNTP链终止法无可比拟的优点。激光法的关键措施是合成四种不同的荧光染料，分别和引物结合起来，以与ddNTP链终止法相同的方式，在4种dNTP、一种ddNTP存在下，用E.coliDNApolI进行新链的合成。在4个反应管中，新合成的不同长度的片段以加入的那个ddNTP而终止。当每一个片段变性脱离模板后，在与新链相连的引物上都带有自己特异的荧光染料(图9.24)。在DNA合成之后，将4个反应管的产物混合在一起，加在PAG的—个点样槽里，电泳。所有染料-DNA片段之间的大小仅相差一个核苷酸，它们按大小不同向下泳动。发射仪产生的激光(1aser)在凝胶底部的固定位置扫描，当带有染料的片段泳动到这里时，受到激光的激发，产生荧光。荧光通过一个装有4个滤光片的转盘，到达光电测定管，发出信号，输入到计算机里去，带有染料的片段一个一个的按大小向下泳动，激光不断的扫描、激发，计算机就能自动地读出这个DNA的全部核苷酸序列(图9.25)。激光测定法的优点是很明显的。(1)高负荷：激光测定法的4个反应管的产物只需加在一个凝胶样品槽，而不是像ddNTP链终止法那样用4个样品槽。因此，在一块凝胶上可以同时测定16个样品，极大地增加了激光测定的负荷。(2)直接测定：激光法通过镭射激发4种不同的染料发射出荧光，而直接读出A、C、G、T4种核苷酸。电泳结束，测定也就结束了。不需要像传统法那样用X光片的放射自显影。安全：激光法不使用放射性同位素，序列分析的传统方法所不具备的最大优点。(4)迅速：从上样到电泳结束，仅需8～10小时，就可得出与ddNTP链终止法同样的结果。(5)简单：避免了ddNTP链终止法的许多繁琐程序如多次加样，梯度凝胶、宽凝胶等等。总之，激光法可说是现代测定DNA序列的最先进方法。由于它是最近才提出的，估计国内应用不广，这里只是作为一个新信息予以介绍，以飨读者。5.2.6DNA与蛋白质相互作用研究1.凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验(gelretarDNAtionassay)，又叫做DNA迁移率变动试验(DNAmobilityshtftassay)，是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝放电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。凝胶阻滞试验的原理比较简单。我们知道在凝放电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也就相应缩短了。所以当特定的DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用(图2-41)。在凝胶阻滞试验中，首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离，并应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以在有的文献中也称这种试验为条带阻滞试验(bandretarDNAtionassay)。?凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitorDNA)。如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现