紫外-可见光分光光度法VIP

紫外-可见吸收光谱分析法2021/7/912.1紫外-可见吸收光谱分析法概述2.1.1特点灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol·L-1,10-4%～10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（1～2％）操作简便快速应用广泛

基于被测物质的分子对紫外-可见光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。2021/7/92波长范围：100~800nm。远紫外区：100~200nm；近紫外区：200~400nm；可见光区：400~800nm。紫外吸收光谱：价电子能级跃迁。结构鉴定和定量分析。电子跃迁同时，伴有振动转动能级的跃迁，带状光谱。最大吸收峰的波长λmax和相应的摩尔吸光系数εmax反映了构成有机分子部分结构的发射团的特征。

2021/7/932.1.2电子跃迁与分子吸收光谱物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动。（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动。（3）分子本身绕其重心的转动。分子有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。分子的内能：电子能量Ee、振动能量Ev、转动能量Er即:E＝Ee+Ev+Er

ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr

2021/7/94能级跃迁

电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。2021/7/95

由图可见，在每一个电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一个振动能级上又有许多间距更小的转动能级。

由于这个原因，处在同一电子能级的分子，可能因振动能量不同而处于不同的能级上。

同理，处于同一电子能级和同一振动能级上的分子，由于转动能量不同而处于不同的能级上。

当用光照射分子时，分子就要选择性的吸收某些波长（频率）的光而由较低的能级E跃迁到较高能级E‘上，所吸收的光的能量就等于两能级的能量之差：

△E=E‘－E

光的频率为：γ=△E/h

或光的波长为：λ=hc/△E2021/7/96

由于分子选择性的吸收了某些波长的光，所以这些光的能量就会降低，将这些波长的光及其所吸收的能量按一定顺序排列起来，就得到了分子的吸收光谱。

2021/7/97分子吸收光谱类型

远红外光谱、红外光谱、紫外-可见光谱三类。

分子的转动能级跃迁，需吸收波长为远红外光，因此，形成的光谱称为转动光谱或远红外光谱。

分子的振动能级差一般需吸收红外光才能产生跃迁。在分子振动时同时有分子的转动运动。这样，分子振动产生的吸收光谱中，包括转动光谱，故常称为振-转光谱。由于它吸收的能量处于红外光区，故又称红外光谱。

电子的跃迁吸收光的波长主要在真空紫外到可见光区，对应形成的光谱，称为电子光谱或紫外-可见吸收光谱。2021/7/982.1.3光的选择性吸收与物质颜色的关系：1．可见光的颜色和互补色：

在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。平常所见的白光（日光、白炽灯光等）是一种复合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等不同颜色的单色光。

白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还可由适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。2021/7/99/nm颜色互补光400～450紫黄绿450～480蓝黄480～490绿蓝橙490～500蓝绿红500～560绿红紫560～580黄绿紫580～610黄蓝610～650橙绿蓝650～760红

分子对光的吸收与吸收光谱不同颜色的可见光波长及其互补光蓝绿2021/7/910物质的颜色与吸收光的关系：

当白光照射到物质上时，如果物质对白光中某种颜色的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所显示的颜色是吸收光的互补色。完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光2021/7/911物质颜色吸收光物质颜色吸收光颜色波长范围（nm）颜色波长范围(nm)黄绿紫400～450紫绿560～580黄蓝450～480蓝黄580～600橙绿蓝480～490绿蓝橙600～650红蓝绿490～500蓝绿红650～760紫红绿500～560

2021/7/912熔融石英晶体石英玻璃NaCl170nm~3.6

m

*200~600nm2

m~3.5

m*360nm~2.5

m*200nm~15

mKClKBrCsI200nm~18

m*230nm~25

m230nm~50

m一些材料的有效透明区2021/7/913Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱300400500600700

/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance3502021/7/914苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯(254nm)甲苯(262nm)A

2302502702021/7/915不同物质吸收光谱的形状以及

max不同——定性分析的基础同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax不同——定量分析的基础2021/7/916吸收曲线（吸收光谱）及最大吸收波长

1．吸收曲线：每一种物质对不同波长光的吸收程度是不同的。如果我们让各种不同波长的光分别通过被测物质，分别测定物质对不同波长光的吸收程度。以波长为横坐标，吸收程度为纵坐标作图所得曲线。300400500600700

/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱2021/7/9172、吸收峰和最大吸收波长

max

吸收曲线表明了某种物质对不同波长光的吸收能力分布。曲线上的各个峰叫吸收峰。峰越高，表示物质对相应波长的光的吸收程度越大。其中最高的那个峰叫最大吸收峰，它的最高点所对应的波长叫最大吸收波长，用λmax表示。

3．物质的吸收曲线和最大吸收波长的特点：1）不同的物质，吸收曲线的形状不同，最大吸收波长不同。2）对同一物质，其浓度不同时，吸收曲线形状和最大吸收波长不变，只是吸收程度要发生变化，表现在曲线上就是曲线的高低发生变化。2021/7/9183)吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。4)不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作作为物质定量分析的依据。5)在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。2021/7/9192.1.4光吸收基本定律:朗伯-比尔定律朗伯定律:(1760)A=lg(I0/It)=k1b当入射光的

,吸光物质的c一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的

,液层厚度b

一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.2021/7/920朗伯-比尔定律意义:

当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.A=lg(I0/It)=kbc2021/7/921透光率(透射比）T（Transmittance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=—lgT=Kbc吸光度A

(Absorbance）I0It入射光透过光2021/7/922吸光度A、透射比T与浓度c

的关系AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

202021/7/923比例常数K的几种表示方法：

吸收定律的数学表达式中的比例常数叫“吸收系数”，它的大小可表示出吸光物质对某波长光的吸收本领（即吸收程度）。它与吸光物质的性质、入射光的波长及温度等因素有关。

另外，K的值随着b和c的单位不同而不同。下面就介绍K的几种不同的表示方法。2021/7/924K

吸光系数Absorptivity

a

的单位:L·g-1·cm-1当c的单位用g·L-1表示时，K叫“吸光系数”，用a表示，

A＝abc它表示的是当c=1g/L、b=1cm时溶液的吸光度。

的单位:L·mol-1·cm-1当c的单位用mol·L-1表示时，K叫“摩尔吸光系数”用

表示.

－摩尔吸光系数MolarAbsorptivity

A＝

bc

它表示的是当c=1mol/L，b=1cm时，物质对波长为λ的光的吸光度。2021/7/925对于K的这两种表示方法，它们之间的关系为：ελ=aMM为吸光物质的分子量。ελ和a的大小都可以反映出吸光物质对波长为λ的单色光的吸收能力。但更常用和更好的是用ελ来表示吸光物质对波长为λ的光的吸收能力。摩尔吸光系数越大，表示物质对波长为λ的光的吸收能力越强，同时在分光光度法中测定的灵敏度也越大。2021/7/926吸光度与光程的关系

A=abc

0.10b0.202b0.00光源检测器显示器参比2021/7/927吸光度与浓度的关系

A=abc0.10c0.202c0.00光源检测器显示器参比2021/7/928吸光度与波长的关系

A=abc0.00红0.10红0.00光源检测器显示器参比蓝绿光红光2021/7/929朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光

应选用

max处或肩峰处测定.3.稀溶液

浓度增大，分子之间作用增强.2.吸光质点形式不变

离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等).2021/7/930溶液浓度的测定A＝

bc工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx2021/7/931例题：已知某化合物的相对分子量为251，将此化合物用已醇作溶剂配成浓度为0.150mmol·L-1溶液，在480nm处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数和吸光系数。解：已知溶剂浓度c=0.150mmol.L-1，b=2.00cm,T=0.398,由Lambert-Beer定律得：ε（480nm）=A/cb=-lg0.398/0.150×10-3×2.00=1.33×103(L·mol-1·cm-1)由ε=aM,得:a=ε/M

=ε/251=5.30(L·g-1·cm-1)2021/7/932实际溶液对吸收定律的偏离及原因：1.偏离：被测物质浓度与吸光度不成线性关系的现象，如下图。AC2021/7/933偏离吸收定律的原因：1)入射光为非单色光：

严格地说吸收定律只适用于入射光为单色光的情况。但在紫外可见光分光光度法中，入射光是由连续光源经分光器分光后得到的，这样得到的入射光并不是真正的单色光，而是一个有限波长宽度的复合光，这就可能造成对吸收定律的偏离。

对非单色光引起的偏离，其原因是由于同一物质对不同波长的光的摩尔吸光系数不同造成的。所以只要在入射光的波长范围内，摩尔吸光系数差别不是太大，由此引起的偏离是较小的。2021/7/9342)非平行光和光的散射：当入射光是非平行光时，所有光通过介质的光的光程不同，引起小的偏离。另外，当溶液中含有悬浮物或胶粒等散射质点时，入射光通过溶液时就会有一部分光因散射而损失掉，使透过光强度减小，测得的吸光度增大，从而引起偏离吸收定律。3)化学因素引起的偏离：1）离解作用;2）酸效应;3）溶剂作用;2021/7/935a）离解作用：

在可见光区域的分析中常常是将待测组分同某种试剂反应生成有色配合物来进行测定的。有色配合物在水中不可避免的要发生离解，从而使得有色配合物的浓度要小于待测组分的浓度，导致对吸收定律的偏离。特别是在稀溶液中时，更是如此。b）酸效应：

如果待测组分包括在一种酸碱平衡体系中，溶液的酸度将会使得待测组分的存在形式发生变化，而导致对吸收定律的偏离。c）溶剂作用：

溶剂对吸收光谱的影响是比较大的，溶剂不同时，物质的吸收光谱不同。2021/7/9362.1.5吸光度的加和性与吸光度的测量

A=A1+A2+…+An

用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。2021/7/9372.2光度分析的方法和仪器方便、灵敏，准确度差.常用于限界分析.8.2.1光度分析的几种方法1.目视比色法观察方向空白c1c2c3c42021/7/9382.光电比色法光电比色计结构示意图通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)2021/7/939滤光片吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收.选择滤光片的原则：滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补.2021/7/9403.吸光光度法和分光光度计光源单色器吸收池检测系统分光光度计的基本组成通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.2021/7/941分光光度计的主要部件光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。

可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)

氙灯：紫外、可见光区均可用作光源

/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯（气体放电光源）氢灯强度2021/7/942氙灯氢灯钨灯2021/7/943单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。

棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同.玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ28006005004002021/7/944光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。

利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便.－平面透射光栅－反射光栅（广泛使用）光栅衍射示意图M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅2021/7/945吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池检流计（指示器）： 低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管2021/7/946硒光电池（Barrier-layerphotocell）适用于300-800nm,在500-600nm范围最灵敏。Se阴极Au，Ag半导体h

阳极2021/7/947光电管(Phototube)h

（片）红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nm2021/7/948光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1个光子可产生106～107个电子160-700nm2021/7/949722型分光光度计光源：钨卤素灯－12V、30W波长范围：330～800nm分光元件：光栅，1200线/mm检测器：端窗式G1030光电管 多碱阴极真空管300～850nm波长精度：2nm光谱带宽：6nm波长精度：仪器波长指示器所显示的波长值与仪器 对应输出的实际波长值之间的符合程 度。可用二者之差来衡量。2021/7/950吸光光度法仪器主要差异比较可见光（380～780nm）紫外光（200～380nm)中红外（2.5～50

m)光源钨灯碘钨灯320～2500氢灯氘灯180～375硅碳棒（红外线）吸收池材料玻璃（350～3200）石英（185～4000）NaCl晶体2021/7/9511.单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图8.2.2分光光度计的基本类型2021/7/9522.双光束分光光度计参比池检测器滤光片或单色器放大器样品池光源hv光子检测器反光镜反光镜透明部分扇形镜正面图扇形镜反光镜栅镜双光束型可以消除光源强度变化的影响.2021/7/953多通道仪器（MultichannelInstruments）光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管)photodiodearrays(PDAs)

同时测量200～820nm范围内的整个光谱,比单个检测器快316倍,信噪比增加3161/2倍.

3.其他类型分光光度计纤维光度计将光度计放入样品中,原位测量.对环境和过程监测非常重要.2021/7/954HP8452A多通道二极管阵列分光光度计2021/7/955镀铝反射镜纤维光度计示意图2021/7/956纤维光度计2021/7/9572.3吸光光度法的灵敏度与准确度2.3.1灵敏度的表示方法

摩尔吸光系数(

)

A=

bc

=A/bc

(L·mol-1·cm-1)

越大,灵敏度越高:

<104为低灵敏度;

104～105为中等灵敏度;

>105为高灵敏度.2021/7/9582.Sandell(桑德尔)灵敏度

(S)定义：截面积为1cm2的液层在一定波长或波段处，测得吸光度为0.001时所含物质的量。用S表示，单位：

g·cm-2A=

bc=0.001

bc

＝0.001/

S小灵敏度高;

相同的物质,M小则灵敏度高.变换单位:bcmcmol/L=bcM106

g/1000cm22021/7/959例1邻二氮菲光度法测铁

(Fe)=1.0mg/L,

b=2cm,A=0.38计算

、S

和解：

c(Fe)=1.0mg/L=1.0×10-3/55.85=1.8×10-5(mol·L-1)S=M/

=55.85/1.1×104=0.0051(

g/cm2)或2021/7/960c=1.0mg/L=1.0×10-3g/1000mL=1.0×10-4g/100mL2021/7/961例2比较用以下两种方法测Fe的灵敏度.B.用4,7-二苯基邻二氮菲光度法测定铁ε533＝2.2×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(2.2×104)＝0.0025(

g·cm-2)B方法比A方法的灵敏度高.A.用邻二氮菲光度法测定铁时，ε508＝1.1×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(1.1×104)＝0.0051(

g·cm-2)2021/7/9622.3.2准确度—仪器测量误差100806040200T/%

c1

c2

c3

T

T

T-透光率读数误差

c

c1c1

c2c2

c3c3><由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差

T

引起的测量误差

c/c不同。2021/7/963测量误差公式推导:dA=d(-lgT)=d(-0.434lnT)=-0.434dT/TA=-lgTTlgT最大时，即(TlgT)′=0时误差最小,算得lgT=-0.434,T=36.8%,A=0.4342021/7/9641086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之间(调c,b,

)2021/7/9652.4.1显色剂与显色反应

显色反应：在光度分析中将试样中的待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。

：：：：助色团－NH，－OH，－X（孤对电子）ne8.4显色反应与分析条件的选择O生色团：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共轭双键）πe2021/7/966显色反应一般分为两大类：一类是配位反应；另一类是氧化还原反应。Fe3＋＋SCN－=FeSCN－；Mn2＋－5e＋4H2O=MnO4－＋8H＋在这两类反应中，用得较多的是配位反应。

显色剂：与待测组分生成有色化合物的试剂叫显色剂；

1．无机显色剂：2．有机显色剂：

1）优点：a．具有鲜明的颜色，ε都很大（一般可达到104以上），所以测定的灵敏度很高；b．生成的一般为螯合物，稳定性很好，一般离解常数都很小；c．选择性好d．有些有色配合物易溶于有机溶剂，可进行萃取光度分析，提高了测定的灵敏度和选择性。2021/7/967有机显色剂CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙测定很多重金属离子，如：铅、锌、铜、银、汞、镉等。NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸2021/7/968显色反应的选择

灵敏度高，一般ε>104;选择性好;显色剂在测定波长处无明显吸收,

对照性好,

max>60nm;反应生成的有色化合物组成恒定，稳定;显色条件易于控制，重现性好.2021/7/9692.4.2显色条件的确定c(R)c(R)c(R)1.显色剂用量（c(M)、pH一定）Mo(SCN)32+浅红Mo(SCN)5橙红Mo(SCN)6-浅红Fe(SCN)n3-n2021/7/9702.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）pH1<pH<pH2pH2021/7/97125℃50℃t/minA3.显色温度及显色时间

(c(M)、c(R)、pH一定)另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等.2021/7/9722.4.3测定中的干扰以及消除方法Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(蓝)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－测Co2＋:(掩蔽法)1.化学法

2021/7/973Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnRNiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

钴试剂RH+测Co2＋:(生成络合物性质不同)消除干扰，也可采取分离法。Fe3+,Cu2+FeSSal（紫红）Cu2+pH=2.5SSal测Fe3＋:(控制pH)2021/7/9742.物理法—选择适当的测定波长515655415500钍-偶氮砷III

钴-亚硝基红盐

AA络合物络合物试剂试剂

/nm

/nm2021/7/9751.仅络合物有吸收，溶剂作参比。

如phen—Fe2+标准曲线2.待测液也有吸收，被测液作参比。

如测汽水中的Fe3.显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比

例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4.干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.

--选择适当的参比溶液2021/7/976

2.4.4光度测量误差及测量条件的选择

光度分析的误差来源于两方面：一方面是各种化学因素引入的误差；另一方面是仪器测量不准引入的误差。对于化学因素，前面巳经讲过，现在我们来看仪器测量不准引入的误差。

1.仪器测量误差：

任何光度计都有一定的测量误差，测量误差的来源主要是光源的发光强度不稳定，光电效应的非线性，电位计的非线性，杂散光的影响，单色器的光不纯等等因素.具体说来，对于一个给定的光度计来说，其透光率的读数误差等于常数△T，约为0.01～0.02。

T%在80～10%即A=1～0.1时的浓度测量的相对误差较小。对于精度较好的仪器，当T%在60～20%（A=0.2～0.7）时，测量误差约为1%。当T=0.368或A=0.434时，浓度的测量误差最小。

2021/7/9772．测量波长的选择：一般选用待测物质的最大吸收波长作为测量波长（入射光）但当在最大吸收波长处有干扰时，则应根据“吸收最大干扰最小”的原则来选择波长。3．控制适当的吸光度范围：由测量误差可知，当吸光度在0.2～0.8之间时，测量误差最小，所以应尽量控制吸光度在此范围进行测定。控制的方法为：1）控制溶液的浓度；2）选用适当厚度的比色皿；2021/7/9782.5吸光光度法的应用8.5.1单一组分的测定1.金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂2.磷的测定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄(

小)磷钼(V)蓝(

大)Sn2+2021/7/9793.蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等4.氨基酸测定—茚三酮(紫色化合物)5.水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+----6.药物含量测定—比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7.紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。2021/7/980单组分定量分析

紫外-可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的、最有效的手段之一。尤其在医院的常规化验中，95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的优点是：1)可用于无机及有机体系。一般可检测10-4-10-5mol/l的微量组分，通过某些特殊方法(如胶束增溶)可检测

10-6-10-7mol/l的组分。2)准确度高，一般相对误差1-3%，有时可降至百分之零点几。3)分析条件的选

定量分析方法

标准曲线法

标准加入法2021/7/981标准曲线法配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。通过标准曲线可求得未知样品的浓度。标准加入法样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量0,C1,C2…,Cn的待测组分配制溶液。由加入待测试样浓度由低至高依次测定上述溶液的吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一条直线。若直线通过原点，则样品中不含待测组分；若不通过原点，将直线在纵轴上的截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离为样品中待测组分的浓度。2021/7/9822.5.2多组分的测定

xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液在

1,

2处分别测得.在

1处测组分x,在

2处测组分y.b)在

1处测组分x;在

2处测总吸收,扣除x吸收,可求y.c)x,y组分不能直接测定

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在

1处测得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在

2处测得A2)2021/7/983

2.5.3光度滴定NaOH滴定对硝基酚pKa=7.15 间硝基酚pKa=8.39

pKa=1.24V1V2V(NaOH)/mL对硝基酚间硝基酚酸形均无色.碱形均黄色2021/7/984典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。Vsp滴定剂吸收Vsp被滴物吸收Vsp滴定剂与待测物均吸收Vsp产物吸收2021/7/9852.5.4络合物组成的测定1.摩尔比法:

固定cM,改变cR

1:13:1c(R)/c(M)A1.02.03,0

2021/7/9862.等摩尔连续变化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:200.20.40.60.8100.20.40.60.812021/7/9872.5.5一元弱酸离解常数的测定HLH＋＋LKa＝[H+][L]/[HL]高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得AHL＝εHL·c(HL)；低酸度下，几乎全部以L存在，可测得AL＝εL·c(HL).代入整理：或配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A.HL、L颜色不同[HL][L]2021/7/988MO吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa350400450500550600

/nmA曲线pH11.10,1.3822.6533.0643.4853.9865.53,6.80由每份溶液的一对pH、A，可求得一个Ka,取平均值即可.2021/7/9892.5.6差示分光光度法

高含量组分的测定:配制一系列待测组分的浓度相差较小，且待测组分浓度与试液浓度相近的标准溶液，以其中浓度最小的标准溶液(Cs)作参比溶液，测定其它标准溶液的吸光度，以吸光度对测定溶液和参比溶液的浓度差作图，得一过原点的标准曲线。

再在相同的条件下测定试液的吸光度，由曲线上查得试液的浓度与参比溶液浓度的差值，从而求得待测组分的浓度。

Cx=Cs+△Cx

AAx△Cx△C2021/7/990测量原理：当试样中组份的浓度过大时，则A值很大，会产生读数误差。此时若以一浓度略小于试样组份浓度作参比，则有：具体做法：以浓度为cs的标准溶液调T=100%或A=0（调零），所测得的试样吸光度实际就是上式中的

A，然后求出

Cx，则试样中该组份的浓度为(Cs+

Cx)。2021/7/991Tx常规法T051050100TsT051050100落在测量误差较大的范围

落在测量误差较小的范围TrTs示差法结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度2021/7/9928.6

紫外可见分光光度法在有机定性分析中的应用2.6.1有机化合物分子的电子跃迁和吸收带非键轨道成键轨道成键轨道反键轨道反键轨道

(nm)HCHO==n

*>*>*>n*>*>n*2021/7/993跃迁

max(nm)

*~150(<200)n*~200100～300n*200～80010～100*~200~104190CH2－CH2CH2135（C－C）CH3－CH2－CH3135（C－C）CH3－CH3125（C－H）CH4λmax（nm）饱和烃类

→

*跃迁

(饱和烃类)

（作溶剂）2021/7/994

max(nm)

max(nm)

H2O1671480CH3OCH31842520CH3OH183150CH3NH2215600CH3Cl173200(CH3)2NH220100CH3Br204200(CH3)3N227900CH3I258365

n→

*

跃迁（含具n电子的杂原子）2021/7/995n→

*跃迁（带孤对电子的杂原子与其他

键共轭）280～300饱和醛酮1000(n→

*)16(n→

*)186280CH3COCH3异辛烷22280CH3－NO2EtOH5339CH3N＝NCH3H2O60214CH3CONH2EtOH41204CH3COOH

max(nm）介质2021/7/996π→π*

跃迁（不饱和烃类)6000173CH三CH14000175CH2＝CH2

max(nm）π→π*跃迁的

max短，

大,n→

*跃迁的

max长，

小.2021/7/997电荷迁移跃迁（荷移光谱）特点：谱带宽,吸收强度大,λmax处的ε可大于104。Fe3＋—SCN-

Fe2＋—SCN

（分子内氧化还原）h

RN1R2Rh

D—AD＋—A-e给予体e接受体e给予体e接受体N1R2-+h

CROCRO-+h

2021/7/9982.6.2有机分子中的生色团与助色团 严格地说，只有含有不饱和基团或孤对电子的基团，才是生色团（n→π*，π→π*）－C－C－，－C－H，σ→σ*～150nmn→σ*，σ→σ*::C＝OC＝C－O－::n→π*，π→π*－C－O－，－C－S－n→σ*

,σ→σ*

～200nm::::－C－N－，－C－Cl：:::C＝C,－C＝C－π

→π*,σ→σ*～200nm

（孤立双键<200nm）生色团类型2021/7/999生色团举例-1221000275190(CH3)2C=O12.51000289182蒸气H3CCHOC＝O4500172蒸气C2H2C三C15530171气态C2H4C＝C125CH4－C－H135C2H6－C－Cελmax溶剂例生色团2021/7/9100生色团举例-2

max溶剂例生色团15.84400279202己烷CH3NO2－NO2160295MeOH乙酰胺－CONH260204水乙酸乙酯－COOR34240庚烷CH3COCl－COCl41200EtOHCH3COOH－COOH～200－C－OH，－C－SH－C－N，－C－Cl2021/7/9101生色团举例-3

max溶剂例生色团2257000261206.5水甲苯2057400254203.5水苯200238异辛烷C2H5CH＝NC5H6C＝N－25343水反式偶氮甲烷－N＝N－7417乙醚重氮甲烷＝N＝NCH3＋－2021/7/9102不饱和基团助色效应大256261264282

320

276(K带)

苯环B带λmax(nm)CH3ClCH=CH2CCH3O常见助色团及其助色效应(红移——

max增大):－F<－CH3<－Cl<－Br<－OH<－OCH3<－NH2<－NHCH3<－N(CH3)2<－NHC6H5<－O－例：

CH3Cl CH3Br CH3I

max(nm)172 204 2582021/7/9103反助色团大多是吸电子基团（蓝移）

－NH3＋<－SO2NH2<－COO－<－CN<－COOH<－COOCH3<－COCH3<－CHO2021/7/9104共轭烯烃键数与能量的关系

E

E

E

E

4*

5*

6*

3

2

1

3

2

1

4

5*

6*

7