(高清版)DB34∕T 1434-2011 抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种实时荧光PCR检测方法　　

ICS65.020.20抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种实时荧光PCR检测方法2011-05-11发布2011-06-11实施安徽省质量技术监督局发布IDB34/T1434—2011本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省质量技术监督局归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所和安徽省标准化研究院。本标准主要起草人：汪秀峰、杨剑波、李莉、陆徐忠、马卉、张士胜、倪大虎、宋丰顺、陈萍、倪金龙、杨亚春、张毅。1DB34/T1434—2011抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种实时荧光PCR检测方法1范围本标准适用于转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种，以及相关制品中Bt176成分的实2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求和定义NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T674转基因植物及其产品检测DN农业部869号公告-8-2007抗虫和耐除草剂玉米BT176及其衍生品种定性PCR方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。玉米醇溶蛋白基因。Bt176转化体特异性序列event-spec外源插入载体3’端与玉米基因组的连接区序列，包括bar基因部分序列和玉米基因组部分序列。通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量的分析。2DB34/T1434—2011是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。Ct值cyclethreshold4原理5.270%乙醇(V/V)。中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。水中加入80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后再加水定容到200mL。5.5500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0):称取乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2)18.6g,加入708.0,加水定容到100mL,在103.4kPa(121℃)灭菌20min。5.6TE缓冲液(pH8.0):1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL和500mmol/LEDTA(pH8.0)溶液2mL,5.8适用于PCR反应的TaqDNA聚合酶(5U/μL)及其反应缓冲液。5.9引物和探针：序列信息应按附录A执行。用TE缓冲液(5.6)或重蒸馏水将上述引物和探针稀释注：探针应避光保存。3DB34/T1434—20116仪器6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2普通PCR仪和Real-timePCR仪。7操作步骤的比值在1.7～2.0时，满足PCR检测要求。7.5对照设置7.6PCR定性检测按农业部869号公告-8-2007规定的执行。实时荧光PCR体系反应体系和反应条件参照附录B和附录C执行。反试剂要求进行适当调整。每个反应体系设置3个平行。4DB34/T1434—2011或空白对照荧光值低于阴性对照和阳性对照荧光值的15%,表明反应体系正常工作；在扩增检测转化体Bt176时，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直，阳性对照出现典型的扩增曲线，且检测Ct值≤36或空白对照和阴性对照的荧光值低于阳性对照荧光值的15%,表明反应体系正常工作。否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。8结果分析与表述a)试样中内标准基因检测Ct值≤36,转化体Bt176检测Ct值≥40,则表明该试样中不含转基b)试样中内标准基因检测Ct值≤36,转化体Bt176检测Ct值≤36,则表明该试样中含有转基c)试样中转化体Bt176检测Ct值在36～40,则需调整模板浓度，重新检测。经重复检测后，当检测体系正常时，转化体Bt176检测Ct值<40,则表明该试样中含有转基因成分Bt176,表述为“样品中检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt176,检测结果为阳性”;否则，表明该试样中不含转基因成分Bt176,表述为“样品中未检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt176,检测结果为阴性”。9防污染措施转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt176的实时荧光PCR检测过程的防污染措施应符合NY/T672的5DB34/T1434—2011(规范性附录)实时荧光PCR检测引物和探针序列信息表A.1被检测基因引物或探针序列扩增长度/bpzSSIIbzSSIIb-F:5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-388bpzSSIIb-R:5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'zSSIIb-P:5′-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3Bt176Bt176-F:5′-GTGCATCAATGGAGGAGAGAAC-3′Bt176-R:5′-GACTTCAGCCTGCCGGTACT-3′Bt176-P:5′-FAM-TCTCGGTGACGGGCAGGACC-TAMRA-36DB34/T1434—2011(规范性附录)实时荧光PCR检测反应体系终浓度水2×TaqManMix10Hmol/L下游引物10Hmol/L探针25mg/LDNA模板总体积注1:如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水。注2:玉米内标准基因PCR检测反应体系中，上下游引物和探针分别为zSSIIb-F/R和zSSII