蛋白质分子量测定方法研究进展

蛋白质分子量测定方法研究进展SDS凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳技术就是实验室进行蛋白质研究中最常用得技术,兼有电泳与分子筛得双重作用。SDS就是一种阴离子去污剂,可使蛋白质变性,与其蛋白质结合成带负电荷得蛋白质-SDS复合体,消除电泳过程中蛋白质所带电荷对电泳结果得影响,从而保证蛋白质电泳仅受分子质量大小得影响。在一定得电场作用下,该复合体沿着以聚丙烯酰胺凝胶形成得分子筛向电场得正极移动,从而将蛋白质根据她们得分子量大小而分开。蛋白质-SDS复合体:形状一定、电荷密度一定SDS凝胶电泳上样:防止样品溢出、正负极、电压SDS凝胶电泳当蛋白质分子量在10-200kDa时,样品得迁移率与分子量得对数呈对数关系,符合如下方程式:

lgMW=-b﹒Rf+K其中,MW为蛋白质分子质量,Rf为相对迁移率,b为斜率,K为截距,当条件一定时,b与K为常数。因此通过已知分子量得蛋白与未知分子量蛋白得比较,就能得出未知蛋白得分子量。影响分子量测定得因素很多,包括蛋白质与SDS得结合量得不同,凝胶浓度与交联剂浓度等,如图所示。研究者测定了当交联剂浓度不变,改变凝胶浓度,下图分别对应于凝胶浓度为5%,10%,15%。SDS凝胶电泳优点:操作简单,容易掌握,成本低,分辨率高,重复效果好。缺点:对于电荷异常或者构象异常得蛋白、带有较大辅基得蛋白及一些结构蛋白测定得分子质量不太可靠,而且电泳结束后还需要染色,染色,脱色比较耗时。SDS凝胶电泳凝胶渗透层析法定义:又叫体积排阻层析、分子筛层析,当生物大分子通过装有凝胶颗粒得层析柱时,根据它们分子大小不同而进行得分离技术。固定相:惰性凝胶颗粒,颗粒内部立体网状结构,形成许多孔穴原理:凝胶渗透层析法常用凝胶:交联葡聚糖凝胶(Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶(Sepharose)凝胶渗透层析法洗脱体积Ve与分子量得关系可用下式表示:Ve=K1—K2logMW(K1、K2为常数,MW为分子量)从公式可以瞧出,目标样品得流出体积与分子量对数成线性关系。在实际操作过程中,选取标准品与样品同时通过凝胶柱,通过已知标准品得流出体积与分子量可以计算出曲线中得K1、K2值,再根据已知得曲线方程与样品流出体积计算样品得分子量。凝胶渗透层析法优点:操作简单,设备简单,样品用量少,周期简单,条件温与,一般不引起生物活性得改变。缺点:应用具有一定得局限性,在pH6—8得范围内,线性关系比较好,但在极端pH时,一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时,测得分子量比真实得要大,铁蛋白则与此相反,测得得分子量比真实得要小。质谱法

1906年,Thomson发明了质谱技术,最初只就是用于无机化学中得同位素分析,直至20世纪40年代末才发展成为有机质谱。近年来,生物质谱技术取得了突飞猛进得发展,其中以分别由美国科学家John、B、Fenn与日本科学家田中耕一发明得电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)及基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)得贡献最为突出。可准确测定分子量大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点

1、电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)原理:电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)就是在毛细管得出口处施加一高电压,所产生得高电场使从毛细管流出得液体雾化成细小得带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面得电荷密度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷得离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子得形式进入气相得质谱技术。ESI-MS测定蛋白质大分子就是根据一簇多电荷得质谱峰群,通过解卷积得方式计算得到蛋白质得分子量,由于ESI-MS可以产生多电荷峰,因此使得测试得分子质量范围大大扩大。

1、电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)电喷雾就是一种离子化方法,可以用作质谱仪得离子源

1、电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)多电荷使得样品谱图复杂荷质比:

1、电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)优点:(1)对样品得消耗少,不会造成样品得大量浪费;(2)对样品分子质量测试灵敏度、分辨力与准确度都相当高;(3)能够方便地与多种分离技术联用,如毛细管电泳、高效液相色谱等,就是解决非挥发性、热不稳定性、极性强得复杂组分化合物得定性定量得高灵敏度检测方法。缺点:对样品纯度要求高,且会形成多电荷得质谱峰群,难以分辨,使得结果分析较为困难。

2、基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)原理:基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)就是将待测物悬浮或溶解在一个基体中,基体与待测物形成混晶,当基体吸收激光得能量后,均匀传递给待测物,使待测物瞬间气化并离子化。将它与经典得脉冲化工作方式得飞行时间质谱仪(TOF)直接联用,即我们常听到得基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。TOF得原理就是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器得飞行时间不同而被检测即测定离子得质荷比(M/Z)与离子得飞行时间成正比,检测离子。

2、基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)优点:(1)同ESI-MS一样对样品得消耗很少;(2)MALDI-MS得最高分辨率不断提高,甚至超过ESI-MS;

(3)有利于对复杂混合物得分析,且能忍受较高浓度得盐、缓冲剂与其她难挥发成分,降低了对样品预处理得要求;(4)MALDI-TOF质谱对生物大分子分子量得测定范围就是所有测试技术中最广。缺点:在与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备得联用时,目前只能采取离线得方式,致使分析结果得重复性较差,与MALDI-MS本身高精密度得特性不匹配。其她方法除了以上几种目前实验室常用得测定方法,还有一些现在在实验室一般不太使用得方法,包括粘度法,渗透压法,辐射失活法,超速离心沉降法,光散射法等。

1、粘度法

粘度法就是指通过测定样品溶液得粘度,从而计算样品得得分子量得方法。一定温度条件下,高聚物稀溶液得粘度与其分子量之间呈正相关性,随着分子量得增大,聚合物溶液得粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度得变化,即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。如果高聚物分子得分子量愈大,则它与溶剂间得接触表面也愈大,摩擦就大,表现出得特性粘度也大。特性粘度[η]与相对分子量M之间遵循Mark-Houwink经验方程:[η]=