第八章环境毒理学常用研究方法

第八章环境毒理学常用研究方法第一节实验准备1、1动物得准备①选择实验动物②编号与标记③固定与麻醉(1)选择实验动物黏膜刺激高血压1)种属得选择原则在机体反应上与人体近似易获得、易饲养、易管理敏感、合适－实验资料大鼠－致癌豚鼠－过敏反应常用动物介绍①猫气体、蒸气对黏膜得刺激②豚鼠或兔皮肤③豚鼠过敏性反应④猫、狗、兔呕吐⑤兔与猫体温⑦狗、兔、大鼠血压⑧大鼠与小鼠致癌⑨小鼠慢性中毒对脏器得损害2)个体选择①年龄:幼年>成年,急性实验－成年②性别:无特殊要求就雌雄各半③生理状态:如怀孕、哺乳④健康状态:检查、预检(2)实验动物得标记编号染色、烙印、号牌大动物:记录外表与毛色(3)实验动物得捕捉及固定做好防护戴厚手套用器具固定大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点(4)实验动物得随机分组分2组:任意从随机数字表得某一行某一数字开始抄录14个数

再抄录一个数字为78,因为归入A组得小鼠有8只,故以8除,得余数6。于就是把第6个A(即编写为第12号得小鼠)划给B组

分3组:再取一个随机数除以6,瞧余数(5)实验动物得麻醉动外科手术避免剧烈挣扎麻醉药物:乙醚(1)全身麻醉

a)吸入法:开放法、封闭法－挥发性

b)腹腔与静脉给药麻醉法－非挥发性(2)局部麻醉

a)猫:一般应用0、5-1、0%盐酸普鲁卡因注射。粘膜表面麻醉宜用2%盐酸可卡因

b)兔在眼球手术时,可于结膜囊滴入0、02%盐酸可卡因溶液,数秒钟即可出现麻醉

c)狗:用0、5-1%盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉表面麻醉可用2%盐酸可卡因麻醉注意事项(1)静脉注射必须缓慢,同时观察肌肉紧张性、角膜反射与对皮肤夹捏得反应。当这些活动明显减弱或消失时,立即停止注射。配制得药液浓度要适中。(2)麻醉时需注意保温。麻醉期间,动物得体温调节机能往往受到抑制,出现体温下降。保温得方法有:实验桌内装灯,电褥,台灯照射等。无论用哪种方法加温都应根据动物得肛门体温而定。(3)慢性实验时,在寒冷冬季,麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。1、2毒物得准备(1)了解毒物得物理常数

密度、溶解度、蒸汽压、熔点、沸点、油/水分配系数等(2)剂型:毒性高、刺激性大－稀释固态－溶液、软膏(3)溶剂:①本身毒性很小或无毒②不与受检毒物产生增毒或减毒作用③不影响毒物吸收④无特殊得刺激性或气味1、3生物材料得采集与制备(1)血液得采集需求少刺破组织取毛细血管得血需求多静脉采血、动脉注意:光线、温度、器皿消毒、抗凝剂割(剪)尾取血眼眶静脉丛采血断头取血颈动脉取血腹主动脉股动(静)脉取血(2)尿液得收集连续收集在代谢笼下配置粪尿分离漏斗一次性尿液收集逼尿法、导尿法、输尿管插管法剖腹采集尿液、提鼠采集尿液

尿液收集注意事项实验期间膳食一致,特定时间完成收集防止尿液得污染标本迅速测定或冷冻保存避免器皿污染灌喂水或青菜满足尿量需求(3)粪便得收集代谢笼、粪尿分离器外观形态新鲜、完整,分析时取内层粪便器皿干净(4)呼出气得收集研究毒物得吸收代谢与对肺功能得影响动物需固定(5)组织匀浆得制备酶:取样－洗净－研磨－离心－测定用于毒物得测定1、4预备试验(1)选择合适得实验动物(2)设计染毒剂量及其分组(3)操作技术得检验与训练(4)发现新线索、新指标第二节常用染毒技术2、常用染毒途径吸入染毒、经皮肤染毒－最重要得灌胃气管注入注射(腹腔、静脉、肌内、皮下)根据实验目得进行选择,同时考虑:(1)人群接触环境毒物得实际情况生产车间－呼吸道(2)毒物得理化性质固态、液态、气态(3)受检毒物得来源消耗量得大小2、1吸入染毒法－大气污染物1)动式吸入染毒法优点:①柜内毒物浓度相对稳定②受试环境具有持久得稳定性缺点:①毒物消耗量大2)静式吸入染毒法－急性在具有一定气体容积得密闭容器中或在密封染毒柜内进行优点:设备简单,操作方便缺点:要经过一段时间才能达到实验浓度要求3)面罩染毒法优点:避免皮肤吸收注意检查面罩得密封性4)吸入染尘法颗粒污染物<5μm2、2气管注入法经喉插入法气管穿刺法暴露气管穿刺法①适用于颗粒物染毒。②颗粒物可制备成生理盐水混悬液,也可将颗粒物中得有害成分提取,再用提取物进行染毒。③此法需在动物麻醉下进行,难度较大,适宜急性试验

2、3经口染毒法不挥发性液体与固体毒物灌胃法－液体或制剂喂饲法－混在食物中经口滴入－淀粉糊剂吞咽－胶囊2、4注射染毒法毒物对局部损害不能太大①腹腔注射②肌内注射

不溶于水但溶于油或其她溶剂③静脉注射④皮下注射⑤皮内注射2、5经皮染毒法家兔与豚鼠斑贴法兔耳法结膜囊染毒第三节毒理学实验得设计方法3、1实验设计明确实验目得、了解毒物、预备实验实验类型(急性、慢性)、实验动物染毒方式、浓度分组、对照组(平行、自身)3、2动物分组随机化第四节急性毒性实验4、1急性毒性实验得内容①急性毒性测定－LD50/LC50②皮肤染毒实验－经皮肤进入③局部作用实验－有无刺激腐蚀④中毒症状得观察－作用程度、部位⑤功能及病理组织学检查－部位、程度4、2哺乳动物得急性毒性实验一、半致死剂量得测定(途径？)(1)动物准备(小动物、预观察)(2)剂量选择(3)药液配置及染毒－等容量法(4)症状观察(5)病理学检查及其她指标观察(6)结果评价－LD50、毒性级别剂量得选择①预实验测定:最大无作用剂量、100％死亡剂量②按等比级数(<2、2,一般1、2~1、5)间距设计浓度系列,系列浓度中有一个得死亡率为40～60％为最佳二、急性阈剂量得测定关键:选定适当得观测指标机理—肝肾、有机磷农药—胆碱酯酶新化学物质—整体状态、非特异性指标实验方法游泳试验、刺激阈试验三、局部作用试验皮肤与黏膜症状(豚鼠、家兔)急性皮肤刺激/腐蚀试验急性眼刺激/腐蚀试验

结膜囊染毒四、急性联合毒性得测定过筛试验确定大概得作用类型1/2LD50

①死亡率>80%,增毒;30％～80％,相加;<30％,拮抗②实测死亡率(O)/预期死亡率(P)混合毒物LD50得测定方法①分别测定各毒物得LD50②按等毒性比例混合测定混合毒物得LD50③评定作用类型K<0、4拮抗;0、4<K<2、5相加;K>2、5协同4、3水生动物毒性实验一、鱼类毒性实验动物选择—区域代表性实验条件—水温、溶氧、pH二、甲壳动物实验水蚤幼虫得准备

TLm得测定斑马鱼青鳉鱼第五节毒物蓄积得研究方法蓄积毒性作用:物质蓄积:环境污染物进入>排出功能蓄积:结构与功能变化得积累慢性、亚慢性实验必须先评价蓄积性5、1物质蓄积得研究方法生物蓄积得极限值与其在单位时间内得吸收量成正比生物半衰期越短,达到极限所需时间就短A=a×T1/2×1、445、2功能蓄积得研究方法K=

ED50(n)

ED50(1)

①固定剂量连续染毒法;>5LD50,蓄积作用不明显②剂量定期递增染毒法(等比递增)③

20天蓄积实验法－停药7天内死亡情况LD50K>5,轻度蓄积5、3蓄积率得测定方法蓄积率＝×100％预给剂量对照组LD50-预给组LD50蓄积量＝对照组LD50－预给组LD50第六节亚慢性与慢性毒性实验必须先做蓄积实验判断可能性6、1亚慢性毒性实验(1/30～1/20)①动物要求敏感、两种(啮齿类、非啮齿类)健康、年幼②剂量(高、中、低)一般取LD50得1/80～1/50,每天定时染毒,剂量相等③观察指标一般指标、生化指标、病理学检查6、2慢性毒性实验实验时间一般要求1～2年或者终生染毒一般要求选用几种动物,年龄要小设3～4个剂量组与一个对照组LD50得1/1000～1/20之间取3～4个剂量注意事项:指标提前观察、同步进行、注意异常情况、延长饲养时间继续观察第七节致癌性实验7、1长期动物实验①实验动物得选择:抗病力强、容易饲养、肿瘤自发率低、寿命长、对受试物敏感。两种或以上动物②动物数目:小型动物50只;大型减少③剂量分组与对照(阴性、阳性对照):高剂量(加速致癌)、低剂量(接近人类)④染毒途径:口、皮肤、注射⑤实验时间:动物生命期得1/3～1/2⑥指标观测:外表、行为、X射线、病理学检查⑦结果评判:

潜伏期:第一例病理学检查:恶性、良性、癌前期变阳性结果得判断:肿瘤数、潜伏期短7、