3.1重组DNA技术的基本工具课件-高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

怎样培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？

我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题。

棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平原理结果重组DNA技术生物体外基因DNA分子水平获得人们需要的新的生物类型和生物产品基因重组1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。科技探索之路基因工程的诞生1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。1985年，穆里斯等人发明了PCR。1990年，人类基因组计划启动。2003年完成21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。科技探索之路基因工程的发展第3章

基因工程

第1节重组DNA技术的基本工具

第1节重组DNA技术的基本工具新课程标准核心素养1.简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3.进行DNA的粗提取与鉴定。1.科学思维——模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。2.社会责任——关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生了基因工程。从社会中来

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。转基因木瓜环斑病毒的非转基因木瓜限制性内切核酸酶、DNA连接酶，载体。限制性内切核酸酶：DNA连接酶：载体：这些“分子工具”各具有什么特征呢？那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。能将目的基因连接到载体上。能将目的基因导入受体细胞中。一、限制性内切核酸酶--“分子手术刀”

1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来

2、种类：迄今分离的限制酶有数千种3、作用特点：具有专一性。具体表现如下4、作用部位:特定切点上的磷酸二酯键5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯键①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。5、两种常用的限制酶：限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例:

E：Escherichia(属)

co：coli(种)

R：RY13(品系)

I：首先发现在此类细菌中发现的顺序EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichiacoli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分离出的第一个限制酶。EcoRⅠ和SmaⅠ黏性末端黏性末端（1）EcoRI限制酶的切割:

当限制酶在它识别序列得中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。中轴线EcoRⅠ中轴线黏性末端（1）EcoRI限制酶的切割:

当限制酶在它识别序列得中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。中轴线（2）SmaI限制酶的作用只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。当限制酶在它识别序列中轴线处切开时，产生的是平末端。在C和G之间切开6、结果：产生黏性末端或平末端7、限制酶的识别序列的特点(1)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如：EcoRⅠ、SmaⅠ(2)少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成(3)限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？破坏外源DNA，保护自我2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？缺乏特定的核苷酸序列3．请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。4．请结合下图，推断限制酶切一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？断开两个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗两分子水。EcoRⅠ黏性末端……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因练习：使用EcoRI剪切目的基因G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

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AA

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C

G用同种限制酶切割(EcoRⅠ)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？

缺口怎么办？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G二、DNA连接酶--“分子缝合针”把切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。即将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的

。

DNA连接酶主要有两类：

、

。

2.E.coli

DNA连接酶T4DNA连接酶磷酸二酯键1.DNA连接酶的作用AGTCATTCGATA可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来；（1）E.coliDNA连接酶两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来。注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！（2）T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低CCCGGGGGGCCCDNA连接酶--“分子缝合针”2类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)DNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATT连接两个DNA片段

与DNA聚合酶区别：CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制3DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链与DNA相关的五种酶的比较根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④⑤②a：磷酸二酯键；b：氢键练习：工具分子手术刀分子缝合针分子运输车限制性内切核酸酶：DNA连接酶：载体：准确切割DNA分子得到所需要的目的基因将DNA片段连接起来即能将目的基因连接到载体上将体外重组好的DNA分子导入受体细胞（即能将目的基因导入受体细胞中）质粒（最常用）作为载体，将外源基因送入受体细胞。1.作用：动植物病毒噬菌体2.种类：三、基因进入受体细胞的载体——分子运输车

质粒是一种裸露的、结构简单的、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。3、载体需具备的条件（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA插入其中。（2）能在细胞中进行自我复制，

或整合到受体DNA上随DNA同步复制（3）有特殊的标记基因，便于重组DNA的筛选。

如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因。（4）对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤

实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。标记基因的筛选原理

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…实例：重组DNA分子的模拟操作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…载体的作用载体的必要条件载体的种类①具一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。②能在宿主细胞中自我复制

或整合到受体DNA上随受体DNA复制③具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选。①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中②在受体细胞内对目的基因进行大量复制①质粒②病毒：噬菌体、动植物病毒等。三、基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”本节小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键产生黏性末端或平末端DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶质粒、噬菌体、动植物病毒载体具备的条件具一种至多种限制酶切点具标记基因能在宿主细胞中自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA复制【典例】1.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）上述操作中不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，_____________________________________________________。抗病基因抗生素抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中2.用限制酶切割时需注意的事项(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是

。但是使用该法缺点是容易发生

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。(2)获取一个目的基因需限制酶切割

次,共产生

个游离的磷酸基团。(3)选择限制酶切割位点的基本原则：

①切割目的基因时：

。②切割质粒时：

。为了产生相同的黏性末端，便于连接两4分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选练习与应用3.如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是

（从“EcoRⅠ”“BamHⅠ/HindⅢ”“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：

。BamHⅠ/HindⅢ若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点(1)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(2)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(

)(3)E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(

)(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(

)(5)质粒是双链环状DNA分子，是基因工程常用的载体。()××××√【基础过关】2.实验原理：探究·实践·DNA的粗提取与鉴定（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度1.实验设计思路：四DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四

DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。

不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。3.选材：注意：4.试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用5.方法步骤探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四析出DNADNA的鉴定研磨称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。过滤取上清液在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。方法步骤（视频）探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四注意事项1．以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2.利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。3．加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。4．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。5．预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？结果分析与评价

观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。

本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四进一步探究

实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。刑侦破案拓展：DNA提取的应用基因组测序插入人胰岛素基因的大肠杆菌基因工程亲子鉴定探究·实践·DNA的粗提取与鉴定四练习与应用一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是

A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键

B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键

C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键

D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是

A.大肠杆菌的质粒

B.切割DNA分子的酶

C.DNA片段的黏性末端

D.用来识别特定基因的DNA探针CA二、拓展应用1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子?提示：细菌