DB32T-甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程编制说明

甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程（送审稿）编制说明《甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程》编制组2024年8月一、目的意义1.产业发展现状甘蓝类蔬菜作物种类众多，包括结球甘蓝、花椰菜、青花菜、芥蓝、苤蓝、羽衣甘蓝、抱子甘蓝等十余种变种类型，在我国不同地域均有分布和种植。在诸多甘蓝类蔬菜中，结球甘蓝的种植面积约为1400万亩，花椰菜和青花菜种植面积分别约为700万亩和130万亩，在全国蔬菜周年供应及出口贸易中占有十分重要的地位。江苏省是甘蓝类蔬菜的重要产区，播种面积约为200万亩。随着甘蓝类蔬菜栽培面积的逐步扩大及复种指数的提高，由芸薹生链格孢（Alternariabrassicicola）引起的黑斑病呈加重态势。此外，黑斑病菌还能侵染角果，导致种子带菌，从而影响制种产量和质量。2.制定标准的必要性目前生产上缺乏商业化的抗病品种，化学药剂成为防治黑斑病的主要手段。黑斑病菌的准确识别对于化学药剂选择和施药时机把握具有重要生产意义。重组酶聚合酶扩增（recombinasepolymeraseamplification，RPA）是一种新型恒温扩增技术，该技术可在较低恒温（37℃~42℃）条件下，通过重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶的作用，在短时间内实现目标区段的高效扩增。本项目制定的甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程，旨在通过标准化检测，及时掌握黑斑病的发生危害程度，提高黑斑病的防控意识和能力，对促进江苏省甘蓝类蔬菜产业高质量发展具有十分重要的意义。3.制定标准的可行性江苏省农业科学院与江苏省农业技术推广总站在甘蓝类蔬菜病害绿色防控技术研发和推广方面具有良好的合作基础，在国家重点研发计划子课题、江苏省重点研发计划、江苏省农业科技自主创新资金等相关项目的资助下，在黑斑病病原的鉴定与分子检测、抗病种质资源筛选与利用等方面开展了大量工作。本规程是在试验研究的基础上，结合文献查阅而提出，该技术规程可实现目标病原菌的特异灵敏检测，助力黑斑病的长效防控。二、任务来源2023年8月4日，江苏省市场监督管理局发布《关于下达2023年度江苏省地方标准项目计划的通知》（苏市监标〔2023〕173号），下达2023年度343项地方标准制（修）订项目，其中122号《甘蓝类蔬菜真菌性黑斑病快速检测技术规程》标准编制的任务，由江苏省农业科学院、江苏省农业技术推广总站共同负责起草制定。经专家建议和进一步的资料检索，我们发现引起甘蓝类蔬菜黑斑病的病原虽有细菌和真菌之分，但通常只将细菌引起的黑斑病称为细菌性黑斑病，而链格孢属真菌引起的病害则仍称为黑斑病。因此在不改变范围和标准技术内容的基础上，我们对标准名称进行了适当修改，更改后的标准名称为“甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程”。三、编制过程（1）成立编制组2023年8月，收到江苏省市场监督管理局《关于下达2023年度江苏省地方标准项目计划的通知》文件后，立即成立标准起草小组，由余方伟担任组长，曾晓萍、李建斌、马金俊、王神云、张伟、于利6位成员组成。（2）起草阶段2023年8月，起草组系统查阅了十字花科蔬菜黑斑病的病原鉴定、发生规律、综合防控和黑斑病菌分子检测等有关的技术资料，对收集的资料进行全面分析、比较，结合起草组承担的各类国家和省级项目在黑斑病病原分离、分子检测等方面的研究成果，确定了标准的指标设置，并于2024年4月完成初稿，随后召开内部讨论会，根据讨论会意见对文稿进行进一步修改完善，2024年5月形成了征求意见稿。（3）征求意见情况2024年5-8月，将征求意见稿发送至浙江大学、中国农业科学院、北京市农林科学院、南京农业大学、西南大学、福建农林大学、青岛农业大学、安徽农业大学、云南农业大学、山东省农业科学院、重庆三峡农业科学院、宜兴市蔬菜办公室和江苏中江种业股份有限公司等13家单位相关专家征求意见，共征集到来自11个单位11位专家的32条意见，起草小组根据专家意见进行修改完善，最终形成了送审稿。四、标准编制原则和依据（一）标准的编写原则本标准遵循“科学、适度、可行”的原则，严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定进行编写。在标准的征求意见稿和送审稿的编制过程中力求做到技术内容的叙述正确无误，文字表达准确、简单易懂，标准的构成严谨合理，内容编排符合逻辑。制定的标准力求切实可行，易于为相关从业者所掌握和使用。（二）标准的提出依据芸薹生链格孢是引起甘蓝类属蔬菜黑斑病的主要病原。目前，国内尚未正式制定“甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程”的国家或行业技术规程。标准起草小组为解决甘蓝类蔬菜黑斑病菌的RPA检测，前期开展了该检测技术的靶标选择、引物设计、反应体系优化、室内检测的研究。最终，标准起草小组在结合国内外文献检索和现有试验结果的基础上，撰写了基于RPA的甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程。主要参考文献如下：[1]刘焕然,柯桂兰.十字花科蔬菜黑斑病原种群组成及季节变化[J].西北农业学报,1992,1(4):6-10.[2]肖长坤,李勇,李健强.十字花科蔬菜种传黑斑病研究进展[J].中国农业大学学报,2003,8(5):61-68.[3]李明远.十字花科蔬菜黑斑病识别与防治[J].当代蔬菜,2004,(10):34-36.[4]文朝慧,李铁夫,王军平,刘箐,周围.出口萝卜种子中芸薹生链格孢的分离与鉴定[J].植物检疫,2007,21(1):4-6.[5]王汉荣,方丽,任海英,苏英京.青花菜黑斑病的识别与防治[J].中国蔬菜,2010,(5):23-24.[6]王超,张晓烜,王宁宁.甘蓝黑斑病病原菌鉴定[C]//中国园艺学会十字花科蔬菜分会.中国园艺学会十字花科蔬菜分会第十届学术研讨会论文集.2012:5.[7]王莹莹,宋加伟,石延霞,张扬,李宝聚.李宝聚博士诊病手记（八十四）白菜黑斑病病原菌鉴定及防治方法[J].中国蔬菜,2015,(7):72-74.[8]ChoY.HowthenecrotrophicfungusAlternariabrassicicolakillsplantcellsremainsanenigma[J].EukaryoticCell,2015,14(4):335-344.[9]高威芳,朱鹏,黄海龙.重组酶聚合酶扩增技术:一种新的核酸扩增策略[J].中国生物化学与分子生物学报,2016,32(6):627-634.[10]付永文.西兰花黑斑病重发原因与防控技术初探[J].中国农技推广,2016,32(12):47-49.[11]DonosoA,ValenzuelaS.In‐fieldmoleculardiagnosisofplantpathogens:recenttrendsandfutureperspectives[J].PlantPathology,2018,67(7):1451-1461.[12]NowakowskaM,WrzesińskaM,KamińskiP,SzczechuraW,LichockaM,TartanusM,KozikEU,NowickiM.Alternariabrassicicola–Brassicaceaepathosystem:insightsintotheinfectionprocessandresistancemechanismsunderoptimizedartificialbio-assay[J].EuropeanJournalofPlantPathology,2019,153:131-151.[13]冯黎霞,魏霜,余辛,张永江,武目涛,胡学难.重组酶聚合酶扩增技术（RPA）快速检测玉米褪绿斑驳病毒[J].植物保护学报,2020,47(1):217-218.[14]周莹,岳瑾,李云龙,刘梅,乔广行.重组酶介导的等温扩增技术及其在植物病原检测中的应用[J].中国植保导刊,2020,40(6):27-31.[15]马志敏,段玉,许建建,宾羽,周常勇,宋震.基于重组酶聚合酶扩增技术（RPA）的柑橘溃疡病菌检测方法[J].园艺学报,2021,48(3):590-599.[16]马文娣,田逸英,焦志远,周涛,范在丰.重组酶聚合酶扩增技术在植物病原快速检测中的应用[J].植物保护,2021,47(3):1-5+13.[17]沈钰森,王建升,盛小光,赵振卿,虞慧芳,顾宏辉.十字花科植物黑斑病的研究进展[J].核农学报,2021,35(3):623-634.[18]陈永生,崔志超,杨雅婷,管春松,高庆生,刘先才.关于甘蓝类蔬菜种植模式规范化的建议[J].长江蔬菜,2021,(8):20-21.[19]辛竹琳,崔彦娟,杨小薇,孔令博,林巧.全球蔬菜产业现状及中国蔬菜育种发展路径研究进展[J].分子植物育种,2022,20(9):3122-3132.[20]ChenS,YuanH,YanX.RapidvisualdetectionofbenzimidazoleresistanceinBotrytiscinereabyrecombinasepolymeraseamplificationcombinedwithalateralflowdipstick[J].PestManagementScience,2022,78(2):821-830.[21]ClarkKJ,AnchietaAG,daSilvaMB,KandelSL,ChoiYJ,MartinFN,CorrellJC,VanDenyzeA,BrummerEC,KlostermanSJ.Earlydetectionofthespinachdownymildewpathogeninleavesbyrecombinasepolymeraseamplification[J].PlantDisease,2022,106(7):1793-1802.[22]刘志刚,余方伟,张伟,于利,李建斌,王神云,宋江华.甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性[J].江苏农业学报,2023,39(4):947-955.[23]XuJ,YangX,WuC,ChenZ,DaiT.Recombinasepolymeraseamplification-lateralflowdipstickassayforrapiddetectionofFusariumcircinatumbasedonanewlyidentifieduniquetargetgen