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DB34DB34/T2515—2015猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法RT-PCRassayforporcineepidemicdiarrheavirus安徽省质量技术监督局发布I1本标准规定了猪流行性腹泻病毒(porcineepPEDV:猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicPCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreactiRT-PCR:反转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymeraDEPC:焦炭酸二乙酯(diethylpyroTaq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribM-MLV:莫洛尼氏鼠白血病病毒(moloneymurinelPBS:磷酸缓冲液(phosphatebuffersolution)TAE:Tris-乙酸电泳缓冲液(trisa25.11磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,——下游引物5’-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-5.15阳性对照样品:PEDV接种的VE采取病死或剖杀猪的小肠内容物,按1:5倍心管中,8000rpm离心10min,取上清36.2.412000g4℃离心15min,吸取上层水相移入新的离心管中,加将PCR扩增产物5μL与2μL上样缓冲液混合,点样于1%琼脂糖凝胶板加样孔中,琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker(分子质量标准物),缓冲液为1×TAE,以5V/cm电被检样品出现663bp扩增条带为PEDV核酸阳性,未出现663bp41——阴性对照样品;2——阳性对照样品;3、4——阳性样品。5A.1.3量取0.2moL/L磷酸氢二钠溶液36mL,0.2mol/L磷酸二氢钠溶液14mL,称取氯5g,用灭菌去离子水溶解稀释至100A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.——灭菌双蒸水——氢氧化钠——灭菌双蒸水——羟基甲基氨基甲烷(Tris分析纯)——冰乙酸——0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)——灭菌双蒸水

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