T-LNSI 006-2024 人羊膜上皮干细胞库

ICS11.020CCSC05I 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 5建设要求 6管理要求 7通则 8技术要求 9数据管理 10检验方法 11检验规则 12使用说明 14包装、储存及运输 15不合格产品的处理 T/LNSI006-2024T/LNSI006-2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化的文件结构和起草规则》的规定起本文件由沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司、沈阳市再生生物医学重点实验室提出。本文件由辽宁省免疫学会归口。本文件起草单位：沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司、中国医科大学干细胞与再生医学研究室、沈阳市再生生物医学重点实验室、沈阳干细胞与再生医学重点实验室、辽宁艾米奥干细胞与再生医学研究院、辽宁省细胞生物学学会、辽宁省生物技术协会、沈阳市干细胞与再生医学产业技术创新联盟、沈阳药科大学、中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属口腔医院、中国医科大学附属盛京医院、艾米奥国际干细胞医院。本文件主要起草人：庞希宁、庞然、施萍、单风平、王莉莎、赫甡、宋扬、徐东芬、荆晶、姜雯宇、高航、谢光麟、邵锡柱、王竟、孟涛、苏航、张美玲、聂宏光、郎宏鑫、刘晓玉、王喜良、张涛、赵峰、张殿宝、王瑞、李彩虹、李宏图、潘长伟、孔娟、王哲、王蔚、殷军、郭然、张宁、李晓航、王娇。本标准的制订基于相关技术的综合考虑，旨在推动行业的发展和规范化。在编写过程中，团体成员充分研究了现有技术和专利信息，并积极寻求相关权益方的支持和参与。特此声明，在编写本标准期间，我们已经采取了合理的努力来促进并保护涉及的知识产权。鉴于技术的不断创新和发展，如果其他相关专利或权益未在本标准中明确声明，请权益人及时联系标准制定团体，以便进行进一步的沟通和许可。本标准中使用的专利声明如下：[CN201710085128]：[沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司]，[CN]，[人羊膜上皮干细胞库]。以上声明是为了更好地保护知识产权，遵循了国家相关法律法规和知识产权的规定。我们鼓励所有使用本标准的相关方与专利权人合作，以确保公平的利益分配和技术发展。1T/LNSI006-2024人羊膜上皮干细胞库本文件规定了人羊膜上皮干细胞库的构建过程，其中包括制备、冻存、复苏等的规范性操作和推荐方法。本文件适用于医疗机构等构建人羊膜上皮干细胞储备库。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。T/CSCB0009-2022《人干细胞研究伦理审查技术规范》GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T5458液氮生物容器GB50457医药工业洁净厂房设计标准WS213丙型肝炎诊断WS279梅毒诊断WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）中华人民共和国药典（2020年版）全国临床检验操作规程药品生产质量管理规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1羊膜amnioticmembrane2T/LNSI006-2024子宫内包被胎儿的一层薄膜。胎膜的最内层，是人体最厚的一层基底膜。3.2人羊膜上皮干细胞humanamnioticepithelialstemcells位于羊膜的胎儿面，是由胚泡内细胞团发育而来，具有部分胚胎干细胞的特征，可分化为3个胚层不同类型的细胞。具有低免疫原性和无端粒酶活性特性。体外贴壁培养细胞呈不规则多角型，如鹅卵石样连接成片。3.3人羊膜上皮干细胞库humanamnioticepithelialstemcellbank用于储存人羊膜上皮干细胞的专门机构。3.4冻存的细胞cryopreservedcells是指经过程序性降温冷冻，并利用深低温冷冻储存技术，以减少细胞代谢活动，保存其较高的生物学活性而进行长期储存的细胞。3.5非冻存的细胞non-cryopreservedcells是指未经过深低温冷冻储存的活细胞。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CD——分化簇（ClusterofDifferentiation）DNA——脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EBV——疱疹病毒（Epstein-BarVirus）HBV——乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCMV——人巨细胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV——人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR——人类白细胞抗原-DR（HumanLeukocyteAntigen-DR）HTLV——人类嗜T细胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）IDO——吲哚胺2,3-双加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase）IFN-γ——干扰素-γ（Interferon-γ)TNF-α——肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-α)3T/LNSI006-2024PCR——聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）STR——短串联重复序列（ShortTandemRepeat）TP——梅毒螺旋体（TreponemaPallidum）5建设要求5.1总体原则细胞库的选址、设计及布局应综合考虑环境、气候和空气质量等相关情况，应符合《药品生产质量管理规范》的要求。5.2机构设置5.2.1人羊膜上皮干细胞库或其所属机构应是依法成立并能够承担相应法律责任的法人或其他组织。5.2.2人羊膜上皮干细胞库应遵循《药品生产质量管理规范》的要求，设置与质量管理、技术运作相匹配的职能部门。5.2.3人羊膜上皮干细胞库应建立统一领导、分级管理、职责明确的管理机构，并有明确的组织架构5.2.4人羊膜上皮干细胞库管理机构应有相匹配的人员配置，关键人员应至少包括最高管理者、医学负责人、技术负责人、质量负责人等。5.2.5人羊膜上皮干细胞库关键人员职责及能力要求应符合《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》的相关要求6管理要求6.1设备管理6.1.1设备采购及验收6.1.1.1设备采购前应完成性能需求、用途及设备供应商的调研，保证设备符合预期细胞制备及检测要求。6.1.1.2设备采购应签订采购合同。6.1.1.3仪器设备在安装验收合格后，应配置唯一识别码，安装调试记录纳入设备确认文件中。6.1.2设备计量4T/LNSI006-20246.1.2.1具有测量功能的设备应在检定/校准合格后方可投入使用。6.1.2.2设备检定/校准应由有资质的计量单位执行，所有检定/校准的结果和数据须经设备使用部门确认。6.1.2.3设备经修理、更新升级或搬运后，应对其性能是否满足使用要求进行重新确认。6.1.3设备使用6.1.3.1设备现场应配有操作规程。6.1.3.2设备应有明确的状态标识。6.1.3.3设备使用人员应及时填写使用记录。6.1.4设备维护维修6.1.4.1仪器设备均应按照维护规程进行维护保养，并予以记录。6.1.4.2应建立完善的仪器设备维修程序，内部维修人员应经厂家工程师培训考核后方可执行维修工作，委外维修应保留维修记录。6.1.5储存设备管理6.1.5.1人羊膜上皮干细胞库的液氮安全应符合GB/T5458的规定。6.1.5.2应定期检查液氮容量，并建立相应的检查登记制度。6.1.5.3工作人员在操作中接触到液氮时，需使用防护面罩和防冻手套，并做好其它防冻措施。6.2物料管理6.2.1采购6.2.1.1应建立完善的供应商筛选、登记、考察、年度资格评审程序。新增或变更物料供应商应进行质量审计或评估，并对新物料开展试验验证，确认符合细胞产品工艺要求。6.2.1.2应按照《药品生产质量管理规范》的相关要求审查生产商、经销商提供的资质说明及证明材料。6.2.2验收应制定物料质量标准，建立物料接收、检验、放行程序。检验合格的物料方可放行入库；检验不合格的物料，应将信息及时反馈至供应商，在未换货之前应放置在指定区域并加以标识。5T/LNSI006-20246.2.3库存管理应配置与产能相匹配的物料存放区，关键物料（包括采集运输容器、制备、冻存、检测等所用物料）应按厂家说明书和具体的技术要求进行储存。应对未经检验或临时紧急采购的物料进行单独管控。6.2.4使用6.2.4.1物料应严格按照其说明书进行使用，不得超范围使用。6.2.4.2物料使用过程中应及时填写记录，确保其可追溯性。6.3环境控制6.3.1洁净区净化环境检测应采用第三方检测和自检相结合的方式进行，第三方检测应由具有资质的省级以上专业机构进行。6.3.2第三方检测项目应符合GB50457的要求。检测周期不得低于两年一次。6.3.3自检项目应符合GB50457的要求。6.4记录控制6.4.1应建立和保持记录管理程序，对记录的标识、存放、检索、保留和处置加以规范。6.4.2记录内容应覆盖整个管理体系，包括质量记录、技术记录，每项记录信息应充分。6.4.3所有记录的存放条件应有安全保护措施，对电子储存的记录也应采取与书面记录同等措施以防止未经授权的侵入或修改，电子记录应加以备份。6.5文件管理6.5.1应建立控制干细胞库管理体系的内部和外部文件的程序。6.5.2应依据制定的文件管理程序，对文件的编制、审核、批准、发布、标识、变更、和废止等各个环节实施控制。6.6.3保密文件应按保密制度严格管控，不得随意借阅、复印。6.7.4应对文件时效性进行定期检查，防止使用无效或作废文件。7通则7.1方案制定人羊膜上皮细胞库研究项目启动前应当制订工作方案。工作方案的内容包括但不限于：目标与任务、6T/LNSI006-2024操作流程、工作条件、生物安全等级、操作人员资质、供体选择要求、人羊膜上皮干细胞质量控制标准、参考文献等。7.2知情同意人羊膜组织的获取，在充分尊重、告知人体组织提供者权益的前提下签署知情同意书，告知内容包括但不限于：组织的处置方案及可能涉及的应用场景。宜对组织提供者的个人信息进行隐私保护，严禁泄露可识别供体及亲属身份的信息，如：姓名、肖像、证件、社会关系等。7.3隐私保护应当对样本提供者的个人信息采取保密措施。8技术要求8.1原材料和辅料8.1.1应符合T/CSCB0009-2022要求。8.1.2应建立供者细胞采集的供者评估与筛选标准、采集方法、运输标准和交接标准，保证供者和细胞的安全。8.1.3供体应筛查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并记录结果。8.2采集与培养方法8.2.1样本采集8.2.1.1人羊膜组织样本采集应由专业的医护人员完成。8.2.1.2羊膜的采集场所应达到Ⅲ级洁净手术室要求。8.2.2样本运输8.2.2.1样本运输人员应是经过培训合格的专门人员。8.2.2.2羊膜样本的运输温度为2℃~8℃,样本离体时间不宜超过24h。8.2.2.3样本运输过程应受控并建立记录档案。8.2.3样本接收8.2.3.1接收样本时应先检查容器外观有无破损，并记录。7T/LNSI006-20248.2.3.2检查《样本采集信息记录表》的信息是否齐全，确认无误后对样本进行唯一性标识。8.2.3.3用75%的医用酒精对容器外表面进行消毒，依据样本接收标准，对检测达标后的样本进行接收；检测不达标的样本拒收后进行销毁，并做好相应记录。8.2.4分离及提取人羊膜组织样本剪至片状，用胰酶消化法分离人羊膜上皮干细胞。进行人羊膜上皮干细胞原代培养。8.2.5人羊膜上皮干细胞培养根据细胞的生长情况换液和传代。8.2.6人羊膜上皮干细胞冻存冻存细胞程序降温后置液氮中保存。8.2.7人羊膜上皮干细胞复苏取出冻存管进行快速融化、离心洗涤后进行培养。8.2.8人羊膜上皮干细胞溶液人羊膜上皮干细胞溶液应为均质状态，无絮状沉淀，细胞存活率≥90％。8.3关键质量属性8.3.1细胞形态细胞贴壁培养时呈不规则多角型，铺路石样生长，形态均一。8.3.2染色体核型正常核型应为46,XX或46,XY。8.3.3细胞存活率未冻存细胞存活率≥90%且冻存复苏后细胞存活率≥70%。8.3.4细胞标志蛋白CK19、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105表达阳性；CD31、CD34、CD45和CD49d表达阴性。8T/LNSI006-20248.3.5免疫调节经炎症因子（IFN-γ或者IFN-γ联合TNF-α)诱导后表达吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）。与T淋巴细胞共培养能抑制T淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ、TNF-α。8.3.6三系分化具有成骨、成脂和成软骨的分化潜能。8.3.7成瘤性免疫缺陷动物（如小鼠）体内成瘤试验结果为阴性。8.3.8微生物真菌、细菌、支原体、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP为阴性。8.4过程控制8.4.1扩增、冻存、复苏等过程控制应符合T/CSCB0009-2022要求。8.4.2细胞STR检测结果应与供体细胞保持一致。9数据管理9.1数据采集将冻存后的人羊膜上皮干细胞的详细信息（包括供者姓名、年龄、住院号、新生儿性别和化验检查信息等）输入电脑数据库，建立完善的数据档案备查询。9.2人羊膜上皮干细胞库构建按人羊膜上皮干细胞提取日期进行保存，建立可供检索的人羊膜上皮干细胞信息档案，即构建出人羊膜上皮干细胞储备库。9.2.1入库9.2.1.1干细胞产品入库前应有双人复核，确认信息无误。9.2.1.2干细胞入库过程应记录完整，确保信息的可追溯性。9.2.2深低温储存9T/LNSI006-20249.2.2.1干细胞产品应保存在-130℃及以下。9.2.2.2干细胞产品标签及记录应标明保存温度及储存效期。9.2.2.3处于储存状态的干细胞产品未经批准不得随意变更储存位置和状态。9.2.2.4干细胞产品的储存应注意以下事项：——储存区不应存放可对干细胞产品产生不良影响的物料及试剂；——对于浸没在液氮中的干细胞产品应采用避免发生交叉污染的措施——干细胞产品应确保其标识清晰易认。9.2.2.5应制定冻存的干细胞产品稳定性考察计划，定期对储存系统稳定性及干细胞产品活性进行监测。9.2.3出库9.2.3.1应建立干细胞产品出库相关制度。9.2.3.2干细胞产品应经质量评价及负责人审核确认后方可出库。9.2.4非冻存的干细胞产品9.2.4.1确认根据客户要求制备的干细胞产品，应经客户及相关负责人确认。9.2.4.2发放9.2.4.3干细胞产品应经过质量评价，产品合格并经负责人审核确认后发放。9.2.4.4发放时应有双人复核细胞产品及发放信息，并确保细胞产品包装容器的完整性。10检验方法10.1细胞形态二维培养条件下，用明视场细胞显微镜×40倍进行观察。10.2染色体核型按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”项检验。10.3细胞存活率T/LNSI006-2024按照附录A的方法检验。10.4细胞表面标志物按照附录B的方法检验。10.5免疫调节10.5.1诱导IDO表达按照附录C的方法检验。10.5.2抑制T淋巴细胞增殖按照附录D的方法检验。10.5.3抑制T淋巴细胞分泌IFN-γ、TNF-α按照附录E的方法检验。10.6三系分化10.6.1成骨分化按照附录F的方法检验。10.6.2成脂分化按照附录G的方法检验。10.6.3成软骨分化按照附录H的方法检验。10.7成瘤性按照附录I的方法检验。10.8微生物10.8.1真菌按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“1101无菌检查法”项检测。10.8.2细菌T/LNSI006-2024按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“1101无菌检查法”项检测。10.8.3支原体按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“3301无菌检查法”项检测。10.8.4HBV按照《全国临床检验操作规程（2020年版）》核酸法检验。10.8.5HCV按照WS213核酸法检验。10.8.6HIV按照WS293-2019核酸法检验。10.8.7HTLV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。10.8.8EBV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。10.8.9HCMV按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。10.8.10TP按照WS273核酸法检验。11检验规则11.1抽样方法和数量11.1.1在一个生产周期中，同一生产线、同一来源、同一代次、同一方法制备出来的产品为一批。11.1.2在同一批的产品中随机抽取3个最小包装单元。11.2出厂检验T/LNSI006-202411.2.1每批产品应进行出厂检验，并附检验报告。11.2.2出厂检验项目应包括8.3规定的所有项目。11.3复核检验根据需要，应由第三方专业细胞检验机构/实验室进行复核检验，检验项目应包括第8章规定的所有项目。11.4判定规则11.4.1出厂检验项目全部符合8.3规定，判定为合格品；有1项及以上不符合本文件规定，则判为不合格品。11.4.2复核检验项目全部符合8.3规定，判定为合格品；有1项及以上不符合本文件规定，则判为不合格品。12使用说明应至少包括以下内容：a）产品名称；b）细胞代次；c）细胞数量；d）生产日期；e）生产批号；f）生产组织；g）储存条件；h）运输条件；i）使用方法；j）执行标准号；k）生产地址；l）联系方式；m）邮政编码；n）注意事项。T/LNSI006-2024注：根据用户需求，可标注内毒素含量。13标签应至少包括以下内容：c）细胞数量；e）生产组织；f）生产日期。14包装、储存及运输14.1包装非冻存细胞应选择对人羊膜上皮干细胞关键质量属性无影响的袋或瓶中，应选用100毫升0.9%生理盐水袋或瓶。14.2储存14.2.1应符合T/CSCB0009-2022要求。14.2.2冻存的细胞应在低于-130℃环境下储存。14.3运输14.3.1应符合T/CSCB0009-2022要求，应建立运输和转运程序，以确保干细胞产品运输的安全性。14.3.2冻存的细胞应在干冰或低于-130℃条件下运输，非冻存细胞建议在2℃~8℃下运输。14.3.3用于运输和转运干细胞产品的容器，其材质应防漏、抗震、抗压力变化，并应对其安全性进行定期检查。14.3.4干细胞产品在运输或转运前应制定详细计划，并明确以下信息：——确保运输路径和时间最短；——有紧急情况下可替换运输方式的应急计划；——干细胞产品不应通过X射线设备检查；T/LNSI006-2024——能够连续监控转运容器的温度。14.3.5干细胞产品运输和转运过程应有记录。15不合格产品的处理15.1.不符合质量标准的干细胞产品，按照医疗废物处理，应按照T/CSCB0009-2022中的规定处理。15.2储存干细胞产品的处理应经医学负责人批准同意后方可执行。15.3因干细胞产品不合格而导致的退货及召回，应按照《药品生产质量管理规范》执行。T/LNSI006-2024（规范性）细胞存活率检测细胞计数法A.1仪器和设备A.1.1明视场显微镜。A.1.2血球计数板。A.2试剂除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为18.2MΩ去离子水。A.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。A.2.2台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（A.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。A.3检测步骤A.3.1细胞悬液制备收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液（A.2.1）配制细胞悬液，稀释至合适的浓度。每个血球计数板（A.1.2）的1mm2的方格中的细胞数量应为20个~50个细胞。如果高于200个细胞，则需要进行稀释。A.3.2细胞染色按1:1的体积比将台盼蓝染液（A.2.2）与细胞悬液（A.3.1）混合均匀。A.3.3细胞计数将盖玻片盖在血球计数板（A.1.2）计数槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一侧计数室的盖玻片边缘，另取10μL混合液，滴在另一侧计数室的盖玻片边缘，使混合液充满盖玻片和计数板之间，静止30s，将计数板置明视场显微镜（A.1.1）下对被染色的细胞和细胞总数分别进行计数。对16×25规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个1mm2的中格（即100个小格）计数。对25×16规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下和中央5个中格（即80个小格）计数。当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和左线上的细胞（或只计数下方和右方线上的细胞）。按步骤A.3.2~A.3.3在重复测定一个样品。T/LNSI006-2024A.3.4细胞存活率计算A.4计算与分析细胞存活率按式（A.1）进行计算：X=（M―S）/M×100％.........................................（A.1）式中：X—细胞存活率；M—细胞总数；S—染色的细胞数。计算两次计数细胞存活率结果的平均值，记为细胞平均存活率。A.5精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。T/LNSI006-2024（规范性）细胞标志蛋白检测流式细胞法B.1仪器和设备B.1.1流式细胞仪。B.1.2水平离心机。B.1.3电子天平。B.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。B.2.1磷酸盐缓冲液：pH7.4。B.2.2牛血清白蛋白（BSA）：纯度≥98%。B.2.3叠氮钠（NaN3）。B.2.4抗人CK19、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD31、CD34、CD45、CD49d抗体及同型对照抗体。B.2.5按照相应要求使用电子天平（B.1.3）配置流式检测所需的液体：洗涤液、抗体稀释液。B.3样品保存洗涤液和标记后的样品于2℃~8℃保存。相关抗体遵照说明书保存。B.4检测步骤B.4.1样品准备收集细胞，使用水平离心机（B.1.2）300g离心4min，弃上清。然后，用洗涤液清洗1次，使用水平离心机（B.1.2）300g离心4min，弃上清。B.4.2抗体孵育按照抗体说明书进行稀释使用。抗体孵育结束后用洗涤液清洗两遍，使用水平离心机（B.1.2）300g离心4min，弃上清。T/LNSI006-2024B.4.3过滤上机用洗涤液重悬细胞，然后通过40μm滤网转移到流式管中，按流式细胞仪（B.1.1）应用手册上机检测。B.4.4圈门设定原则首先根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞分群1，排除死细胞和其他杂细胞，然后根据Isotype对照组荧光强度，在分群1的基础上画出阳性细胞群2，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。抗体Isotype作为阴性对照。B.5结果分析得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。T/LNSI006-2024（规范性）诱导IDO表达检测PCR法C.1仪器和设备C.1.1核酸含量测定仪。C.1.2PCR扩增仪。C.1.3电泳仪。C.1.4凝胶成像仪。C.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。C.2.1人重组IFN-γ和人重组TNF-α。C.2.2RNA提取试剂盒。C.2.3RNA逆转录PCR试剂盒。C.2.4PCR引物。C.2.5TaqDNA聚合酶。C.2.6Ladder内标。C.3检测步骤C.3.1IFN-γ或IFN-γ+TNF-α处理根据附录A方法测定，计算人羊膜上皮干细胞悬液活细胞浓度。按细胞（1×105~4×105）个/cm2接种，在人羊膜上皮干细胞培养体系中添加IFN-γ（10ng/mL~30ng/mL）或IFN-γ（10ng/mL~30ng/mL）+TNF-α（10ng/mL~30ng/mL），正常培养12h~36h。同时设立未使用IFN-γ或IFN-γ+TNF-α处理的人羊膜上皮干细胞为对照组，培养同样时间。C.3.2人羊膜上皮干细胞总RNA提取根据RNA提取试剂盒产品说明进行，并使用核酸含量测定仪（C.1.1）进行核酸含量测定。C.3.3逆转录PCRT/LNSI006-2024根据RNA逆转录PCR试剂盒产品说明书进行，使用PCR扩增仪（C.1.2）获得cDNA，并扩增IDO基因。C.3.4PCR产物电泳根据电泳应用手册进行电泳检测。C.3.5凝胶成像根据凝胶成像仪应用手册，使用电泳仪（C.1.3），进行电泳检测。C.4结果分析使用凝胶成像仪（C.1.4）进行成像，未使用IFN-γ或IFN-γ+TNF-α处理的人羊膜上皮干细胞检测不到IDO条带，IFN-γ或IFN-γ+TNF-α刺激后检测到IDO条带。T/LNSI006-2024（规范性）抑制T细胞增殖检测CFSE标记法D.1仪器和设备D.1.1血球计数板。D.1.2倒置显微镜。D.1.3水平离心机。D.1.4流式细胞仪。D.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。D.2.1磷酸缓冲液：pH为7.4。D.2.2消化酶。D.2.3台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（D.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。D.2.4植物凝集素。D.2.5淋巴细胞分离液。D.2.6抗体（anti-CD3抗体）。D.2.7羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料。D.3检测步骤D.3.1T细胞分离及染色D.3.1.1T细胞分离利用淋巴细胞分离液（D.2.5分离外周血单核细胞（PBMC用适量无菌磷酸盐缓冲液（D.2.1）使用水平离心机（D.1.3）洗涤2次。然后孵育抗体；用适量无菌磷酸盐缓冲液（D.2.1）使用水平离心机（D.1.3）洗涤2次。重悬细胞至浓度为5×107细胞/mL，40μm滤网转移到流式管中，按流式细胞仪应用手册上机分选。D.3.1.2T细胞染色T/LNSI006-2024根据附录A方法测定，使用血球计数板（D.1.1）及显微镜（D.1.2）计算细胞悬液活细胞浓度。然后进行CFSE标记，根据CFSE产品说明书进行。D.3.2T细胞与人羊膜上皮干细胞共培养D.3.2.1T细胞增殖根据附录A方法测定，使用血球计数板（D.1.1）及显微镜（D.1.2）计算T细胞悬液活细胞浓度，按1×106细胞/mL接种培养，并用（2~5）μg/mL植物凝集素（D.2.4）刺激T细胞增殖，设立未用植物凝集素（D.2.4）刺激的T细胞培养作为对照，培养96h，用于检测刺激后T细胞增殖百分比A。D.3.2.2人羊膜上皮干细胞抑制T细胞增殖利用消化酶消化人羊膜上皮干细胞并制备成单细胞悬液，根据附录A方法测定，计算T细胞与人羊膜上皮干细胞细胞悬液活细胞浓度。人羊膜上皮干细胞按2×105细胞/mL接种，细胞贴壁后，将T细胞按5:1（T细胞：人羊膜上皮干细胞）的比例进行共培养，并用（2~5）μg/mL的植物凝集素（D.2.4）刺激T细胞增殖，培养96h，用于检测人羊膜上皮干细胞抑制后T细胞增殖百分比C。D.3.3T细胞收集并检测收集培养后的T细胞，用适量无菌磷酸盐缓冲液（D.2.1）使用水平离心机（D.1.3）洗涤2次，通过40μm滤网转移到流式管中，按流式细胞仪（D.1.4）应用手册上机检测。D.3.4圈门设定原则首先根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞分群1，排除死细胞和其他杂细胞，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。然后根据未用植物凝集素刺激的T细胞的荧光强度，在分群1的基础上画出CFSE母代细胞位置，根据CFSE母代细胞位置画出自代细胞群2（即为T细胞增殖的百分比）。D.4结果分析得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。并计算人羊膜上皮干细胞对T增殖的抑制率。抑制率按式（D.1）进行计算：Y=（A―C）/A×100％............................................（D.1）式中：T/LNSI006-2024Y—抑制率；A—单独T细胞（刺激）CFSE子代细胞的百分比；C—与人羊膜上皮干细胞共培养T细胞（刺激）CFSE子代细胞百分比。T/LNSI006-2024（规范性）抑制T细胞分泌检测胞内因子染色法E.1仪器和设备E.1.1血球计数板。E.1.2倒置显微镜。E.1.3水平离心机。E.1.4流式细胞仪。E.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。E.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。E.2.2消化酶。E.2.3台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（E.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。E.2.4佛波酯（PMA）。E.2.5淋巴细胞分离液。E.2.6抗体（如：anti-IFN-γ抗体、anti-TNF-α抗体）。E.2.7布雷非德菌素A（BFA）。E.2.8离子霉素。E.2.9皂苷（Saponin）。E.2.104%多聚甲醛。E.3检测步骤E.3.1T细胞分离利用淋巴细胞分离液（E.2.5），分离外周血PBMC，用适量无菌磷酸盐缓冲液（E.2.1）使用水平离心机离心（E.1.3）洗涤2次。然后，孵育抗体（E.2.6）；用适量无菌磷酸盐缓冲液（E.2.1）使用水平离心机离心（E.1.3）洗涤2次。重悬细胞至细胞浓度为5×107细胞/mL，40μm滤网转移到流式管中，按流式细胞仪应用手册上机分选。T/LNSI006-2024E.3.2T细胞与人羊膜上皮干细胞共培养E.3.2.1T细胞炎症因子分泌根据附录A方法测定，使用血球计数板（E.1.1）及显微镜（E.1.2）计算T细胞悬液浓度，按1×106细胞/mL接种培养，培养48h。结束培养前4h~6h往培养体系添加50ng/mL佛波酯（E.2.4）、1布雷非德菌素A（E.2.7）和1μg/mL离子霉素（E.2.8用于检测IFN-γ阳性的T细胞比例A1，和TNF-α阳性的T细胞比例A2。E.3.2.2人羊膜上皮干细胞抑制T细胞炎症因子分泌利用消化酶消化人羊膜上皮干细胞并制备成单细胞悬液，根据附录A方法测定，使用血球计数板（E.1.1）及显微镜（E.1.2）计算T细胞与人羊膜上皮干细胞悬液活细胞浓度，人羊膜上皮干细胞按2×105细胞/mL接种，细胞贴壁后，将T细胞按5:1（T细胞：人羊膜上皮干细胞）的比例进行共培养，培养48h。结束培养前4h~6h往培养体系添加50ng/mL佛波酯（E.2.4）、10μg/mL布雷非德菌素A（E.2.7）和1μg/mL离子霉素（E.2.8），用于检测人羊膜上皮干细胞抑制IFN-γ阳性的T细胞比例C1，和TNF-α阳性的T细胞比例C2。E.3.3T细胞收集并标记收集培养后的T细胞，用适量无菌磷酸盐缓冲液（E.2.1）使用水平离心机离心（E.1.3）洗涤2次，4%多聚甲醛（E.2.10）固定细胞，用适量无菌磷酸盐缓冲液（E.2.1）使用水平离心机离心（E.1.3）洗涤1次，0.1%~0.2%皂苷（E.2.9）处理穿膜，孵育IFN-γ和TNF-α抗体，用适量无菌磷酸盐缓冲液（E.2.1）使用水平离心机离心（E.1.3）洗涤1次，通过40μm滤网转移到流式管中，按流式细胞仪应用手册上机检测。E.3.4圈门设定原则首先根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞分群1，排除死细胞和其他杂细胞，然后根据Isotype组荧光强度，在分群1的基础上画出IFN-γ阳性的细胞群2和TNF-α阳性的细胞群3，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。E.4结果分析得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。并计算人羊膜上皮干细胞对T细胞分泌IFN-γ、TNF-α的抑制率。T/LNSI006-2024抑制率按式（E.1）和式（E.2）进行计算：IFN-γ抑制率=（A1―C1）/A1×100％......................（E.1）式中：A1—单独T细胞的IFN-γ阳性率；C1—与人羊膜上皮干细胞共培养T细胞的IFN-γ阳性率。TNF-α抑制率=（A2―C2）/A2×100％.....................（A.1）式中：A2—单独T细胞的TNF-α阳性率；C2—与人羊膜上皮干细胞共培养T细胞的TNF-α阳性率。T/LNSI006-2024（规范性）成骨分化检测茜素红S染色法F.1仪器和设备F.1.1血球计数板。F.1.2明视场显微镜。F.1.3水平离心机。F.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一级水。F.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。F.2.2消化酶。F.2.3台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（F.2.1）稀释至0.4%（质量浓度）。F.2.4成骨诱导液。F.2.5茜素红S染色试剂盒。F.3检测步骤F.3.1细胞样品的准备F.3.1.1细胞消化使用水平离心机（F.1.3）离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形成气泡或者残留细胞团块。F.3.1.2细胞计数根据附录A方法测定，使用血球计数板（F.1.1）及明视场显微镜（F.1.2）计算细胞悬液活细胞浓度。F.3.2细胞接种并诱导细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成骨诱导液产品说明书，诱导14d~21d。F.3.3钙结节染色T/LNSI006-2024钙结节染色根据茜素红S染色试剂盒说明书进行。F.4结果分析显微镜下可见散在大量橘红色的钙结节。T/LNSI006-2024（规范性）成脂分化检测油红O染色法G.1仪器和设备G.1.1血球计数板。G.1.2明视场显微镜。G.1.3水平离心机。G.2试剂本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为GB/T6682规定的一