熊源性成分检测实时荧光PCR法编制说明

1熊源性成分检测实时荧光PCR法编制说明一、项目来源根据内蒙古自治区市场监督管理局《内蒙古市场监督管理局下达的2020年第2批内蒙古自治区地方标准制修订项荧光PCR法”的计划任务，二连海关牵头成立由相关领域的专业技术人员和具有标准化专业知识的人员组成的标准起草组，组织实施该标准的制定。起草单位：二连海关技术中心，主要起草人：陈少博、王伊琴、杨帆、包勇敢、荆文魁、张志峰、常鸿。二、项目的意义和必要性熊是哺乳纲，食肉目，熊科各种类的通称。广泛分布于欧、亚及南北美洲。按照生物学分类熊科动物分5属8种，分别为熊猫属Ailuropoda(大熊猫Ailuropodamelanoleuca)，眼镜熊属Tremarctos(眼镜熊Tremarctosornatus)，马来熊属Helarctos(马来熊Helarctosmalayanus)，懒熊属Melursus(懒熊Melursusursinus)以及熊属Ursus(棕熊Ursusarctos、美洲黑熊Ursusamericanus、亚洲黑熊Ursusthibetanus和北极熊Ursusmaritimus)。2熊科中熊猫属的大熊猫是全世界所熟悉的中国国宝，熊属中的北极熊、亚洲黑熊和棕熊在动物观赏、制药方面也具有重要意义，熊胆粉为熊科动物黑熊、棕熊经胆囊手术引流胆汁得到的干燥品。具有清热解毒、抑菌抗炎、保肝护肝、利胆溶石、降脂降压、镇咳平喘、去翳明目、抗疲劳等多方面的药理功能。熊胆作为中国传统中医药的主要成分已有两千多年的应用历史，在人类的肝胆疾病、心脑血管疾病、神经系统疾病等诸多病症的治疗上，具有独特的疗效。熊科动物具有很高的经济价值和科学研究价值，它的皮毛、肉、脂、掌等在历史上自古就为猎民用于物资交易的重要产品，由于熊科动物的高额经济回报，在利益的驱使下违法犯罪活动屡禁不止。打击违法犯罪活动，保护野生动物资源，在规范管理和保护执法的过程中，必然要对涉及到的熊科动物进行物种鉴定。根据动物保护名录，除亚洲黑熊和棕熊外，其余熊属物种相继被纳入国际自然保护联盟组织。熊属国家一级保护的哺乳动物，严禁猎杀食用。为加强对熊属动物的保护，限制和打击非法行为，对源自熊的可疑样品建立一种迅速、便捷、高效的检测方法，将具有重要的实际意义。这就要求我们在进出口动物及其制品中准确甄别动物源性，从源头上打击携带、偷运、贩卖熊组织制品行为，建立快速、准确的熊源性成分的检测方法标准势在必行。因此，我们特申请此项制标任务。3我国动物源性成分的检测体系已经日臻完善，包括牛、羊、猪、鸡等家畜家禽源性检测标准（国标或行标）已经实施，以及林麝、穿山甲等野生动物源性的检测标准制定已经立项。黄羊、草原狼、旱獭等动物源性成分检测方法标准率先以内蒙古的地标立项研制，而熊源性成分的检测方法目前还是空白，无国家标准、行业标准和地方标准作为施检依据。为保护濒危野生动物资源，为海关缉私执法提供强技术支撑，急需申请制定该标准。我们申请制订“熊源性成分检测实时荧光PCR方法”标准，将为走私贩卖熊的皮毛或其肉、掌制品的鉴定提供了强有力的科学依据。三、标准的起草过程3.1前期工作项目申请人以及参加人员拥有丰富的科研经历，在动物疫病以及动物源性成分研究领域具备相应的学科专业知识和实验操作技能，能够顺利实施和完成本项目。项目主持人在动物源性成分检测方面开展了大量的工作，积累了较多的经验，应用普通PCR技术、实时荧光PCR技术开展检测鉴定及定量方法；并在动物基因多态性方面取得重大突破，有着应用分子生物学技术，检测动物源性成分有技术优势。项目承担单位动物检疫实验室是区域性中心实验室，负4责本地区及二连口岸检疫性动物疫病检验检疫。现有仪器设备共计100多台套，价值1000多万元人民币。目前，实验室所购置的仪器设备按照自动化、高效化、标准化、高精度化等方向的要求配置，力争达到国内先进水平。仪器设备包括BioRad凝胶成像系统、DNA凝胶电泳系统、倒置显微镜、荧光显微镜、低温培养箱、高速离心机、超速离心机、生物安全柜、酶标仪、液氮罐、基因扩增仪、7500荧光定量PCR仪、全自动核酸提取系统、全自动基因测序仪等。目前已经构建了畜禽疫病分子生物学快速检测平台、动物源性成分检测平台。具备开展本项目的硬件设施条件。承担单位组织保障措施：承担单位二连海关发挥组织作用，通过有效的协调和管理，调动本单位和参加单位的有效资源，形成对项目强有力的支持。通过组织优秀的研究队伍，并通过中期总结会、专家研讨会等形式督促项目研究工作的顺利完成。3.2制订起草计划编写了内蒙古自治区地方标准项目建议书，申请制标计划。项目获批后，制定工作思路和技术路线。同时制定了标准的计划和安排。3.2.1根据试验研究，起草“熊源性成分检测实时荧3.2.2.方法验证、征求意见，2021年3月-2021年125四.制定标准的原则和依据4部分：试验方法标准》的规则编写。还参照相关国家标准编写指南的要求。五.标准内容的研究5.1标准的科学性选择线粒体ND2基因，经过序列比对，选择高度保守的片段做为目的片段。5.1.2标准方法的特异性试验以同种方法提取等量的犬、绵羊、鼠、牛、鸭、猪、鸡、山羊、马DNA为模版，进行实时荧光PCR检测，检测其特异5.1.3标准方法的灵敏性试验熊DNA做10倍的系列稀释，分别进行荧光PCR试验，取6个梯度的NDA浓度，以其对应的稀释倍数对数与Ct值做标准曲线。5.1.4标准方法的重复性试验重复性试验，每次试验设3次重复，共进行3次试验，计算6批内和批间Ct值得变异系数。5.2标准的实用性：适用未知动物源性制品及走私动物制品中熊源性成分的检测鉴定，采用的实时荧光PCR（Real-TimePCR）方法。从DNA水平进行动物源性的检测方法包括普通PCR、实时荧光PCR（Real-TimePCR）、DNA探针杂交、限制性片段长度多态性扩增（PCR-RFLP）等方法。前两种较为常用，而PCR-电泳方法在种源鉴定中应用较多，与实时荧光PCR技术相比，其仪器试剂检测成本较低，但PCR产物需要做凝胶电泳分析，自动化程度低易交叉污染造成假阳性结果，不能满足批量、快速、定量检测需要，因此，以特异性好、灵敏性高引物探针设计策略已逐步成为肉类及其产品种类鉴别的主要方法。5.3标准的可行性：该方法在人、机、料、法、环等各方面因素具备的条件下均易实现。具体说就是具有分子生物学基础的技术人员的配备、荧光PCR仪、实验材料是分子生物学实验材料、方法是特异性好、灵敏度高、重复性好的荧光PCR方法、和具有分子生物学检测的实验室环境均可满足实施该标准方法的检测条件。5.4标准阳性对照的确定采用已知含有熊源性成分的样品，或经测序的阳性质7六.方法验证为验证本方法的有效性和适用性，选择3家相关科研或检测机构，对本方法进行验证，验证内容为方法的特异性和敏感性。3家验证单位进行荧光PCR法验证结果均符合相关样品实际情况。七.重大意见分歧的处理依据和结果无八.国内外情况简要说明动物源性的检测体系已经日臻完善，包括牛、羊、猪、鸡等家畜家禽标准已经实施，以及林麝、穿山甲等野生动物源性的检测行业标准制定已经立项。国内外熊源性成分检测方法的标准目前还是空白，尚无国家标准、行业标准或地方熊源性成分检测方法的标准目前还是空白，无国家标准、行业标准和地方标准作为施检依据。根据文献报道尚未发现内蒙古自治区内有相关单位从事这项研究，因此，急需申请制定该标准。申请制订“熊源性成分检测实时荧光PCR法”标准，将为走私贩卖熊肉或其制品的鉴定（熊源性成分鉴定）的提供了强有力的科学依据。九.结论8综上所述，本标准在制定过程中所涉及到的各项技术指标均经过方法学的验证，并切实可行，完全达到了编制标准的要求。十.标准草稿征求意见情况汇总表序号提出单位/专家采纳不采纳（说明原因）1建议在6实验方法的适当位置加入“样品检测时进行平行样检测”沈阳海关技术中心/耿庆华采纳21.前言部分“GB/T1.1-2009”应改为“GB/T1.1-2020”表述为