旱獭源性成分检测实时荧光PCR方法编制说明

1旱獭源性成分检测实时荧光定量PCR法编制说明一、项目来源根据《下达的2018年第一批内蒙古自治区地方标准修制定项目计划的通知》内质监标函〔2018〕154号，编号为209、题目为“旱獭源性成分检测实时荧光PCR方法”的计划任务，二连海关牵头成立由相关领域的专业技术人员和具有标准化专业知识的人员组成的标准起草组。起草单位：二连海关技术中心，主要起草人：王伊琴、陈少博、包勇敢、杨帆、荆文魁、张志峰、常鸿、赵治国。二、项目的意义和必要性鼠疫(Pestis)是由耶尔森菌引起的自然疫源性人畜共患病，一种高传播性、高致病性、高死亡率的烈性病菌。传染源主要是啮齿动物其中以黄鼠属和旱獭属最为重要。旱獭作为鼠疫杆菌的宿主动物，在鼠疫保存和传播环节上起重要作用，国内外都有捕猎旱獭而感染鼠疫或在贩运的旱獭体内分离出鼠疫杆菌的报道。1926年，伍连德研究证实，满洲里地区的蒙古旱獭是1910、1920年东北肺鼠疫大流行的传染源。在清末的时候旱獭皮毛成为了世界皮革市场上的新宠，在利益的驱使下，中俄商人及地方官员大量招募闯关东的难民疯狂的猎杀旱獭。2在这一过程中，因为利益的驱使以及大量新手对旱獭患病与否不能正确的分辨，于是有人在猎捕的过程中被感染了鼠疫，发生了记入史册的肺鼠疫大流行，其感染方式为猎捕旱獭。蒙古国约有40％的土地为鼠疫自然疫源地，其中大部分为活动性疫源地，对人群感染鼠疫具有潜在的危险性。鼠疫的主要宿主旱獭几乎遍布蒙古国各地，而且数量多，是蒙古国的主要狩猎经济动物，每年约捕获1200万只。旱獭（PrairieMarmots）又名土拨鼠，是野生的经济动物，毛皮珍贵，它漂亮的皮毛几乎可与水獭媲美，其肉鲜美，除了食用外，具有药用价值。内蒙古对蒙古国开放口岸，携带、偷运、贩卖旱獭皮的情况时有发生，仅2017年发生两起较大偷运走私案，7月3日，呼和浩特海关在甘其毛都口岸查获走私旱獭皮2195张。12月6日，内蒙古公安边防总队二连边防检查站官兵例行检查时，查获一起走私旱獭皮300张。携带、偷运、贩卖旱獭皮的经常发生，增加了人与早獭接触和感染鼠疫的机会，时刻威胁我国公共卫生安全。这就要求我们在进出口动物及其制品中准确甄别动物源性，维护公共生物安全体系，从源头上打击携带、偷运、贩卖旱獭皮行为，建立快速、准确的旱獭源性成分的检测方法标准势在必行。因此，我们特申请此项制标任务。我国动物源性成分的检测体系已经日臻完善，包括牛、羊、3猪、鸡等家畜家禽源性检测标准（国标或行标）已经实施，以及林麝、穿山甲等野生动物源性的检测标准制定已经立项。黄羊源性成分检测方法、草原狼源性成分检测方法标准率先以内蒙古的地标立项、研制，而旱獭源性成分的检测方法目前还是空白，无国家标准、行业标准和地方标准做为施检依据。旱獭资源是我们内蒙古特有的野生动物资源之一，急需申请制定该我们申请制订“旱獭源性成分检测方法-实时荧光PCR方法”标准，将为走私贩卖旱獭皮毛或其肉制品的鉴定（蒙古旱獭源性成分鉴定）的提供了强有力的科学依据。三、标准的起草过程3.1前期工作项目申请人以及参加人员拥有丰富的科研经历，在动物疫病以及动物源性成分研究领域具备相应的学科专业知识和实验操作技能，能够顺利实施和完成本项目。项目主持人在动物源性成分检测方面开展了大量的工作，积累了较多的经验，作为野生动物源性成分检测系列地方标准之一的“黄羊源性成分检测实时荧光PCR方法”已经成功发布（DB15/1847-2020）。应用普通PCR技术、实时荧光PCR技术开展检测鉴定及定量方法；并在动物基因多态性方面取得重大突破，并且在朊蛋白基因多态性方面以第一作者发表了2篇SCI文章。应用分子生物学技术，检测动物源性成分有技术优4项目承担单位动物检疫实验室是区域性中心实验室，负责本地区及二连口岸检疫性动物疫病检验检疫。现有仪器设备共计100多台套，价值1000多万元人民币。目前，实验室所购置的仪器设备按照自动化、高效化、标准化、高精度化等方向的要求配置，力争达到国内先进水平。仪器设备包括BioRad凝胶成像系统、DNA凝胶电泳系统、倒置显微镜、荧光显微镜、低温培养箱、高速离心机、超速离心机、生物安全柜、酶标仪、液氮罐、基因扩增仪、7500荧光定量PCR仪、全自动核酸提取系统、全自动基因测序仪等。目前已经构建了畜禽疫病分子生物学快速检测平台、动物源性成分检测平台。具备开展本项目的硬件设施条件。承担单位组织保障措施：承担单位二连海关技术中心发挥组织作用，通过有效的协调和管理，调动本单位和参加单位的有效资源，形成对项目强有力的支持。通过组织优秀的研究队伍，并通过中期总结会、专家研讨会等形式督促项目研究工作的顺利完成。3.2制订起草计划，形成征求意见稿编写了内蒙古自治区地方标准项目建议书，申请制标计划。项目获批后，制定工作思路和技术路线。同时制定了标准的计划和安排。3.2.1根据试验研究，起草“旱獭源性成分检测方法实5时荧光PCR方法”草案。2018.10-12月；四、制定标准的原则和依据本标准遵循GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》和GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》的规则编写。还参照相关国家标准编写指南的要求。五、标准内容的研究5.1标准的科学性5.1.1旱獭目的基因序列的比对选择线粒体(mtDNA)细胞色素b(Cytb)基因，经过序列比对，选择高度保守的片段做为目的片段。5.1.2标准方法的特异性试验以同种方法提取等量的兔、绵羊、鼠、牛、鸭、猪、鸡、狼、骆驼、山羊、马、旱獭DNA和水（空白对照）为模版，进行实时荧光PCR检测，检测其特异性。5.1.3标准方法的灵敏性试验从旱獭组织提取的DNA做10倍的系列稀释，分别进行荧光PCR试验，取6个梯度的NDA浓度，以其对应的稀释倍数对数与Ct值做标准曲线。5.1.4标准方法的重复性试验从旱獭组织提取的DNA做10倍系列稀释，取100-10-5稀释6DNA模板进行重复性试验，每次试验设3次重复，共进行3次试验，计算批内和批间Ct值的标准差和变异系数。5.2标准的实用性：适用食品、饲料及动物组织中旱獭源性成分的检测鉴定，采用的实时荧光PCR（Real-TimePCR）方法。从DNA水平进行动物源性的检测方法包括普通PCR、实时荧光PCR（Real-TimePCR）、DNA探针杂交、限制性片段长度多态性扩增（PCR-RFLP）等方法。前两种较为常用，而PCR-电泳方法在种源鉴定中应用较多，与实时荧光PCR技术相比，其仪器试剂检测成本较低，但PCR产物需要做凝胶电泳分析，自动化程度低易交叉污染造成假阳性结果，不能满足批量、快速、定量检测需要，因此，以特异性好、灵敏性高引物探针设计策略已逐步成为肉类及其产品种类鉴别的主要方法。5.3标准的可行性：该方法在人、机、料、法、环等各方面因素具备的条件下均易实现。具体说就是具有分子生物学基础的技术人员的配备、荧光PCR仪、实验材料是分子生物学实验材料、方法是特异性好、灵敏度高、重复性好的荧光PCR方法、和具有分子生物学检测的实验室环境均可满足实施该标准方法的检测条件。5.4标准阳性对照的确定采用已知含有旱獭源性成分的样品，或经测序的阳性质粒。六、方法验证7为验证本方法的有效性和适用性，选择3家相关科研或检测机构，对本方法进行验证，验证内容为方法的特异性和敏感性。3家验证单位进行荧光PCR法验证结果均符合相关样品实际情况。七.重大意见分歧的处理依据和结果无八.国内外情况简要说明动物源性的检测体系已经日臻完善，包括牛、羊、猪、鸡等家畜家禽标准已经实施，以及林麝、穿山甲等野生动物源性的检测行业标准制定已经立项。“黄羊源性成分检测实时荧光测方法标准（申报国家发明专利、延期审定）率先以内蒙古的地标立项、研制，国内外旱獭源性成分检测方法的标准目前还是空白，尚无国家标准、行业标准或地方标准。旱獭源性成分检测方法的标准目前还是空白，无国家标准、行业标准和地方标准作为施检依据。旱獭资源是我们内蒙古特有的野生动物资源之一，也是鼠疫重要的易感动物。根据文献报道尚未发现内蒙古自治区内有相关单位从事这项研究，因此，急需申请制定该标准。申请制订“旱獭源性成分检测-实时荧光PCR法”标准，将为走私贩卖旱獭肉或其制品的鉴定（旱獭源性成分鉴定）的提供了强有力的科学依据。8九.结论综上所述，本标准在制定过程中所涉及到的各项技术指标均经过方法学的验证，并切实可行，完全达到了编制标准的要十.标准草稿征求意见情况汇总表序号意见提出单位/专家采纳不采纳（说明原因）1建议将标准中引用的规范性文件去除年号兰州海关综合技术中心/张宇霞采纳2建议在“5.1样品的选取与制备中”增加“动物源性饲料的采样标准然后用表格表示兰州海关综合技术中心/张宇霞采纳3建议在5实验方法的适当位置加入“样品检测时进行平行样检测”沈阳海关技术中心/耿庆华采纳4请斟酌规范性引用文件是否均需加年号呼和浩特海关技术中心/赵治国采纳5建议“6.1质量控制”内容简要描述呼和浩特海关技术中心/赵治国采纳6建议在适当位置增加“生物安全措