分子生物学教案内容实验

讲次1日期2013-11-11节次1-2,3-4节

授课内试验一试验基础仪器设备及基本技授课学

容能时2

通过板书、实物演示、操作等教学方式，让学生初步学习和驾驭分

教学目子生物学试验的基本学问和基本技能，了解分子生物学试验常用仪器

的设备，熟悉常用仪器设备、耗材。

教学重分子生物学试验的基本技术和技能，分子生物学试验中常用的仪器

卢设备运用方法及留意事项。

教学难

占

/、、、分子生物学试验中常用的仪器设备运用方法及留意事项。

教具

和

媒体运

用黑板教学

教学方

法讲授法、操作演示法

课程介绍分钟

教5

新课讲授90分钟

1.分子生物学试验规程

学

2.分子生物学试验设备

1）温度限制系统：冰箱：4℃、-20℃,-70℃样品、试剂和材

过料等的保存

2）恒温培育箱：细菌平板的培育

3）恒温空气摇床；菌体的培育

程4）灭菌器：培育基、试剂、耗材等的灭菌

5）仪：扩增、保温试验等

6）恒温水浴及微量加热器：保证明验温度的恒定

7）电泳仪：电泳时供应电压和电流

8）电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架

9）凝胶成像系统：电泳结果的定性和定量分析

⑼紫外分析仪：电泳结果的定性分析

11）台式高速冷冻离心机：样品的分别

⑵分光光度计：样品的定量测定

13）超净工作台：供应干净工作环境

14）计：精确的值测定

15）移液器；液体试剂的精确取量

16）制冰机：保证操作过程中温度的恒定

总结5分钟

思索题1、完成一篇分子生物学试验平安预案。

讲次2日期2013-11-13节次1-2,3-4节

授课内授课学

容试验二试验准备及试验规范训练时2

教学目学会分子生物学常用仪器设备的运用方法和试剂的配制方法，配制试

的验三所需的药品

教学重

点分子生物学常用仪器设备的运用方法和试剂的配制方法

教学难

/占、、、配制试验三所需的药品

教具

和

媒体运黑板教学

用

教学方

法讲授法、试验操作法

上节课程总结5分钟

新课学习90分钟

1.分子生物学试验仪器训练

学生以小组为单位，操作分子生物学主要试验仪器。

2.分子生物学基本技术

2.1试验规范训练一仪器的操作

要求：

①仪器在未经培训前，不得擅自运用

教

②严格按操作规程运用仪器，

学③有些仪器必需有老师在场时才能运用，并由老师操作

④违反规定的运用者，造成的后果由运用者担当

过

2.2试验规范训练一量程的选择

程①天平

②烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶不同规格

③量程的选择一移液器

2.3试验规范一试验操作

①详细记录和分析试验结果并按时提交试验报告

②试验中确定要到处用心、勤动手，多问为什么

③细致操作和视察

④保留好每一步的试验样品，在确准的状况下才能当废液扔掉

3.配制试剂：

蛋白酶K购自美国公司；、、、饱和酚、三氯甲烷、无水乙醇、硼

酸、冰乙酸等均购自北京及其他国内外化学试剂公司。

提取所用相关溶液的配制(试剂的配制若无特别要求，均以蒸馈

水为溶剂，高压灭菌条件为121℃(1.034X105)、25)：

⑴1M(8.0)：称121.1g,溶于800蒸播水中，用磁力搅拌

器搅拌，用浓调至8.0,定容至1000,分装后高压灭菌。

⑵0.5M(8.0)：称186.1g溶于800蒸储水中，用调至8.0,

加水定容至1000,高压灭菌。

⑶0.5M：5.844g溶于双蒸水中，定容至200,高压灭菌。

(4)(10%)：在900水中溶解100g电泳级，加热至68℃助溶，

用盐酸调至7.2,加水定容至1000,过滤膜过滤，室温保存，无需

灭菌。

(5)组织提取液配方：1M(8.0)5,0.5M(8.0)20,0.5M

20,10%10,双蒸水45。

(6)蛋白酶K(20)：200蛋白酶K溶于10双蒸水，以1分装，

20℃冻存。

总结5分钟

1、完成训练过程，记录仪器使用心得。

思索题

2、配制试剂中出现何问题？如何处理？

2013-11-18

讲次3

日期2013-11-20节次1-4节

授课内授课学

试验三组织基因组的提取

容时4

教学目

的驾驭动物总的抽提方法和基本原理。

教学重

点动物总的抽提技术和基本原理。

教学难

点动物总抽提的基本原理。

教具

和

媒体运

用黑板教学

教学方讲授法、试验操作法

法

上节课程总结5分钟

教

新课学习190分钟

学

一、试验目的：

过二、试验原理：

十二烷基硫酸钠（，简称）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜

程和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使得以游离出来。再加入苯酚和氯

仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（、）水溶

性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上

清液中加入无水乙醇使沉淀，沉淀溶于溶液中，即得动物物总溶液。

三、试验材料：

猪皮肤组织

四、主要仪器

低温冰箱，冷冻高速离心机（美国），移液器，制冰机

五、步骤：

用眼科手术剪将约0.3g组织块剪碎，置于1.5离心管里，干燥

20

加入5001组织提取液

加入蛋白酶K至终浓度为150g,充分混匀，55℃消化12-2411

（以组织样消化完全，呈透亮状为宜）

加入等体积的饱和酚，缓慢颠倒离心管10使溶液的两相充分混匀，

4℃12000,离心10

转移上清至另一离心管中，重复上一步骤1〜2次。

转移上清至另一离心管中，再分别用等体积的苯酚:氯仿(1:1),

氯仿，

4℃12000,离心10

教转移上清至另一离心管中，加入1/10体积的3M(5.2)和2倍体

积的冰冻无水乙醇沉淀，和顺的上下颠倒几次

学

将沉淀挑出，置于1.5离心管。

过

将自然晾干(留意不能太干，否则不易溶解)后溶入适量1义或超

纯水中备用。

程(较超纯水要更好，可以使更稳定)

总结、分析5分钟

ffl#日所

作业

1、完成试验报告，基因组提取过程中各组分的作用是什么？

2、本试验操作的关键点是什么？

讲次4日期2013-11-21节次1-2,3-4节

授课内授课学

容试验四琼脂糖凝胶电泳时2

教学目

的通过本试验驾驭琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理和操作技术。

教学重

/占、、、琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理和操作技术。

教学难

点琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理

教具

和

媒体运

用黑板教学

教学方

法讲授法、试验操作法

教

上节课程总结5分钟

学

讲授25分钟

过一、试验目的

二、试验原理

程

琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种自然聚合长链状分子，沸

水中溶解，45c起先形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小确定于琼

脂糖的浓度。分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极

泳动。分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。不同，

其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的

区带。琼脂糖凝胶电泳法分别，主要是利用分子筛效应，迁移速度和

分子量的对数值成反比关系。漠化乙锭()为扁平状分子，在紫外照

射下放射荧光。可和分子形成复合物，其放射的荧光强度较游离状态

放射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度和的含量成正比。用肉眼视

察，可检测到5以上的。但是有致畸和致癌性，本试验中用和相像功

能但未发觉致畸和致癌性的作为核酸染料。

三、试验材料及相关试剂

基因组，琼脂糖，50X,上样缓冲液

四、主要试验仪器：

电泳仪、水平电泳槽、微波炉、紫外分析仪。

五、试验步骤

(1)制胶(以30为例)

a.称取0.24g琼脂糖，加入30的IX缓冲液(8.0),摇匀。

b.微波炉上加热，至琼脂糖完全溶解；

C.用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖

（约50℃）,加入适量核酸染料，倒入制胶板中，在室温下

冷却凝固（约30〜45）；

d.将制胶板置于电泳槽中，当心垂直向上拔出梳子，以保证点样

孔完好。

（2）点样

教（3）电泳

学打开电源开关，调整电压至130V,可见到漠酚蓝条带由负极

向正极移动，约20分钟后即可视察。

过

（4）视察

程将电泳好的胶置于紫外分析仪，可见到绿色核酸条带，依据条带粗

细，可粗略估计该基因组的浓度。

试验操作55分钟

总结、分析10分钟

思索索题题完完成成试试验验报报告告，对本组组试试验操作关键点及结结果果进进行分析？？

作业

2013-11-25

讲次5日期2013-11-27节次1-4节

授课内授课学

容试验五扩增及检测时4

教学目通过本试验驾驭反应的基本原理,的基本操作技术以及琼脂糖凝

的胶电泳技术检测产物。

教学重

占

/、、、学习的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术检测产物。

教学难

占

/、、、的基本操作技术

教具

和

媒体运

用黑板教学

教学方

法讲授法、试验操作法

教

讲授新课25分钟

学一、试验目的

二、试验原理

用于扩增位于两端已知序列之间的区段，即通过引物延长而进行

过的重复双向合成。基本原理及过程如下：

循环过程中有三种不同的事务发生：（1）模板变性；（2）引物退

火；（3）热稳定聚合酶进行合成。

程1.变性：加热使模板在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键

断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2.退火：在体系温度降至37-65℃,模板和引物按碱基配对原则

互补结合，使引物和模板链3'端结合，形成部分双链，即退火阶段。

3.延长：体系反应温度升至中温72℃,耐热聚合酶以单链为模

板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核昔三磷酸（）,

按5,到3,方向复制出互补，即引物的延长阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延长3个阶

段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的量应当增加一倍，新形

成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25〜30个循环后可扩增

IO'〜十倍。

典型的反应体系由如下组分组成：模板、反应缓冲液、、2、两条合

成的引物、耐热聚合酶。

三、试验材料及相关试剂

基因组，基因特异性引物，扩增相关试剂，等

四、试验仪器

仪，电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪、电炉

五、试验步骤

1.模板：试验二所得基因组。

2.操作(在冰上操作)：

教(1)反应混合液的配制：反应体系25叱，在无菌的0.2离心管中

按下列操作程序加样：

反应物体积/NL

学

2。18.2

10x2.5

2.52

过10上游引物1

10下游引物1(2)将管放到热

循聚合酶0.3环仪中，按下列程序

程起先循环：

94℃4(预变性L|94℃30,"60℃30,72℃30f72℃8

30个循环

3.产物检测

试验操作170分钟

总结、分析5分钟

思索题1.反应液中主要成分是哪些？在反应过程中各起什么作用？

2.用扩增目的基因，要想得到特异性产物需留意哪些事项？

作业

2013-12-2

讲次6日期2013-12-4节次1-3,7节

授课内授课学

容试验六技术分析基因多态性时4

教学目驾驭聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用技术进行基因分

的型。

教学重

/占、、、聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析基因多态性的原理及操作技术，基因分型

教学难

点聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，基因分型

教具

和

媒体运

用黑板教学

教学方

法讲授法、试验操作法

教

讲授新课40分钟

一、试验目的驾驭聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用

技术进行基因分型。

学二、试验原理聚合酶链反应-单链构象多态性分析（，）

是近年来发展起来的一种基因分析方法。其基本原理为：将扩增产物

变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性

过聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链的迁移率除和链的长短有关外，更主

要的是取决于单链所形成的构象。在非变性条件下，单链可自身折叠

形成具有确定空间结构的构象。这种构象由单链碱基确定，其稳定性

程靠分子内局部依次的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的单

链其依次不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率

也不同。产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶中含

单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等变更时，因迁移率变更会出现

泳动变位，从而可将变异和正常区分开。由此可见，分析技术是一种

单链凝胶电泳技术，它依据形成不同构象的等长单链在中性聚丙烯酰

胺凝胶中的电泳迁移率变更来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌

基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、

基因制图等领域。

三、试剂准备

1.相关试剂

2.30%聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g,

溶于1002。中，4℃保存。

3.10%过硫酸胺配制方法：1g过硫酸胺，溶于102。中，4c保存

（可用数周）。

4.（N,N,N,N',N'-四甲基乙二胺）

5.5X缓冲液：碱54g、硼酸27.5g、0.5M（8.0）20,加20至1000。

6.变性上样液：95%甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%漠酚蓝、20

（8.0）

四、操作步骤

1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：

清洗制胶用的玻璃板并用蒸储水冲洗干净，晾干，运用时安装电

泳板

（注：安装时把胶条在蒸馈水中润湿可以起到封闭玻璃板和胶条间

缝隙的作用）

在100小烧杯内加入适量（表4-1）的40%的丙烯酰胺、5X、10%

教的过硫酸镂、和水，混匀后快速灌胶

I

当胶灌至离玻璃板上沿1时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30左

右，

多余的丙烯酰胺4℃保存，随时视察凝胶聚合状况再补加丙烯酰

学胺

凝胶聚合好后，拔掉梳子，立刻用IX冲洗点样孔

向电泳槽中加入IX,200V预电泳20,同时准备点样

过

21产物置于管中，加81变性缓冲液，98℃变性10

快速冰浴10,上样

接通电源，电压160V-180V,16℃下电泳12-15h

程

（S1〜S18在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的最佳条件见表4-3）

2.银染视察电泳结果：

电泳结束后关上电泳仪，当心取出凝胶，用去离子水快速洗胶1

遍

置于20%乙醇中固定15

用去离子水快速洗胶1遍

I

用1%硝酸氧化3

用去离子水快速洗胶1遍

用0.1%硝酸银染色30

用去离子水快速洗胶1遍

用去离子水快速洗胶1遍

用500显色液（加入针尖大的一粒硫代硫酸钠，4001甲醛）

显色

待条带清楚后，倒去显色液，用去离子水快速洗胶1遍

用4%醋酸停显

保鲜膜封好保存或拍照

五、留意事项

1、核酸片段的大小：用于分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。

对于＜200的片段，可发觉其中70%的变异；对于300左右的片段则只

能发觉其中50%的变异；而＞500的片段，则仅能检出10%〜30%的

变异，因此，＜300,尤其是150左右的核酸片段更适于分析。对于大

于400的产物就须要设法进一步处理，可以用限制性酶消化产物，产

生小于400的片段，再进行分析。

2、低浓度变性剂：凝胶中加入低浓度的变性剂，如5%-10%甘油、

5%尿素或甲酸胺、10%二甲亚碉（）或蔗糖等有助于提高敏感性，可

能是因为略微变更单链的构象，增加分子的表面积，降低单链的泳动

率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。

3、电泳温度：一般认为保持凝胶内温度恒定是分析最关键的因素，温

度有可能干脆影响分子内部稳定力的形成及其所确定的单链构象，从

而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数状况，但由于在电泳时温

度会上升，为确保电泳温度相对恒定，应实行以下措施：削减凝胶厚

度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。

4、凝胶浓度及厚度：凝胶浓度很重要，一般运用5%〜8%的凝胶，

凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，假如在进行未知突变种

思索题

作业简述聚丙烯酰胺凝胶电泳分析基因多态性的原理？

讲次7日期201312-5/9节次1-4节

授课内授课学

容试验七目的片段的纯化时4

教学目

的驾驭从琼脂糖凝胶中回收。

教学重

点从琼脂糖凝胶中回收的技术。

教学难

点提高琼脂糖凝胶中回收纯度和回收率的关键步骤。

教具

和

媒体运

用黑板教学

教学方

法讲授法、试验操作法

教

讲授新课25分钟

学

一、试验目的驾驭从琼脂糖凝胶中回收。

二、试验原理琼脂糖凝胶具有分子筛作用，通过琼脂糖凝胶电泳把

产物进行分别，然后在紫外灯下切取目的片段，用胶回收试

剂盒进行纯化。

三、试验材料

过产物，管，离心管架，1000、200枪头，一次性滤膜（0.22）,

大量碎冰，胶回收试剂盒。

四、试验仪器设备

微量移液器（20u1,200u1,1000u1）,高压蒸汽消毒器（灭菌锅）,

离心机，恒温水浴锅，冰箱等。

程五、操作步骤

①向胶块中加入3倍体积的溶胶液，50℃水浴10（依据凝胶溶

解状况可以适当延长或缩短时间），并不断和顺的翻转离心管以充分混

匀胶块；

②胶块完全溶解后，待胶溶解液降至室温（以提高吸附柱对的吸

附实力）转入吸附柱中（加入后室温静置1左右，以提高吸附柱的吸

附实力），12000离心1,弃去收集管中的废液；

③加入7001漂洗液，12000离心30s,弃去收集管中的废液;

④加入5001漂洗液，12000离心30s,弃去废液；

⑤将吸附柱放回收集管中，12000离心2,尽量除去残留的漂洗

液；

⑥将吸附柱置于室温或50°。干燥箱数分钟，彻底晾干（以防止残

留的漂洗液影响回收效率和质量）；

⑦将吸附柱放入一新的离心管，加入351洗脱液，（洗脱液在

65〜70℃中预热，以提高洗脱效率），室温放置2,12000离心1。

⑧假如需回收更多，可将上一步离心得到的溶液重新步骤⑦。

⑨琼脂糖凝胶电泳检测回收的片段。

试验操作170分钟

总结、分析5分钟

思索题

作业从琼脂糖凝胶中回收留意事项有哪些？如何提高回收效率？

2013-12-11/12

讲次8日期2013-12-18/19节次1-4节，1-2节

授课内授课学

容试验八重组时6

教学目把体外重组的引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出

的重组子。

教学重

占

八、、驾驭重组技术及重组子鉴定的方法和原理

教学难

占

/、、、重组子鉴定的原理

教具

和

媒体运

用黑板教学

教学方

法讲授法、试验操作法

教

讲授新课40分钟

一、试验目的把体外重组的引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，

学并从中选择出重组子。

二、试验原理外源和载体的连接就是重组，由连接酶完成的。19T

的基因区域当有片段插入时，基因失活，转化进入大肠杆菌

并在含有和培育基生长时，会产生白色的克隆，不含插入片

段的19T质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。

过三、材料

19T质粒，已纯化的产物，大肠杆菌感受态，管，离心管架，1000、

200枪头，9培育皿，一次性滤膜（0.22）,大量碎冰

四、设备

微量移液器（20u1,200P1,1000u1）,高压蒸汽消毒器（灭菌锅）,

培育箱，离心机，恒温水浴锅，恒温摇床，超净工作台，双蒸水器，

程

冰箱，培育箱等。

五、试剂准备

1.固体培育基

2.液体培育基

3.氨节青霉素

4.二甲基甲酰胺

5.：5-溟-4-氯-3-叫噪-6-半乳糖甘：将溶于二甲基甲酰胺，配置

为20,不用过滤灭菌，分装，黑暗保存在-20℃。

6.：异丙基硫代-8半乳糖昔，2g溶于8双蒸水，再补水到10,用

一次性滤膜（0.22）过虑灭菌，每份1,保存在-20C。

7.19T连接试剂盒

8.无水乙醇

9.70%乙醇

10.灭菌双蒸水20

六、试验操作

1）连接反应体系（101）：

纯化的产物41

19T11

教I51

混合匀整，16°C12h（一般16C30,但为保证较高的连接效率,

尤其是对于2以上片段最好延长连接时间）。

2）转化

①取501感受态细胞，置于冰浴中，待溶化后用预冷的吸头加

学入51连接产物，轻轻旋转以混匀（不要用移液器吹打），在冰中放

置30；

②将管在42℃水浴中放置45s,不要摇动；

③快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1;

④每管加5001培育基，置于37℃摇床振摇（振摇速度大于150

转/分，但最好不要超过转/分）培育，使细胞复苏；

过17060

⑤准备含100氨茉青霉素的琼脂糖培育基平板，加401

（20）、81（100）,用无菌的弯头玻棒涂布匀整；

⑥取④中已转化的感受态细胞2501（剩余的已转化的感受态细

胞置于4℃留存）转移到上述平板上，将细胞涂布匀整（注：弯头玻

棒用前先在酒精灯上灼烧，待其温度降至不烫手再起先涂布）；

程

⑦将平板置于室温直至液体被吸取（大约须要2h）；

⑧倒置平板，于37c培育12〜16h（注：不要超过16h,否则可

能产生杂的卫星菌落）；

⑨将平板4c放置约3h,使蓝白斑更分明；

⑩挑取白色菌落加入到培育基（含100氨节青霉素），37