从男性尿液中提取尿激酶并进行活性测定实验报告

PAGE“设计性实验”项目申请书项目名称从男性尿液中提取尿激酶并进行活性测定项目负责人申卓凡年级、专业2014级唐敖庆班化学方向联系电子邮件shenzhuofan01@填表日期2016年月日国家级生物实验教学示范中心制表填表说明1、本申请书适用于各门实验课程的设计实验。2、《设计性项目申请书》要按顺序逐项填写。填写内容要实事求是，讲究诚信，不能有雷同；表达要明确、严谨。空缺项要填“无”。3、格式要求：（1）一律用A4纸打印，于左侧装订成册。（2）字体：中文用宋体，英文和数字用Times

New

Roman字体，行距为1.5倍行距。（2）一级标题：标题编排应采用“（一）、（二）、（三）”等依次分级编号，左起缩进2字符，宋体加黑，字号为小四号。（3）二级标题：标题编排应采用“1、2、3、”等依次分级编号，左起缩进2字符，宋体加黑，字号为五号。（4）内容：字号为五号，每段第一行左起缩进2字符。4、“设计性实验”项目每人填写一项。5、参考文献按照国家标准《文后参考文献著录规则》(GB7714-87)要求书写。6、本《申请书》各页不够可自行加页项目名称从男性尿液中提取尿激酶并进行活性测定经费5000（元）起止时间2016年6月至2016年8月负责人学号姓名年级专业联系电话E-mail12140916申卓凡2014级唐敖庆班化学方henzhuofan01@163.com一、立项背景和依据（一）研究目的尿激酶（简称UK）是一种从人尿中提取的药物，在临床上被用于溶栓剂，预防和控制心肌梗死、高血压、动脉硬化等；具有抗肺癌转移作用，可用于治疗癌症；能降低精液黏稠度，促使精子和卵子结合受孕。UK通常从健康新鲜尿液中分离得到，该法因原料易得、价钱便宜而被广泛应用。由于UK有着重要的医疗价值，所以许多研究报导了各种从尿液中分离、提纯尿激酶的方法。但这些方法都面临着两个方面的问题：第一，提取和纯化的收率要高，尽可能保留酶的总活力；第二，精制后产品的比活要达到一定的高度。本项目研究的目的就是为了提高分离和提纯的效率。（二）国内外研究现状分析对于提取、纯化尿激酶的方法，国内外已有许多报导。目前，从已发表的文章和专利来看，从尿液中分离、提纯尿激酶主要有这些思路：①发泡法：向尿液通气发泡，收集泡沫，滴加消泡剂使泡沫液化，使尿液得以浓缩，加入沉淀剂使尿激酶沉淀得到粗品；②沉淀法：在尿液中加入沉淀剂，使尿激酶沉淀得粗品；③吸附法：采用最多的方法。选择适当的吸附剂选择性吸附尿激酶，然后将其洗脱得尿激酶粗品。常用的吸附剂有硅胶、树脂等；④离子交换法；⑤超滤法。（三）研究意义因人尿中尿激酶的含量很低，取得尿激酶的关键在于如何从大量的尿液中富集尿激酶。从上世纪70年代至今，国内对尿激酶的提取工艺一直不尽人意。国内生产的尿激酶粗品仅有一部分制成精品，不少粗品直接出口由外商加工精制销售赚取利润。对尿激酶纯化技术进行研究，利国利民，具有显著的经济效益和社会效益。（四）主要参考文献[1]生物化学教研室尿激酶组.尿激酶(人尿)的分离与精制——(Ⅰ)尿激酶的分离[J].吉林大学自然科学学报,1979(2).[2]刘兰英,孙中武,尹洪滨,等.以732阳离子交换树脂为吸附剂分离尿激酶的研究[J].吉林大学自然科学学报,1981(4).[3]赵新燕,刘艳.尿激酶的分离与纯化研究[J].现代制造,2013(5):21-24.[4]祝一锋,蔡志亮,赵忠睦,等.尿激酶精制新工艺[J].浙江工业大学学报,1998(1):63-66.[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].二部.2015年版.北京:中国医药科技出版社,2015:532-533.[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].四部.2015年版.北京:中国医药科技出版社,2015:96-97.二、项目研究内容（一）项目主要研究内容该项目主要设计了一套从新鲜男性尿液中提取、纯化尿激酶并进行酶活力测定的实验方案。（二）拟解决的关键问题1、提取和纯化的收率问题人尿中尿激酶的含量很低，取得尿激酶的关键在于如何从大量的尿液中高收率地富集尿激酶。纯化尿激酶的各步骤中，如何在提高比活倍数的同时尽量保存尿激酶的总活力也是一个关键问题。2、精制粗品时提高比活的问题精制后产品的比活要达到一定的高度，药用尿激酶要求达到临床上“安全有效”的纯度。（三）创新点1、高效本项目提供了与其他方案相比更加高效的一系列从尿液中分离、纯化尿激酶的实验方法。以732阳离子交换树脂作为尿激酶吸附剂，比其他传统方法提取收率高约10%。2、低成本本实验方案设计较为科学，在保证效果的前提下，通过不同试剂使用量及其效果的对比，能做到尽量节约。且没有用到不必要的昂贵设备。3、较为简便本实验流程设计尽量减少了繁琐无必要的操作步骤，以求快速高效。三、项目实施方案（一）研究思路由于报道的现有许多种分离、提纯方法各有优缺点，所以计划采取文献中记载的各种路线的不同可取部分来综合设计实验方案。（二）技术路线1、从尿液中分离尿激酶的路线2、提纯尿激酶粗品的路线（三）研究方法拟通过树脂吸附法从新鲜尿液中提取粗品尿激酶，再通过一系列凝胶层析和离子交换层析精制纯化尿激酶粗品。同时每一步操作得到的样品都用发泡法测定酶活力（IU/mL或IU/mg）。最后用Folin-酚法测定精制后尿激酶粉末的蛋白质含量，换算出比活（IU/mg）。（四）实施计划1、从尿液中分离尿激酶粗品①碱化除沉淀将新鲜男性尿液用5mol/LNaOH溶液调至pH值为9.0，静置1小时，虹吸上清液，弃去灰白色的沉淀。②732阳离子交换树脂树脂吸附尿激酶将虹吸的上清液用5mol/L盐酸调到pH值为5.3—5.5，加3%（W/V）732树脂，搅拌吸附1.5小时。停止搅拌后，树脂自然下沉。虹吸去掉残余尿液，收集吸附有UK的树脂。③洗涤用0.1mol/L，pH值5.5的磷酸缓冲液（体积为上清液的10%），搅拌洗涤0.5小时。虹吸去上清液。再以0.1mol/L、pH值6.4的磷酸缓冲液搅拌洗涤0.5小时。虹吸去上清液，收集树脂。④洗脱第一次洗脱：用2%氨水（用量为pH9.0的上清液的3.5%）搅拌洗脱1.5小时。第二次洗脱：以同样量的洗脱液搅拌洗脱0.5小时，抽滤收集洗脱液。合并两次洗脱液，测量其体积。⑤硫酸铵沉淀按洗脱液体积加入固体硫酸铵，不断搅拌使其溶解，并使其饱和度达65%。用5mol/L盐酸调到pH值为8.6。于0—-2℃下沉淀8小时。冷冻离心收集棕色的尿激酶粗品沉淀。2、尿激酶的精制①SephadexG-50凝胶过滤除盐将UK粗品用预冷至0一5℃的无热原蒸馏水溶解，制成UK含量为(2—3)*104IU/mL的UK水溶液，立即用冷冻离心机分离，收集上清液，用2mol/L盐酸或2mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.5。将此溶液上SephadexG-50凝胶柱（此柱预先用pH6.5，0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡），上样体积控制在柱床体积的15%—25%，收集流出液中含UK的部分。②CM-SephadexC-50离子交换层析预先用pH6.5，0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡CM-SephadexC-50离子交换层析柱。将上一步收集到的UK溶液上平衡过的离子交换层析柱，加1个床体积的柱平衡液洗涤后，用0.6mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集UK活力部分。③硫酸钠沉淀在上一步收集的UK溶液中缓缓加人固体硫酸钠（430g/L），边加边搅拌，直至加入的硫酸钠溶解，立即用冷冻离心机分离，收集UK沉淀物。④Bio-GelP–30凝胶过滤将上一步收集的UK沉淀物用0—5℃的无热原蒸馏水溶解，制成UK含量为(5—10)*104IU/mL的溶液，上Bio-GelP–30凝胶柱（此柱预先用0.3mol/L的氯化钠溶液平衡），上样量控制在柱床体积的8%—12%，随时监测流出液的UK活力，收集第一个流出峰部分，即H-UK部分。⑤产品的除菌及冷冻干燥将上述工序收集的H-UK溶液添加1%—5%的甘露醇作赋形剂（加量多少依产品效价要求和冷冻干燥情况而定），用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，立即进行冷冻干燥，冷冻干燥后的UK为粉状产品，密封于容器内，置0—5℃下保存。3、尿激酶的活性测定（气泡法）①试剂的配制牛纤维蛋白原溶液：取牛纤维蛋白原，加巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）溶解并稀释制成每1mL中含6.67mg可凝结蛋白的溶液。牛凝血酶溶液：取牛凝血酶，加巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）溶解并稀释制成每1mL中含6.0单位的溶液。牛纤维蛋白溶酶原溶液：取牛纤维蛋白溶酶原，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH9.0）溶解并稀释制成每1mL中含1—1.4酪蛋白单位的溶液（如溶液浑浊，离心，取上清液备用）。混合溶液临用前取等体积的牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液，混匀。②UK标准品溶液的制备取UK标准品，加巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）溶解并定量稀释制成每1mL中含60单位的溶液。③UK供试品溶液的制备取前面步骤得到的尿激酶样品适量，精密称定，加巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）溶解并定量稀释制成与标准品溶液相同浓度的溶液，摇匀。④测定法取试管4支，各加牛纤维蛋白原溶液0.3mL，置于37℃±0.5℃水浴中，分别加巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL，依次加标准品溶液0.lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL，再分别加混合溶液0.4mL，立即摇匀，分别计时。反应系统应在30—40秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即计时。每个浓度测3次，求平均值（3次测定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%）。以尿激酶浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液浓度，计算每1mg供试品的酶活力（单位）。⑤空白实验以0.9%氯化钠溶液作空白液，同上述方法操作（试剂的配制同上述酶活力测定步骤）。4、尿激酶中蛋白含量的测定（Folin-酚法）①Folin试液的配制取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400mL使溶解，作为甲液。取酒石酸钾0.5g，加水50mL使溶解；另取硫酸铜0.25g，加水30mL使溶解，将两液混合作为乙液。②对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水溶解并制成每1mL中含0.2mg蛋白的溶液。③UK供试品溶液的制备精密称量经上述步骤提取、精制的尿激酶粉末约10mg，用0.9%氯化钠溶液定量稀释，制成每1mL中蛋白质含量约0.2mg的溶液。④绘制标准曲线精密量取对照品溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置具塞试管中，各加水至1.0mL，再分别加入Folin甲试液1.0mL，摇匀，室温放置10分钟。各加入Folin乙试液4.0mL，立即混匀，室温放置0.5小时，照紫外-可见分光光度法，在650nm波长处测定吸光度，同时以0号管作为空白。以蛋白质含量与其相对应的吸光度计算线性回归方程。⑤测定法精密量取供试品UK溶液适量，依照相同方法测定。从线性回归方程计算UK供试品溶液中的蛋白质含量并乘以体积倍数，即得10mg尿激酶粉末中的蛋白质含量。由3和4的结果可以计算所得尿激酶蛋白质的比活，即每1mg蛋白质中所含的酶活力单位数，单位是IU/mg。（五）预期结果用732阳离子交换树脂从尿液中吸附尿激酶，预期平均收率约为70%-80%，比活为600-800CTA/mg尿激酶粗品；依2中的步骤纯化尿激酶，预期平均总收率为60%左右，比活提高总倍数能稳定在50倍以上，这些结果说明该实验方案的可行性较高。用气泡法测定尿激酶的活性时，混合液摇匀计时后预期应在30-45秒内凝结，且凝块在15分钟内重新溶解。以0.9%氯化钠溶液作空白，同法操作时，凝块在2小时内不溶。尿激酶样品的活性、蛋白含量、比活取决于实验具体操作情况。四、拟利用资源（一）仪器设备冷冻离心机，层析柱，0.22μm微孔滤膜，恒流泵，紫外检测仪，恒温水浴锅，紫外-可见分光光度计。（二）实验材料新鲜尿液，蒸馏水，732树脂（100—220目），5mol/LNaOH溶液，5mol/L盐酸，0.1mol/LpH5.5磷酸缓冲液，0.1mol/LpH6.5磷酸缓冲液，2%氨水，硫酸铵，2mol/L盐酸，2mol/LNaOH溶液，SephadexG-50凝胶，CM-SephadexC-50离子交换树脂，0.6mol/LNaCl溶液，Bio-GelP–30凝胶，0.3mol/LNaCl溶液，甘露醇，牛纤维蛋白原，牛凝血酶，牛纤维蛋白溶酶原，pH7.8巴比妥-氯化钠缓冲液，尿激酶标准品，pH9.0三羟甲基氨基甲烷缓冲液，0.9%氯化钠溶液，Folin甲、乙试液，牛血清白蛋白。五、教师评语与成绩实验成绩：指导教师（签名）：