微生物检测实验指导

微生物检测实验指导

刘后伟、林丹琼、刘旭光

适合专业：绿色食品加工专业

食品营养与检测专业农产品检测专业

实训一显微镜的操作与使用

实验1:显微镜的构造、性能与使用方法

1.目的要求

(1)熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。

(2)学习并掌握油镜的原理与使用方法。

2.基本原理

显微镜由机械装置与光学系统两大部分构成。

*M«

♦油镜物镜的基本原理

微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜(16mm,10X),高倍物镜(4mm,

40—45X)与油镜(1.8mm,95—100X)三种。油镜通常标有黑圈或者红圈，也有

的以“01字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不一致放大倍数的目镜,

可使被检物体放大1000-2000多倍。油镜的焦距与工作距离(标本在焦点上看得最

清晰时，物镜与样品之间的距离)最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时,

镜头离标本十分近，需特别小心。

使用时，油镜与其他物镜的不一致是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔

一层油质，称之油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=l.52,与玻璃

相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。假如玻片与

物镜之间的介质为空气，则称之干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象,

进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。

许柏油nl.alt

蠹玻片

利用油镜不但能增加照明度，更要紧的是能增加数值孔径，由于显微镜的放大效能

是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称之镜口

角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：

NA=n,sina

式中NA=数值孔径；

n=介质折射率；

a=最大入射角的半数，即镜口角的半数。

因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图川-5）,该角度的大

小决定于物镜的直径与焦距。同时，a的理论限度为90°,sin90°=1,故以空气为

介质时（n=l）,数值孔径不能超过1,如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔

径也随之增大。如光线入射角为120°,其半数的正弦为sin60°=0.87,贝人

以空气为介质时：

NA=1XO.87=0.87

以水为介质时：

NA=1.33X0.87=1.15

以香柏油为介质时：

NA=1.52X0.87=1.32

显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔

径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微

镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨

力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成

是多少微米或者纳米，这实际上是把分辨力与最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分

辨力是用可分辨的最小距离来表示的。

能辨别两点之间最小距离=/;

式中光波波长。

我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55um,假如数值孔径为0.65的高倍物

镜，它能辨别两点之间的距离为0.42um»而在0.42口m下列的两点之间的距离就

分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只

有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。比如用数值孔径为1.25的汕镜时,

能辨别两点之间的

最小距离=;^K=0.22Wm。

乙xI.ZJ

因此，我们能够看出，假如使用放大率为40倍的高倍物镜（NA=0.65）,与放大

率为24倍的目镜，尽管总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0.42um。假

如使用放大率为90倍的油镜（NA=1.25）,与放大率为9倍的目镜，尽管总的放大

率为810倍，但却能分辨出0.22um间的距离。

3.材料及器材

显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、微生物制片标本等。

4.方法与步骤

（1）观察前的准备

A.置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3—4cm。镜检者姿势要端正，

通常用左眼观察，右眼便于绘图或者记录，两眼务必同时睁开，以减少疲劳，亦可练

习左右眼均能观察。

B.调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置

与镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或者显微镜灯照明。

调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时

光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平

面镜；光线较弱的天然光源或者人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均

匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可

通过扩大或者缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。

(2)低倍镜观察

检查的标本3先用低倍镜观察，由于低倍镜视野较大，易发现目标与确定检查的位

置。

将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处

在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约0.5cm处，由目镜观察，如今

可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢

升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清晰时为止，然后移动标本，认

真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。

(3)高倍镜观察

将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。

然后由目镜观察，并认真调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起

镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，

将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。

(4)油镜观察

A.用粗调节器将镜筒提起约2cm,将油镜转至正下方。

B.在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

C.从侧面凝视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎

与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也

会损坏镜头。

D.从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升,

直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像,

务必再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。

E.用同样的方法观察枯草芽抱杆菌染色标本。

F.观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸醮少许二甲苯

(香柏油溶于二甲苯)擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。

切忌用手或者其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。

G.将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚

光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。

5.实验作业

(1)分别绘出你在低倍镜、高倍镜与油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽抱杆菌

的状态，包含在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数与总放大率。

(2)在使用高倍镜与油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？

(3)用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？

实训二培养基的配制与灭菌

实验目的

1.明确培养基的配制原理。

2.掌握配制培养基的通常方法与步骤。

实验内容

学习细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物培养基的配制。

实验原理

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或者积存代谢产物的营养基质，用以培

养、分离、鉴定、储存各类微生物或者积存代谢产物。

各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。培养细菌常用牛肉

膏蛋白陈培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或者马

铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或者马铃薯葡萄糖培养基。另外还有固体、

液体、加富、选择、鉴别等培养基之分。在这些培养基中，就营养物质而言，通常不

外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂只是固体培养基的支持物，

通常不为微生物所利用。它在96c以上熔化成液体，而在45℃左右开始凝固成固体。

在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就能够配制出适合不一致种类微生物生长

发育所需要的培养基。

培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度与渗透压。霉

菌与酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。因此每次配制培养基时，都

要将培养基的pH值调到一定的范围。

牛肉膏蛋白陈培养基配方

牛肉膏3.0g

蛋白陈10.0g

NaCl5.0g

水1000mL

pH7.4~7.6

高氏I号培养基配方

可溶性淀粉20g

NaCl0.5g

KNO31g

K2HPO4•3H2O0.5g

MgSO4•7H2O0.5g

FeSO4•7H2O0.01g

琼脂15—25g

水1000mL

pH7.4~7.6

马铃薯培养基配方

马铃薯(去皮)200g

葡萄糖(或者蔗糖)20g

琼脂15~25g

水1000ml

自然pH

察氏培养基配方

蔗糖30g

NaNCh2g

K2HPO4lg

KCI0.5g

MgSO4-7H2O0.5g

FeSO4-7H2O0.01g

琼脂15~25g

蒸储水1000ml

自然pH

实验及器材

牛肉膏，蛋白陈，NaCL琼脂，Imol/LNaOH,Imol/LHCl,KNO3,K2HPO4-3H2O,

MgSO4.7H2O,FeSO4-7H2O,马铃薯，蔗糖等。

试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，pH试纸(pH

5.5-9.0),棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

实验步骤

1.牛肉膏蛋白豚培养基配制方法

(1)称量：按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白陈、NaCL放人烧杯中。

牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或者表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可

按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如略微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，

然后立即取出纸片。

蛋白陈很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛

角匙用于一种药品，或者称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不

要盖错。

(2)溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上

加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，假如配制固体培养基时，

将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所缺失的水分。

在琼脂溶化过程中，应操纵火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时.需不断

搅拌.以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或者铁锅加热溶化，以免离子进

入培养基中，影晌细菌生长。

（3）调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,假如偏酸，用滴管向培

养基中逐滴加入Imol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达

7.6»反之，用mol/LHCL进行调节。

关于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。

pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂

培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应

将培养基的成分与琼脂分开灭菌后再混合，或者在中性pH条件下灭菌，苒调整PH。

⑷过滤

趁热用滤纸或者多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。通常无特殊要求的情

况下能够省去（本实验勿需过滤）。

⑸分装

按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或者三角烧瓶内。

1）液体分装：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而

定，通常以不超过三角瓶容积的一半为宜，假如是用于振荡培养用，则根据通气量的

要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生

素等，则装量一定要准确。

2）固体分装：分装试管，其装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶

的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

3）半固体分装：试管通常以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

图1-1培养基的分装

A漏斗分装装置：B自动分装装置

1铁架；2漏斗；3孔胶管；4弹簧夹；5玻璃；6流速调节；7装量调节；8开关

分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。

（6）加塞

2

图1-2棉塞的制作

培养基分装完毕后，在试管口或者三角烷瓶口上塞上棉塞(或者泡沫塑料塞及试

管帽等)，棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的

污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断

地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的

棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在

口内，2/5在口外。

⑺包扎

加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝

水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记

号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

(8)灭菌

将上述培养基以0.103MPa,121℃,20min高压蒸气灭菌。

(9)搁置斜面

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端捆

在玻棒或者其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

(10)无菌捡查

将灭菌培养基放人37℃的温室中培养24-48h,以检查灭菌是否完全。

2.高氏1号培养基配制方法

(1)称量与溶化

按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加

入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成

分依次逐一溶化。对微量成分FeSCU-7H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后

再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO49比0配成0.01g/ml,再在1000mL

培养基中加1mL的0.01g/ml的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到

所需的总体积。如要配制固体培养基，其溶化过程同牛肉膏蛋白陈培养基配制方法。

(2)pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基配制方法。

3.马铃薯培养基配制方法

取去皮马铃薯200g,切成小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min,注意用玻棒

搅拌以防糊底。然后用双层纱布过滤，取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），

加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补足失水。再按前所述，进行分装、加塞、包

扎、0.1MPa灭菌20min。

4.察氏培养基配制方法

方法同牛肉膏蛋白豚培养基配制。

实验结果及讨论

针对实验原理、步骤、现象进行讨论。

实验作业（选做3题）

1.牛肉膏应置于何种容器中称量为宜？

2.配制高氏合成一号培养基时，可溶性淀粉需经什么处理后才能倒入到沸水中？

3.何谓培养基的自然pH?

4.培养基配好后，为什么务必立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的

5.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么？

6.配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入?天然培养基为什么不需要另

加微量元素？

7.有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时

要注意各类营养成分的比例？

8.你配制的高氏I号培养基有沉淀产生吗?说明产生或者未产生的原因。

9.细菌能在高氏I号培养基上生长吗?为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施？

实训三革兰氏染色法

1.目的要求

熟悉革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。

2.基本原理

革兰氏染色反应是细菌分类与鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创

立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染

色反应呈蓝紫色的称之革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色(复染颜色)

的称之革兰氏阴性细菌，用G-表示•细菌关于革兰氏染色的不一致反应，是由于它

们细胞壁的成分与结构不一致而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁要紧是由肽聚糖形

成的网状结构构成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中

的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，

呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙

醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出

而脱色，然后又被染上了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不一致的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂与复染液。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染

色的初染液通常是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料与细胞之间的亲与性或者附着

力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂

是将被染色的细胞进行脱色，不一致类型的细胞脱色反应不一致，有的能被脱色，有

的则不能，脱色剂常用95%的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不一致于初

染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不一致于初染液的颜色，而未被脱色的细胞

仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+与G-两大类群，常用的复染液是番红。

3.材料及器材

(1)大肠杆菌，枯草芽抱杆菌

(2)革兰氏染色液，载玻片，显微镜等

4.方法与步骤

(1)涂片将培养14―16小时的枯草芽抱杆菌与培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注

意涂片切不可过于浓厚)，干燥、固定。固定时通过火焰1一2次即可，不可过热，

以载玻片不烫手为宜。

(2)初染加草酸镂结晶紫一滴，约一分钟，水洗。…

(3)媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。…

(4)脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚

不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。

(5)复染用番红液染1一2分钟，水洗。

(6)镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散

开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

(7)同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽泡杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染

为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，

如阳性菌培养时间过长，或者已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

革兰氏染色过程：

单兰氏染检过41

5.实验作业

(1)在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌与枯草芽抱杆菌各染成何色？它们是革

兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？

(2)作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？

当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，如何能确证你的染色技术操作正确，结果可

靠？

实验四乙酰甲基甲醇试验(VP试验)

一、实验目的

熟悉鉴别不一致肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法

二、原理

某些细菌在葡萄糖蛋白陈水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合、脱

竣成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白

陈中的服基生成红色化合物，称之V.p(+)反应。

CH3CH3CHaNH3N=CH-CH3

111//

co—co一CO+NH=C-NH=C

111\\

COOHCHOHcoNH3N=CH-CH3

11

CH3CH3

三、实验材料

⑴菌种大肠埃希氏菌(Escherichiacoli),枯草芽抱杆菌(Bacillussubttilis)的斜面

菌种。

(2)培养基葡萄糖蛋白陈水培养基的试管

(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。

四、方法与步骤

发酵液试管T标记一接种一培养一观察T记录。

(1).标记试管

取5支装有葡萄糖蛋白陈水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普

通变形杆菌、枯草芽泡杆菌与空白参照。

(2).接种培养

以无菌操作分别接种少量菌至以上相应试管中，空白参照管不接菌，置37℃恒

温箱中，培养24℃48h。

(3).观察记录

a.取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入35mL

以上对应管中的培养液，再加入400g/L氢氧化钠溶液10~20滴，并用牙签挑人约

0.5~lmg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶人，置37℃恒温箱中保温15℃30

min.

b.也能够取上述试管，加入与培养液一半的6%的蔡酚，摇匀，再加入培养液1/3

的40%氢氧化钠溶液，充分摇匀，观察结果。

五、实验结果

若培养液呈红色，记录为V.P试验阳性反应（用“+”表示）；若不呈红色，记录

为V.P试验阴性反应（用表示）。

注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。

实验五甲基红试验(M.R试验)

一、实验目的

1、熟悉鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理.

2、学习甲基红试验的操作技术。

二、原理

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解

中，由于糖代谢的途径不一致，可产生乳酸等有机酸。培养液T指示剂T珀酸、醋酸

与甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH4.5下列，使甲基红指示剂变红。

三、实验材料

(1)菌利1同V.P试验

(2)培养基同V.P试验

(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。

四、方法与步骤

于V.P试验留下的培养液中，各加入2~3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，认

真观察培养液上层。

五、实验结果

若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“+”

或者表示。

实验六口引跺试验

一、实验目的

1、掌握口引噪试验（Ehrlich法）的原理与方法：

2、学习叫噪试验（Ehrlich法）试验的操作技术。

二、原理

有些细菌含有色氨酸酶。能分解蛋白陈中的色氨酸生成叫躲（靛基质）。"弓|1味本身

没有颜色，不能直接看看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与口引跺作

用.形成红色的攻瑰㈣|1味。

三、实验材料

⑴菌种大肠杆菌（Esch~ichiacoli）,枯草芽抱杆菌。

（2）培养基蛋白陈水培养基。

（3）其它二甲基氨基苯甲醛溶液，乙酸，酒精灯，接种针，恒温箱等。

四、方法与步骤

标记试管一接种—培养―观察一记录。

取装有蛋白陈水培养基的试管3支，分别标记大肠杆菌、枯草芽抱杆菌与空白参

照。置37c恒温箱中培养24~48h。

在培养基中加入乙醛经充分震荡使口弓I噪萃取至乙醛中.静置片刻后乙醛

层浮于培养液的上面。如今沿管璧缓慢加入5~10滴口引跺试剂（加人口引跺试剂后切勿摇

动试管，以防破坏乙醛层影响结果观察）.

五、实验结果

如有口引睬存在，乙醛层呈现玫瑰红色，此为口引跺试验阳性反应，否则为阴性反应，

阳性用阴性用表示。

实验七8一半乳糖昔酶试验

一、实验目的

1、熟悉B-半乳糖甘酶试验的用途与原理：

2、学习B-半乳糖甘酶试验的操作技术。

二、原理

在邻硝基酚B-D-半乳糖昔培养基(ONPG培养基)中含有邻硝基酚B-D-半乳糖昔

与pH7.5的O.Olmol/L的磷酸缓冲液。当试验产生8-半乳糖甘酶时，邻硝基酚P-D-

半乳糖甘被水解，释放出邻硝基酚，此物为酸碱指示剂，它的指示范围是pH6.8(无

色)一pH8.6(黄色)，故能使pH7.5的培养液成为黄色，否则不变色。

三、实验材料

⑴菌利।大肠杆菌(Esch~ichiacoli),爱得华氏菌(Edwardsiellasp)

(2)培养基ONPG培养基

(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。

四、方法与步骤

取ONFG培养基试管三支，于其上分别做好培养基名称与“大肠杆菌”、“爱檀

华氏苗”、“空白参照”等标记，然后分别将试验菌相应地接人ONPG培养基中，连

同参照，置36℃土培养1〜3h与24h,观察结果。

五、实验结果

试管中培养基颜色变黄者为该试验阳性，记“十”号，否则记“一”。

实验三含碳化台物的利用试验

一、实验目的

学会测定某菌能否利用某一含碳化合物的方法。

二、原理

细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌是否含有代谢这种含碳化

合物有关的酶，因而可作为鉴定的根据。做这项测定的基础培养基配方很多，因酶的

种类而异.培养基可制成液体分装试管，也可加1.5%—2%水洗琼脂制成平板。可

用来测定的底物种类很多，有单糖类、双糖类、糖醇类、脂肪酸类、羟基酸类、各类

有机酸类、醇类、各类氮基酸类、胺类与磺氨化合物等。糖的含量通常为1%,醇类、

酚等底物在培养基中含量通常为0.1%—0.2%,氨基酸的含量通常为0.5%。因碳氢

化合物不溶于水，可在液体中撮搞培养或者加入45℃左右的固体培养基中，用力振

荡后立即倒成平板。有些底物不宜加压灭菌，可用过滤法灭菌后加入无菌的基础培养

基中，某些醇类与酚类则不需灭菌。

三，实验材料

⑴菌种大肠杆菌(E.coli)与枯草芽抱杆菌(B.subtilis)。

(2)培养基细菌基础培养基(附录m—5)。试验时，往基础培养基中加糖类1%或者

醇、酚0.1%—0.2%,或者氨基酸0.5%。

四、方法与步骤

将实验菌种首先制成悬液，以避免带人少量碳源而干扰实验结果.平板接种用接

种环点种，液体培养基用直针接种.每一测定苗都务必接种未加碳水化合物的空白基

础培养基作参照。适温培养2、5、7D后观察。

五、实验结果

凡测定菌在有碳水化合物的培养基中的生长情况明显超过在空白基础培养基的

生长量者为阳性，否则为阴性。如两种培养基上生长情况差别不明显，可在同一培养

基上连续移种三次，如差别仍不明显，则为阴性。

实验四丙二酸盐试验

一、实验目的

1、熟悉丙二酸钠试验的用途及原理.

2、学习丙二酸试验的操作技术。

二、原理

由于微生物的酶系统不一致，故有的菌能利用醋酸盐作为氮源，有的菌则不能，

当醋酸盐被分解利用后，培养基中产生碱性物质，使培养基县碱性，促使培养基中酸

碱指示剂麝香草酚蓝由绿色变成蓝色，可利用此反应来鉴别有关微生物。

三、实验材料

⑴菌种大肠杆菌(Esch~ichiacoli)及沙门氏菌(Salmonellasp)

(2)培养基丙二酸钠培养墓(附录HI—6)。

(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等.

四、方法与步骤

取丙二酸钠培养基试管三支，于其上分别做好培养基名称与“大肠杆菌”及“沙门

氏菌"及“空白参照”等标记。然后对应地将菌种接入丙二酸钠培养基试管中，连同

空白参照置于37℃恒温箱培养48h,观察结果。

五、实验结果

培养基由绿色变成蓝色者，说明实验菌能利用醋酸盐作为碳源，故丙二酸钠实验

结果为阳性,，记“十”号，培养基不变蓝色者为阴性，否则记“一”。将观察结果以

表格方式记录。

实验五葡萄糖钱试验

一、实验目的

1）熟悉葡萄糖钱试验的用途及原理。

2）学习掌握葡萄糖钱试验的操作技术。

二、原理

有的菌种能利用镂盐作为氮源而生长，有的菌则不能用，在葡萄糖钱培养基中。

磷酸二钱是唯一的氮源，故以能否在该培养基上生长来作为鉴别有关细菌的根据之

O

三、实验材料

1）菌种大肠杆菌（Escherichiacoli）与福氏志贺菌（Shigelleflexneri）

2）培养基葡萄糖镂培养基（附录W-8）,普通营养琼脂斜面。

3）其它酒精棉球，酒精灯，接种针，无菌生理盐水8mL（二支）.

四、方法与步骤

1）做标记取葡萄糖核培养基、普通营养琼脂斜面、无菌生理盐水个2支，分

别于其上做好培养基名称与菌名等标记。

2）制备菌悬液将苗种相应接人理盐水管内，研磨并搅动使其均匀。要求每

一接种环内含菌数在20-100个为宜（或者肉眼观察不见浑浊）。

3）接种用无菌接种环分别取大肠杆菌菌液一环，在对应的葡萄糖钱斜面培养

基与普通营养琼脂斜面培养基上划线接种，并以同样的方法接种福氏志贺

菌。

4）培养将种接好的试管置36℃土恒温箱培养24h,观察结果。

五、实验结果

在葡萄糖钱斜面上有正常大小菌落生长者为葡萄糖钱试验阳性，记“十”号；不

生长或者只生长为极微小的菌落，而在参照培养基上生长良好者，为阴性，否则记

“一”。将观察结果以表格方式记录。

实验六酪蛋白分解试验

一、实验目的

(1)熟悉酪蛋白分解试验的用途及原理.

(2)学习酪蛋白分解试验的操作技术.

二、原理

某些菌具有酪蛋白分解醐，而有的菌则不具有。具有酪蛋白分解酶的细菌在蛋

白琼脂平板上可分解酪蛋白而令菌落周围形成透明圈。

三、实验材料

(1)菌种蜡样牙狗杆菌与球形芽泡杆菌。

(2)培养基酪蛋白琼脂培养基平板(附录川一19)

(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等。

四、方法与步骤

以划线接种法将试验菌接种于酪蛋白培养基上，然后置37C恒温箱培养1—2d后,

观察结果

五、实验结果

平板中菌落周围有透明圈者，为酪蛋白分解试验阳性。反之为阴性.

***注：1、培养基在倒时要摇匀(由于酪蛋白不溶解)

2、倒好后，培养基放置时间要较长(凝固时间较长)

实验七细胞色素氧化酶试验

一、实验目的

(1)熟悉细胞色素氧化酶试验的用途与原理.

(2)学习细胞色素氧化醐试验的操作技术.

二、原理

在不以氧为直同意氢体的生物氧化体系中，生物氧化需要在多种酶联合作用下方

能进行。构成这类生物氧化体系的酶，要紧是细胞色素类酵。这种酶在有分子氧与脱

氢酶的存在下，可氧化二甲基对苯撑二胺与a—蔡酚成0引味酚蓝，其反应式同氧化酶

试验.

三、实验材料

⑴菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)与枯草杆菌(13aciU~subtilis)。

(2)试剂同氧化酶试验。

四、方法与步骤

取37℃培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各2—3滴顺斜面从上端滴下，并

将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂

混合液滴到菌落上。

五、实验结果

在两分钟内呈现蓝色者为阳性，2min以后出现微弱或者可疑反应者均作为阴性结

果.

实验九淀粉水解试验

一、实验目的

(1)熟悉淀粉水解试验的原理及用途。

(2)学习淀粉水解试验的操作技术。

二、原理

许多菌产生淀粉酶，能把培养基中的淀粉水解为无色糊精的等小分子，或者进一

分解为麦芽糖与葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色.

三、实验材料

(1)菌种大肠杆菌(Escherichiacoil)与枯草芽抱杆酶(Bacillussubtilis)。

(2)培养基在肉汤蛋白陈琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉,分装0.1MPa20min灭菌。

(3)试剂路哥氏碘液(附录1-3.2)'

(4)其它酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。

四，方法与步骤

将培养基熔化，倒成平板，凝固后，取菌种点种于平板上，每皿可点3—5个菌，

37c恒温箱培养2—4d后，观察结果

五、实验结果

取培养好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，

而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解，称淀粉水解试验阳性。透明圈

的大小通常说明水解淀粉能力的大小。

实验八过氧化氢酶试验

一,实验目的

1)熟悉过氧化氢酶试验的用途与原理。

2)学习过氧化氢酶试验的操作技术。

二、原理

在以需氧脱氢酶催化的氧化体系中，氧原子同意电子后，即与溶液中氢离子结合,

生成过氧化氢，此物对微生物有毒性。有的菌具有过氧化氧酶，可将其分解成水与氧,

但有的菌不具有此酶.故过氧化氢酶试验是鉴别菌种的根据之一。

三、实验材料

⑴菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)与某种乳酸杆菌(Lactobacillussp)。

(2)培养基肉汤培养基(附录11—1.1),麦汁培养基.

(3)试剂3%过氧化氢溶液.

(4)其它酒精棉球，酒精灯，洁净小试管，接种环等。

四、方法与步骤

从斜面挑取一环菌种置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液约2mL，观察结果。

五、实验结果

于半分钟内产生气泡者，为过氧化氧酶试验阳性；不发生气泡者，为阴性。

菌落总数测定

1范围

本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。

本标准适用于各类食品中菌落总数的测定。

2术语与定义

下列术语与定义适用于本标准。

2.1

菌落总数

食品检样通过处理，在一定条件下培养后（培养基成分、培养温度与时间、

PH、需氧性质等），所得1ml（或者1g）检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养

条件下所得结果，只包含一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或者兼性厌

氧菌的菌落总数。

3设备与材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备与材料如下：

3.1恒温培养箱：36℃±1℃,30℃±1℃,

3.2冰箱：2℃~5℃.

3.3恒温水浴箱：46℃±1℃,

3.4天平：感量0.1g.

3.5均质器。

3.6振荡器。

3.7无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或者微量移液

器及吸头。

3.8无菌锥形瓶：容量250ml、500ml„

3.9无菌培养皿：直径90mm

3.10PH计或者PH比色管或者精密PH试纸。

3.11放大镜或者菌落计数器或者petrifilm自动判读仪。

4培养基与试剂

4.1平板计数琼脂培养基：见第A..1章。

4.2磷酸盐缓冲液：见第A..2章。

4.3无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于100ml蒸储水中，121匕高压灭菌

15mino

4.4lmol/L氢氧化钠（NaOH）：称取40g氢氧化钠溶于1000ml蒸储水中。

4.5lmol/L盐酸（IICL）:移取浓盐酸90ml用蒸俺水稀释1000ml。

4.6petrifilm菌落总数测试片与压板。

第一法平板菌落计数法

5检验程序

菌落总数的检验程序见图1

检样

25g（或者25011）样品+225011稀释液，均质

图1菌落总数的检验程序

6操作步躲

样品的稀释

固体与半固体样品：称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或者生理盐水的无

菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质lmin~2min,或者放入盛有225ml稀释液

的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打lmin~2min,制成1：10的样品匀液。

液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有2251nl磷酸盐缓冲液或者生理盐水的

无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀

液。

用1ml无菌吸管或者微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有

9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或者吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或

者换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

按6.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次

1ml无菌吸管或者吸头。

根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可

包含原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无

菌平皿内。同时分别取1ml稀释液加入两个无菌平皿左空白参照。

及时将15ml~20ml冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温

水浴箱中）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

培养

6.2.1琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养

72h±

3h.

6.2.2假如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼

脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4ml）,凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。

6.3菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或者菌落计数器，记录稀释倍数与相应的菌落数

量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits,CFU）表示。

6.3.1选取菌落数在30CPU“300CPU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低

于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释

度的菌落数应使用两个平板的平均数。

6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜使用，而应以无片状菌落生长

的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌

落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以，代表一个平板菌落数。

6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落

计数。

7结果的表述

7.1菌落总数的计算方法

7.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数

的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或者毫升）中菌落总

数结果。

7.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1）计算：

N

(%+O.ln2)d

式中：

N——样品中菌落数；

EC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之与;

m——第一个适宜稀释度平板上的菌落数；

n2——第二个适宜稀释度平板上的菌落数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

示例:

稀释度1;100（第一稀释度）1；100（第二稀释度）

菌落数232,24433,35

_232+244+33+35_544

-2=24,727

(n,+OAn2)d~[2+(0.1x2)]xl0-0.022

7.1.3若所有稀释度的平板菌落数均大于300,则对所有稀释度最高的平板进行

计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计数。

7.1.4若所有稀释度的平板菌落数均若有所有稀释度的平板菌落数均少于30,则

应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计数

7.L5若所有稀释度（包含液体样品原液）的平板均无菌落数生成，则以少于1

乘以最低稀释倍数计数。

7.1.6若所有稀释度的菌落数均不在30~300之间，其中一部分小于30或者大于

300时，则以最接近30或者300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.2菌落总数的报告

7.2.1菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，使用两位有效数字报告。

7.2.2大于或者等于100时，第三位数字使用“四舍五入”原则修约后，取用两

位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，按四舍五入原则修约后，

使用两位有效数字。

7.2.3若所有平板上蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

7.2.4若空白参照有菌落生成，则这次检测结果无效。

7.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/ml为单位报告。

第二法菌落总数PetrifilmTM测试片法

8检验程序

除将平板计数琼脂培养基改成PetrifilmTM菌落总数测试片外，其他与第5章相同。

9操作步骤

9.1样品的稀释

按照6.1.1-6.1.2制备1:10的样品匀液后，用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或者1

mol/L盐酸（I1CL）调节pH至6.6-7.2。

9.2接种

根据对样本污染状况的估计，选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液进行检验。将测

试片置于平坦实验台表面，掀开上层膜，用吸管或者微量移液器吸取1mL样品匀液,

垂直滴加在测试片的中央，将上层膜盖下，同意上层膜直接落下，但不要滚动上层膜,

将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培

养膜上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1min以使培养基凝固。每个稀释度

接种两张测试片。

9.3培养

将测试片的透明面朝上，水平置于培养箱内。可堆叠至20片，培养温度与时间同

6.2。

9.4计数

9.4.1培养结束后立即计数，可肉眼观察计数，或者用菌落计数器、放大镜、

PetrifilmTM自动判读仪计数。选取菌落数在30-300之间的测试片计数。

9.4.2计数所有红色菌落。细菌浓度很高时，整个测试片会变成红色或者粉红色，将

结果记录为“多不可计

9.4.3有的时候，当细菌浓度很高时，测试片中央没有可见菌落，但圆形培养膜的边

缘有许多小的菌落，其结果也记录为“多不可计”；进一步稀释样品可获得准确的读

数。

9.4.4某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或者菌落模糊的现象。假如液化现象干

扰计数，能够计数未液化的面积来估算菌落数。

10结果的表述

同第7章

附录A

(规范性附录)

培养基与试剂

A1平板计数琼脂(platecountagar,PcA)培养基

All成分

胰蛋白豚5.0g

酵母浸膏2.5g

葡萄糖1.0g

琼脂15.0g

蒸偏水1000mL

pH7.0i0.2

A12制法

将上述成分加于蒸僮水巾

A2磷酸盐缓冲液

A21成分

磷酸二氢钾(KH2P04)

蒸僧水

PH7.2

A22制法

GB/T47892—2«>8

煮沸溶解，调节PH。分装试管或者锥形瓶，1211高压灭菌15min

34.0g

500mL

贮存液：称取34.0g的磷酸一二氢钾溶于500mL蒸储水中，用大约1.75mL

的1mol/1.氢氧化钠溶

液调节pH至7.2,蒸僧水稀释至1000mL后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25mL,用蒸储水稀释至1000mL,分装于适宜容器中，

121℃高压灭菌15min。

大肠杆菌计数

1范围

本标准规定了食品中大肠菌群计数的方法。

本标准适用于各类食品中大肠菌群的计数。

2术语与定义

下列术语与定义适用于本标准。

2.1

大肠菌群conforms

一群在36匕条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧与兼性厌氧革兰氏阴性

无芽胞杆菌。该菌群要紧来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，

推断食品中肠道致病菌污染的可能。

2.2

最可能数mostprobablenumber；MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。

3设备与材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备与材料如下：

3.1恒温培养箱：36℃±l℃o

3.2冰箱：2匕〜5℃。

3.3恒温水浴箱：46℃±l℃o

3.4天平：感量0.1g。

3.5均质器。

3.6振荡器。

3.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者微量移液器吸头。

3.8无菌锥形瓶：容量500研。

3.9无菌培养皿：直径90mm。

3.10pH计或者pH比色管或者精密pH试纸。

3.11菌落计数器或者Pertrifilm自动判读仪。

4培养基与试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白栋(laurylsulfatetryptose,LST)肉汤：见第A.1章。

煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤：见第A.2章。

结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA)：见第A.3章。

磷酸盐缓冲液：见第A.4章。

Pctrifilmtm是由3M公司提供的产品的商品名，给出这一个薪资是为了方便本标准的使用

者，并不表示对该产品的认可。假如其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。

GB/T4789.3-2008

4.5无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于100mL蒸储水中，121℃高压灭菌15min。

4.6lmol/L氢氧化钠(NaOH)：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸储水中。

4.7lmol/L盐酸(Hcl)：移取农盐酸90mL,用蒸偏水稀释至1000mL

4.8PetrifiL清大肠菌群检验测试片与压板。

第一法大肠菌群MPN计数

5检验程序

大肠菌群MPN计数的检验程序见图1

检样

25g(或者25mL)样品+225mL稀释液，均质

10倍系列稀释

选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管

36℃+1℃48h±2h

不产气

产气