《第08讲 基因工程的基本操作程序》预习讲义

学而优·教有方PAGEPAGE1第08讲基因工程的基本操作程序【学习目标】【基础知识】一、目的基因的筛选和获取1.筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一，如Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。2.利用PCR获取和扩增目的基因（1）获取目的基因的方法a.人工合成（基因碱基序列是已知的） b.PCR技术扩增（已知基因两侧的碱基序列） c.从基因文库中获取（原核生物）（2）PCR技术PCR的含义：是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。基本条件场所：需要在一定的缓冲溶液中进行，其中一般要添加Mg2+ 模板：已知两侧碱基序列的DNA母链 原料：4种脱氧核苷酸酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）引物：是2种与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸反应过程变性：加热超过90℃，双链DNA解旋为单链复性：温度下降至50℃左右，两种引物与互补单链DNA结合延伸：温度上升到72℃左右，四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下合成子链DNA结果：两引物间固定长度的DNA序列呈指数扩增（即2n）鉴定PCR产物：用琼脂糖凝胶电泳来鉴定注：1.含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数为2n-2n2.第三轮出现两条链等长的DNA片段3.两种引物之间需要满足的是：不能碱基互补配对，是防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率。归纳总结苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）为什么对人畜无害的原因：Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，不能穿透细胞膜杀死细胞。基因文库的概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，成为基因文库。cDNA概念：以mRNA为模板进行逆转录形成的DNA6、cDNA文库和基因组文库的比较：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种基因的部分基因某种生物的全部基因7、获取目的基因的三种方法：①人工合成获取；②从基因文库获取；③通过PCR技术获取8、PCR技术：聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分和反应条件，对目的基因的核苷酸进行大量复制的技术。9、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。①体内复制的引物为RNA单链；②体外复制的引物一般为DNA单链10、PCR反应的条件：需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供模板、引物、脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）；同时需要控制温度11、运用PCR技术时，缓冲液中需要加入一定的Mg2+，激活DNA聚合酶10、DNA体内复制的条件：11、DNA体外复制（PCR）的条件PCR扩增的过程：名称具体内容变性目的基因DNA受热变性后形成单链复性（退火）引物与单链相应互补序列结合延伸以单链DNA为模板，在DNA聚合酶将溶液中四种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的子链PCR扩增的结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，计算公式：2n，其中n为扩增循环的次数扩增循环n次所需要的引物：计算公式：2n+1-2，至少需要经过3次扩增以后才能得到目的基因，且扩增第3次后能得到2个目的基因PCR产物鉴定方法：采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的a.让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代b.使目的基因能够表达和发挥作用2.基因表达载体的构成：目的基因+标记基因+启动子+终止子启动子：位于DNA上.在基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，躯动基因转录出mRNA，有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子：也位于DNA上在基因的下游，终止转录起始密码子和终止密码子：位于mRNA上，决定翻译的开始和结束3.基因表达载体的构建过程（P80-图3-6）（1）首先用一定的限制酶切割载体（2）然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处注意：选择限制酶的三大原则一大要求（题干特定要求）不能破坏目的基因如图甲，可选择PstⅠ而不选择SmaⅠ不能破坏质粒中的重要元件（如复制原点.启动子.终止子.标记基因（至少保留一个））质粒与目的基因形成相同的黏性末端（一般使用双酶切，优点是可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接）归纳总结1.基因表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够复制和发挥作用2.表达载体的组成：①复制原点；②目的基因；③标记基因；④启动子；终止子（谐音记忆：一元买两鸡子）3.启动子：位于基因的上游一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录产生所需的mRNA。4.终止子：位于基因的下游的一段有特殊序列结构的DNA片段，终止转录5.启动子与起始密码子、终止子与终止密码子的区分：项目启动子终止子起始密码子终止密码子位置基因的上游基因的下游mRNA上mRNA上化学本质DNA序列DNA序列RNA序列RNA序列作用RNA聚合酶识别和结合的部位，启动基因的转录终止基因的转录蛋白质合成开始的信号(起点)终止蛋白质合成(终点)6.构建重组质粒时只能用同一种限制酶切割目的基因和载体吗？不是，切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果两种不同的限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因和载体也可以连接起来。三、目的基因导入受体细胞1.转化的概念（重点）：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法导入植物细胞农杆菌转化法（最常用）受体是体细胞或受精卵花粉管通道法（我国独创）如抗虫棉导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术受体细胞多是受精卵导入微生物细胞：常以大肠杆菌作为受体细胞一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（即感受态），然后再将重组的基因表达载体导入其中。3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。归纳总结1.转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.将目的基因导入受体细胞的方法：生物类型方法受体细胞过程特点转基因植物花粉管通道法受精卵植物受粉一段时间后剪去柱头→滴加DNA溶液(含目的基因)→目的基因借助花粉管通道进入受体细胞(胚囊)→目的基因表达我国独创的一种方法转基因植物农杆菌转化法体细胞或受精卵将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T－DNA片段上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体DNA上→目的基因表达适用于双子叶植物和裸子植物转基因动物显微注射法受精卵提纯含目的基因的表达载体→取卵(受精卵)→显微注射→胚胎早期发育，移植→获得具有新性状的动物目的基因导入动物细胞最有效的方法转基因微生物Ca2＋处理法微生物细胞用Ca2＋处理微生物细胞→处于能吸收DNA分子的状态(即感受态细胞)→基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子简便、经济、有效四、目的基因的表达与检测1.分子水平的检测1）通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 2）利用PCR技术检测目的基因是否转录出了mRNA 3）用相应抗体进行抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质等2.个体生物学水平的鉴定：抗虫.抗病接种试验等总结-基因工程的基本操作流程（P82-图3-7）归纳总结类型检测内容方法结果显示分子水平的检测目的基因是否插入受体细胞DNA上PCR技术是否扩增出目的基因目的基因是否转录出mRNAPCR技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原－抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间)是否显示出杂交带个体生物学水平的检测是否具有抗性及抗性程度对转基因生物进行抗性接种实验是否赋予了预期抗性五、DNA片段的扩增及电泳鉴定实验原理：1.DNA片段的扩增：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解旋与结合。2.琼脂糖凝胶电泳P54（1）带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基因可以带上正电荷或负电荷。（2）电泳：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（3）迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度.DNA分子的大小和构象有关。（4）检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来3.操作提示P85注意（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR试验中使用的微量离心管.枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。（2）缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前所需试剂从冰箱拿出放在冰块上缓慢融化。（3）添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。（4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。4.结果分析与评价（1）未出现扩增条带的原因a.TaqDNA聚合酶失活b.引物出现质量问题c.Mg2+浓度过低d.变性时的温度低，变性时间短（2）出现非特异性扩增条带的主要原因a.模板DNA出现污染b.引物特异性不强（过短）或形成引物二聚体c.Mg2+浓度过高d.复性时的温度过高附图：【考点剖析】考点一：目的基因的筛选与获取例1．2020年3月16日，中国科学家陈薇院士团队研制的重组新冠疫苗通过临床研究注册审评，获批进入临床试验。重组新冠疫苗的制备流程如图。回答下列问题。(1)步骤②需要作为原料。步骤③需要的工具酶主要是。(2)被用作载体的Ad5应具有的特点是(答出1点即可)。(3)步骤④是。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为，刺激机体产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足的条件之一是(填“有”或“无”)SARS－CoV－2感染史，理由是。(5)为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，需进一步试验，请写出试验思路：。【答案】(1)脱氧核苷酸Taq酶(2)能自我复制(或有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因位点、对受体细胞无害)(3)基因表达载体的构建(4)抗原无有SARS－CoV－2感染史的志愿者血清中存在一定量的相应抗体，会对试验结果产生干扰(5)给不同组志愿者分别注射不同剂量的疫苗，一段时间后采集血样并检测相应抗体的水平【解析】(1)步骤②为逆转录过程，合成的产物是cDNA，因此需要脱氧核苷酸作为原料。步骤③为利用PCR技术扩增获得S蛋白基因的过程，该过程需要的酶是Taq酶(耐高温的DNA聚合酶)。(2)Ad5作为载体应具有的特点是能自我复制、有多个限制酶切割位点、有标记基因、在宿主细胞中可以存活并表达、对宿主细胞无害等。(3)步骤④为构建目的基因表达载体的过程，即重组新冠疫苗的过程。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白可作为抗原，刺激机体产生特异性免疫过程，使机体免疫系统产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足无SARS－CoV－2感染史的条件，即未感染过新冠病毒的志愿者，因为感染过新冠病毒的人体内含有相应的记忆细胞，若注射疫苗，则会出现二次免疫的特征，即体内的记忆细胞会迅速增殖分化，产生大量的浆细胞，浆细胞合成并分泌大量的抗体，从而导致无法检测出该疫苗的真正效果。(5)实验目的为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，根据实验目的可知，该实验的自变量为疫苗的注射剂量，因变量为抗体产生量，因此设计实验如下：将同性别且年龄相当的志愿者随机分成若干组，然后给不同组别的志愿者注射不同剂量的疫苗，一段时间之后，检测志愿者体内的抗体产生量，作好记录并进行比较、分析，从而得出结论。考点二：表达载体的构建例2．大肠杆菌β­半乳糖苷酶(Z酶)可催化底物(X­gal)水解产生蓝色物质。在pUC18质粒中，lacZ′编码Z酶氨基端的一个片段(称为α­肽)，该质粒结构及限制酶识别位点如图甲所示。已知α­肽、缺失α­肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性。利用图乙中的DNA片段与pUC18质粒进行基因工程操作。(1)限制酶能催化双链DNA分子中(填化学键名称)的断裂。本实验可使用限制酶处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段，再通过DNA连接酶连接，获得含目的基因的重组质粒。(2)用重组质粒转化大肠杆菌，然后将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的固体培养基上进行培养，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有，在该培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于培养基。(3)当上述培养基中含有X­gal时，生长出的菌落有蓝色和白色两种类型，其中含有重组质粒的大肠杆菌的菌落颜色为，这是因为_________________________________________________________________________________________________________。为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是______________________________________。【答案】(1)磷酸二酯键SalⅠ(2)氨苄青霉素抗性选择(3)白色目的基因与质粒连接后使lacZ′被破坏，不能合成α­肽编码α­肽的DNA序列缺失，其他序列正常【解析】(1)限制酶能催化双链DNA分子中特定部位磷酸二酯键的断裂，将DNA断开。从图中可知，酶HindⅢ可破坏目的基因，而质粒和目的基因两侧都有酶SalⅠ识别位点，因此本实验可使用限制酶SalⅠ处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段。(2)重组质粒上有氨苄青霉素抗性基因，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有氨苄青霉素抗性，在含氨苄青霉素培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于选择培养基，选择了含重组质粒的大肠杆菌。(3)从图中可知，重组质粒是用酶SalⅠ分别处理过的质粒和目的基因片段形成的，重组质粒的lacZ′基因被破坏，不能合成β­半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(X­gal)水解产生蓝色物质，故呈菌落白色。已知α­肽、缺失α­肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性，为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是编码α­肽的DNA序列缺失，其他序列正常。考点三、目的基因导入受体细胞例3．乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞内合成乙烯的两个关键酶。利用反义基因技术(原理如图1)，可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义基因表达载体的结构示意图。图1反义基因技术图2反义基因表达载体(1)图2中的2A11为特异性启动子，则2A11应在番茄的(填器官名称)中表达。(2)从番茄成熟果实中提取作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，对它们进行拼接构成融合基因并扩增。(3)合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，用限制酶对上述两个基因进行切割后，再将它们拼接成融合基因，相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。(4)为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因(填“正向”或“反向”)插入启动子2A11的下游即可构成反义融合基因。(5)在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，(填“能”或“不能”)用放射性物质标记的ACC氧化(合成)酶基因片段作探针进行检测，理由是。【答案】(1)果实(2)RNA(3)XbaⅠBamHⅠ和SacⅠ(4)反向(5)不能番茄细胞内本来就存在ACC氧化(合成)酶基因，能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交【解析】(1)番茄食用的是果实，因此，启动子2A11应在番茄的果实中表达。(2)从番茄成熟果实中提取RNA作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。(3)使用限制酶XbaⅠ对合成出的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因进行切割后，两种基因有相同的黏性末端，可将二者拼接形成融合基因。相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶BamHⅠ和SacⅠ进行切割，然后再连接，可以确保融合基因能够插入载体中。(4)为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因反向插入启动子2A11的下游。(5)番茄细胞内本来就存在ACC氧化(合成)酶基因，能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交，因此，不能用放射性物质标记的ACC氧化(合成)酶基因作为探针进行检测。四、目的基因的检测与鉴定例4．通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：(1)人体接种乙型肝炎疫苗后，该疫苗可作为刺激机体发生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗先后需要接种多次，其目的是。(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，则可以推测出相应目的基因的核苷酸序列，但推测出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是。(3)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，这一过程中需要的工具酶主要有。构建的基因表达载体中，编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因应该位于之间。(4)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞时，使该基因在酵母菌细胞中得以稳定遗传的关键是。【答案】(1)抗原使人体产生更多的抗体和记忆细胞(2)决定氨基酸的密码子具有简并性(或决定一种氨基酸的密码子往往不是只有一种)(3)限制酶和DNA连接酶启动子和终止子(4)确保编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上【解析】(1)乙型肝炎疫苗可作为抗原引起人体产生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗需先后接种多次的目的是使人体产生更多的抗体和记忆细胞，以发挥最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密码子具有简并性，根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推测出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在构建基因表达载体过程中，需要用限制酶切割目的基因片段与载体，再用DNA连接酶把目的基因与载体连接起来。构建的基因表达载体中，启动子和终止子分别是基因表达中转录起始和终止的调控序列，目的基因需要插在启动子和终止子之间。(4)真核细胞分裂时细胞质DNA随机分配，应将目的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上，以确保目的基因在酵母菌细胞中稳定遗传。【真题演练】1.（2021湖北,16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA量 B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度2.（2020北京生物高考题）12.为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（）A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④3.（2021湖北，16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA量 B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度4.（2020•北京）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。（注：①、②、③、④表示引物）为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（）A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④5.（2019•北京）筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈（如图），实验结果见下表。菌种菌落直径：C（mm）透明圈直径：H（mm）H/C细菌Ⅰ5.111.22.2细菌Ⅱ8.113.01.6有关本实验的叙述，错误的是（）A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质 B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布 C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外 D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异6.（2017•北京）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（）A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上7.（2021•北京）新冠病毒（SARS﹣CoV﹣2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通过得到cDNA，经获取S基因，酶切后再连接到载体。（2）重组疫苗中的S基因应编码。A.病毒与细胞识别的蛋白B.与病毒核酸结合的蛋白C.催化病毒核酸复制的酶D.帮助病毒组装的蛋白（3）为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→→→诱发特异性免疫反应。（4）重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因。8.（2019•北京）光合作用是地球上最重要的化学反应，发生在高等植物、藻类和光合细菌中。（1）地球上生命活动所需的能量主要来源于光反应吸收的。在碳（暗）反应中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2与RuBP（C5）结合，生成2分子C3．影响该反应的外部因素，除光照条件外还包括（写出两个）；内部因素包括（写出两个）。（2）R酶由8个大亚基蛋白（L）和8个小亚基蛋白（S）组成。高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因编码并在中由核糖体合成后进入叶绿体，在叶绿体的中与L组装成有功能的酶。（3）研究发现，原核生物蓝藻（蓝细菌）R酶的活性高于高等植物。有人设想通过基因工程技术将蓝藻R酶的S、L基因转入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人员将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。转基因植株能够存活并生长。检测结果表明，转基因植株中的R酶活性高于未转基因的正常植株。①由上述实验能否得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测？请说明理由。。②基于上述实验，下列叙述中能够体现生物统一性的选项包括。a．蓝藻与甲都以DNA作为遗传物质b．蓝藻与甲都以R酶催化CO2的固定c．蓝藻R酶大亚基蛋白可在甲的叶绿体中合成d．在蓝藻与甲的叶肉细胞中R酶组装的位置不同9.（2021天津）16.乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。

（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为___________。（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑___________和___________。②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列___________（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在___________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。A.进一步优化发酵条件 B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种10.（2021福建）21.微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：（1）根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。（2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图乙所示。①选用___________酶将载体P切开，再用___________（填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②载体P′不具有表达MT基因___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。（3）MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________。11.(2021山东高考25)人类γ基因启动子上游调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是____，在R末端添加的序列所对应的限制酶是_____。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。（2）将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____。（3）向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于_____，理由是___。12.（2021北京）16.新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通过_______得到cDNA，经_______获取S基因，酶切后再连接到载体。（2）重组疫苗中的S基因应编码________。A.病毒与细胞识别的蛋白 B.与病毒核酸结合的蛋白C.催化病毒核酸复制的酶 D.帮助病毒组装的蛋白（3）为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→________→_________→诱发特异性免疫反应。（4）重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因________。13.（2021辽宁,24）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。相关限制酶的识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRIG↓AATTCCTTAA↑GPvitⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstICTGC↓AGGA↑CGTCKpnIG↓GTACCCCATG↑GBamHIG↓GATCCCCTAG↑G注：箭头表示切割位点（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中（5）将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。14.（2021·全国甲卷高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。（2）操作③中使用的酶是_________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是_______。（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_______特异性结合。（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。【过关检测】1.基因工程操作中,需要筛选和获取目的基因。下列关于目的基因的说法,错误的是()A.目的基因是指用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因B.目的基因都有自我复制能力C.可以根据相应的表达产物,从序列数据库中寻找目的基因D.目的基因可以人工合成,也可以利用PCR快速获取或扩增2.下列不属于获取目的基因的方法的是 ()A.从基因组文库中获取目的基因B.利用PCR技术体外扩增目的基因C.利用逆转录法获取目的基因D.利用DNA连接酶复制目的基因3.扩增特定DNA片段可利用PCR技术,下列有关描述错误的是 ()A.利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶,但需要耐高温的DNA聚合酶B.引物是子链合成和延伸的基础,子链沿着模板链的3'→5'方向延伸C.利用PCR技术扩增目的基因时,需知道目的基因的全部核苷酸序列D.复性温度过高,可能导致PCR得不到任何扩增产物4.如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因重组进该质粒,则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列 ()A.NdeⅠ和BamHⅠ B.NdeⅠ和XbaⅠC.XbaⅠ和BamHⅠ D.EcoRⅠ和KpnⅠ5.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤,下列有关说法错误的是()A.构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶B.用不同载体构建基因表达载体时,载体的处理方法相同C.基因表达载体中启动子位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因6.下列将目的基因导入受体细胞的方法,不合理的是 ()A.利用显微注射法将目的基因导入受精卵,培育了超级小鼠B.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉C.可利用含目的基因的噬菌体侵染玉米细胞来培育转基因玉米D.用Ca2+处理大肠杆菌,有利于大肠杆菌细胞吸收环境中的DNA7.根癌农杆菌侵染植物细胞时,其Ti质粒上的T-DNA片段能转入植物的基因组中,因此可利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因操作。下列相关叙述正确的是 ()A.目的基因应插入T-DNA片段外,以防止破坏T-DNAB.用Ca2+处理农杆菌,以利于其感染植物细胞C.Ti质粒是一种环状DNA分子,属于细菌的拟核DNAD.T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物染色体DNA中8.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达 ()A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因C.提取受体细胞合成的相应蛋白质,利用抗原—抗体杂交技术进行检测D.抗虫基因导入植物细胞后,检测植物是否具有抗虫特性9.科学家将苏云金杆菌中的Bt基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞,并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验,发现该棉花植株并无抗虫性状,科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作,下列分析错误的是 ()A.提取细胞中的蛋白质,采用抗原—抗体杂交技术进行检测,若能检测到Bt抗虫蛋白,则可能是抗虫基因表达效率低B.若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白,可采用PCR等技术检测细胞中的RNA,若检测到Bt抗虫蛋白的mRNA,则可能是抗虫基因不能正常转录和翻译C.若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA,可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA,若能检测到抗虫基因,则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中D.若经C检测确定细胞中无抗虫基因,则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞10.下列关于PCR操作过程的叙述,错误的是()A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行灭菌B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存C.将PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出,放在高温环境中迅速融化D.在向微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换11.以下关于活动“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的叙述,错误的是 ()A.4种脱氧核苷酸为PCR扩增提供原料B.凝胶载样缓冲液中的电泳指示剂可使核酸显色C.带有负电荷的核酸需要加在电泳槽的负极D.不同大小的核酸在相同电场力的作用下迁移速率不同,从而实现其分离12.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱。其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析,不合理的是()A.PCR产物的分子大小在250~500bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号可确定反应体系等对结果没有干扰13.MAP30蛋白存在于苦瓜的果实和种子中。实验表明MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能,近年来引起了人们的广泛关注。MAP30蛋白基因可作为基因工程中的目的基因,下列叙述错误的是 ()A.可从苦瓜果实或种子中提取mRNA,经逆转录法获取目的基因B.对PCR扩增后的产物,一般需要通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定C.检测MAP30蛋白基因是否成功表达,可用抗原—抗体杂交技术D.直接将MAP30蛋白基因导入马铃薯受体细胞,可获得转基因幼苗14.如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①~④表示相关的操作,EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶,它们的识别序列及切割位点如表所示。下列说法正确的是 ()A.过程①依据的原理是DNA的半保留复制B.在过程③中T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上C.为方便后续的剪切和连接,可在两种引物的一端分别加上GAATTC和GGATCC序列D.过程④中,科研人员最终未能检测到干扰素基因,其原因可能是干扰素基因未能成功导入人参愈伤组织细胞中15.科学家将海鱼的抗冻蛋白基因用PCR技术扩增,如图1是扩增的目的基因的示意图。为寻找合适的载体,科学家对某载体用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶进行酶切后,再利用琼脂糖凝胶电泳得到图2所示图谱(其中1号泳道是标准DNA样品的电泳结果,2号、3号、4号泳道分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果)。下列说法错误的是 ()A.应选用引物2和引物3对目的基因进行扩增B.扩增5次后有16个等长的目的基因片段C.DNA分子经过染色可在紫外灯下观察得到图2所示图谱D.由图2可知该载体DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个16.我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图),通过农杆菌转化法导入白玫瑰细胞中,获得蓝玫瑰。下列叙述错误的是()A.表达载体中sfp和idgS具有各自的启动子,表达相互独立B.可利用DNA分子杂交技术从链霉菌的基因文库中获取sfp和idgSC.将sfp插入Ti质粒时不能同时使用限制酶PmeⅠ和BamHⅠD.若受体白玫瑰不变蓝,则可说明sfp和idgS未成功导入17.通过咽拭子取样进行实时荧光RT-PCR检测是目前临床上诊断新冠病毒感染疑似患者的常用方法。如图为实时荧光RT-PCR技术的原理(序号表示步骤):PCR过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有荧光基团和淬灭基团(抑制荧光发出),当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。回答下列问题:(1)步骤①以病毒的RNA为模板通过过程合成cDNA。

(2)引物A和引物B是根据序列合成的。步骤②中引物与病毒cDNA结合,在PCR循环中称为复性,一般设定温度为。

(3)步骤③为阶段,在酶的作用下将核苷酸不断连接到2个引物的端。

(4)若监测系统检测到荧光信号,则可基本判断该检测样本为阳性,其原因是。(5)2022年3月,我国推出新冠病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施,该试剂盒的检测原理是。

18.凝乳酶是食品生产中常用的凝结剂,科研人员从动物体内获得了凝乳酶mRNA,拟利用大肠杆菌通过基因工程生产凝乳酶。据图回答下列问题:(1)利用凝乳酶mRNA,在酶的作用下,可以得到凝乳酶的cDNA,进一步通过PCR扩增时需要2种引物,引物的作用是。(2)图1和图2是选用的质粒及几种相关限制酶的识别位点,在构建基因表达载体时,最好选用的限制酶是,这样选择的优点是(答出两点)。为在凝乳酶基因两侧加上相应的酶切位点,设计引物时需在引物前添加相应酶切位点,PCR过程中至少复制次可以得到含所需酶切位点的凝乳酶基因。

(3)将构建的重组质粒导入大肠杆菌,需要用钙离子处理,使大肠杆菌处于。

(4)将在添加了青霉素的培养基中得到的4个大肠杆菌菌落进行进一步检测,检测结果如图3所示,1~4号菌落中需要舍弃的是1号和。其中舍弃1号菌落的理由是。

第08讲基因工程的基本操作程序【考点剖析】考点一：目的基因的筛选与获取例1．2020年3月16日，中国科学家陈薇院士团队研制的重组新冠疫苗通过临床研究注册审评，获批进入临床试验。重组新冠疫苗的制备流程如图。回答下列问题。(1)步骤②需要作为原料。步骤③需要的工具酶主要是。(2)被用作载体的Ad5应具有的特点是(答出1点即可)。(3)步骤④是。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为，刺激机体产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足的条件之一是(填“有”或“无”)SARS－CoV－2感染史，理由是。(5)为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，需进一步试验，请写出试验思路：。【答案】(1)脱氧核苷酸Taq酶(2)能自我复制(或有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因位点、对受体细胞无害)(3)基因表达载体的构建(4)抗原无有SARS－CoV－2感染史的志愿者血清中存在一定量的相应抗体，会对试验结果产生干扰(5)给不同组志愿者分别注射不同剂量的疫苗，一段时间后采集血样并检测相应抗体的水平【解析】(1)步骤②为逆转录过程，合成的产物是cDNA，因此需要脱氧核苷酸作为原料。步骤③为利用PCR技术扩增获得S蛋白基因的过程，该过程需要的酶是Taq酶(耐高温的DNA聚合酶)。(2)Ad5作为载体应具有的特点是能自我复制、有多个限制酶切割位点、有标记基因、在宿主细胞中可以存活并表达、对宿主细胞无害等。(3)步骤④为构建目的基因表达载体的过程，即重组新冠疫苗的过程。(4)重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白可作为抗原，刺激机体产生特异性免疫过程，使机体免疫系统产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足无SARS－CoV－2感染史的条件，即未感染过新冠病毒的志愿者，因为感染过新冠病毒的人体内含有相应的记忆细胞，若注射疫苗，则会出现二次免疫的特征，即体内的记忆细胞会迅速增殖分化，产生大量的浆细胞，浆细胞合成并分泌大量的抗体，从而导致无法检测出该疫苗的真正效果。(5)实验目的为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，根据实验目的可知，该实验的自变量为疫苗的注射剂量，因变量为抗体产生量，因此设计实验如下：将同性别且年龄相当的志愿者随机分成若干组，然后给不同组别的志愿者注射不同剂量的疫苗，一段时间之后，检测志愿者体内的抗体产生量，作好记录并进行比较、分析，从而得出结论。考点二：表达载体的构建例2．大肠杆菌β­半乳糖苷酶(Z酶)可催化底物(X­gal)水解产生蓝色物质。在pUC18质粒中，lacZ′编码Z酶氨基端的一个片段(称为α­肽)，该质粒结构及限制酶识别位点如图甲所示。已知α­肽、缺失α­肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性。利用图乙中的DNA片段与pUC18质粒进行基因工程操作。(1)限制酶能催化双链DNA分子中(填化学键名称)的断裂。本实验可使用限制酶处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段，再通过DNA连接酶连接，获得含目的基因的重组质粒。(2)用重组质粒转化大肠杆菌，然后将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的固体培养基上进行培养，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有，在该培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于培养基。(3)当上述培养基中含有X­gal时，生长出的菌落有蓝色和白色两种类型，其中含有重组质粒的大肠杆菌的菌落颜色为，这是因为_________________________________________________________________________________________________________。为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是______________________________________。【答案】(1)磷酸二酯键SalⅠ(2)氨苄青霉素抗性选择(3)白色目的基因与质粒连接后使lacZ′被破坏，不能合成α­肽编码α­肽的DNA序列缺失，其他序列正常【解析】(1)限制酶能催化双链DNA分子中特定部位磷酸二酯键的断裂，将DNA断开。从图中可知，酶HindⅢ可破坏目的基因，而质粒和目的基因两侧都有酶SalⅠ识别位点，因此本实验可使用限制酶SalⅠ处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段。(2)重组质粒上有氨苄青霉素抗性基因，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有氨苄青霉素抗性，在含氨苄青霉素培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于选择培养基，选择了含重组质粒的大肠杆菌。(3)从图中可知，重组质粒是用酶SalⅠ分别处理过的质粒和目的基因片段形成的，重组质粒的lacZ′基因被破坏，不能合成β­半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(X­gal)水解产生蓝色物质，故呈菌落白色。已知α­肽、缺失α­肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性，为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是编码α­肽的DNA序列缺失，其他序列正常。考点三、目的基因导入受体细胞例3．乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞内合成乙烯的两个关键酶。利用反义基因技术(原理如图1)，可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义基因表达载体的结构示意图。图1反义基因技术图2反义基因表达载体(1)图2中的2A11为特异性启动子，则2A11应在番茄的(填器官名称)中表达。(2)从番茄成熟果实中提取作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，对它们进行拼接构成融合基因并扩增。(3)合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，用限制酶对上述两个基因进行切割后，再将它们拼接成融合基因，相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。(4)为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因(填“正向”或“反向”)插入启动子2A11的下游即可构成反义融合基因。(5)在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，(填“能”或“不能”)用放射性物质标记的ACC氧化(合成)酶基因片段作探针进行检测，理由是。【答案】(1)果实(2)RNA(3)XbaⅠBamHⅠ和SacⅠ(4)反向(5)不能番茄细胞内本来就存在ACC氧化(合成)酶基因，能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交【解析】(1)番茄食用的是果实，因此，启动子2A11应在番茄的果实中表达。(2)从番茄成熟果实中提取RNA作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。(3)使用限制酶XbaⅠ对合成出的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因进行切割后，两种基因有相同的黏性末端，可将二者拼接形成融合基因。相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶BamHⅠ和SacⅠ进行切割，然后再连接，可以确保融合基因能够插入载体中。(4)为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因反向插入启动子2A11的下游。(5)番茄细胞内本来就存在ACC氧化(合成)酶基因，能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交，因此，不能用放射性物质标记的ACC氧化(合成)酶基因作为探针进行检测。四、目的基因的检测与鉴定例4．通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：(1)人体接种乙型肝炎疫苗后，该疫苗可作为刺激机体发生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗先后需要接种多次，其目的是。(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，则可以推测出相应目的基因的核苷酸序列，但推测出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是。(3)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，这一过程中需要的工具酶主要有。构建的基因表达载体中，编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因应该位于之间。(4)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞时，使该基因在酵母菌细胞中得以稳定遗传的关键是。【答案】(1)抗原使人体产生更多的抗体和记忆细胞(2)决定氨基酸的密码子具有简并性(或决定一种氨基酸的密码子往往不是只有一种)(3)限制酶和DNA连接酶启动子和终止子(4)确保编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上【解析】(1)乙型肝炎疫苗可作为抗原引起人体产生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗需先后接种多次的目的是使人体产生更多的抗体和记忆细胞，以发挥最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密码子具有简并性，根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推测出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在构建基因表达载体过程中，需要用限制酶切割目的基因片段与载体，再用DNA连接酶把目的基因与载体连接起来。构建的基因表达载体中，启动子和终止子分别是基因表达中转录起始和终止的调控序列，目的基因需要插在启动子和终止子之间。(4)真核细胞分裂时细胞质DNA随机分配，应将目的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上，以确保目的基因在酵母菌细胞中稳定遗传。【真题演练】1.（2021湖北,16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA量 B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度【答案】D【解析】【分析】多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，PCR过程一般经历下述三循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。【详解】A、增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误；D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。2.（2020北京生物高考题）12.为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（）A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④【答案】B【解析】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。3.（2021湖北，16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA量 B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度【答案】D【解析】增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。4.（2020•北京）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。（注：①、②、③、④表示引物）为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（）A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④【答案】B【解析】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。5.（2019•北京）筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈（如图），实验结果见下表。菌种菌落直径：C（mm）透明圈直径：H（mm）H/C细菌Ⅰ5.111.22.2细菌Ⅱ8.113.01.6有关本实验的叙述，错误的是（）A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质 B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布 C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外 D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异【答案】C【解析】筛选淀粉分解菌的培养基中，除淀粉提供碳源外，还需要氮源、水、无机盐等营养物质，A正确；筛选分离淀粉分解菌时需要将菌液进行一定程度的稀释才能涂布培养，B正确；据图分析可知，两个菌落均产生了透明圈，说明两种细菌均能将淀粉酶分泌至细胞外，C错误；据表分析可知，H/C值越大，分解淀粉能力越强，该值的大小反映了两种细菌分解淀粉能力的差异，D正确。6.（2017•北京）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（）A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上【答案】C【解析】据图分析可知，在目的基因的两端、启动子和终止子之间都有限制性核酸内切酶EcoRⅠ的切割位点，因此可以用限制性核酸内切酶EcoRⅠ切割目的基因和运载体，之后再用DNA连接酶连接形成基因表达载体，A正确；将目的基因导入到植物细胞，常用农杆菌转化法，可以将目的基因C导入到农杆菌的Ti质粒的T﹣DNA段，之后再用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞中染色体上的DNA上，B正确；图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，应该在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的农杆菌，C错误；要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用分子杂交技术，D正确。7.（2021•北京）新冠病毒（SARS﹣CoV﹣2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通过得到cDNA，经获取S基因，酶切后再连接到载体。（2）重组疫苗中的S基因应编码。A.病毒与细胞识别的蛋白B.与病毒核酸结合的蛋白C.催化病毒核酸复制的酶D.帮助病毒组装的蛋白（3）为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→→→诱发特异性免疫反应。（4）重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因。【答案】（1）逆转录PCR扩增（2）A（3）（重组腺病毒）进入细胞表达抗原（4）重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统【解析】（1）新冠病毒是RNA病毒，其遗传物质是RNA，若要得到与其对应的cDNA，则要进行逆转录。用cDNA扩增出目的基因—S基因需要利用PCR扩增技术。（2）重组疫苗作为抗原需要被人体免疫系统识别，而重组疫苗中的S基因是从新冠病毒中提取的，所以重组疫苗中的S基因应编码病毒与细胞都能识别的蛋白，A正确，BCD错误。故选A。（3）重组疫苗对人体来说属于外来异物，即抗原，故人体接种疫苗后，重组腺病毒进入人体细胞，其在人体细胞内表达出抗原，引发机体产生特异性免疫﹣﹣细胞免疫和体液免疫，因此该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→（重组腺病毒）进入细胞→表达抗原→诱发特异性免疫反应。（4）接种疫苗后，由于长时间内接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA，而DNA会不断表达出S蛋白，S蛋白作为抗原刺激机体，故机体会反复针对抗原产生特异性免疫应答。8.（2019•北京）光合作用是地球上最重要的化学反应，发生在高等植物、藻类和光合细菌中。（1）地球上生命活动所需的能量主要来源于光反应吸收的。在碳（暗）反应中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2与RuBP（C5）结合，生成2分子C3．影响该反应的外部因素，除光照条件外还包括（写出两个）；内部因素包括（写出两个）。（2）R酶由8个大亚基蛋白（L）和8个小亚基蛋白（S）组成。高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因编码并在中由核糖体合成后进入叶绿体，在叶绿体的中与L组装成有功能的酶。（3）研究发现，原核生物蓝藻（蓝细菌）R酶的活性高于高等植物。有人设想通过基因工程技术将蓝藻R酶的S、L基因转入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人员将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。转基因植株能够存活并生长。检测结果表明，转基因植株中的R酶活性高于未转基因的正常植株。①由上述实验能否得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测？请说明理由。。②基于上述实验，下列叙述中能够体现生物统一性的选项包括。a．蓝藻与甲都以DNA作为遗传物质b．蓝藻与甲都以R酶催化CO2的固定c．蓝藻R酶大亚基蛋白可在甲的叶绿体中合成d．在蓝藻与甲的叶肉细胞中R酶组装的位置不同【答案】（1）光能温度、CO2浓度色素含量及种类、酶的含量及活性（2）细胞质基质基质（3）①不能，因为转基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除转基因植株中R酶由蓝藻的L蛋白和甲植株的S蛋白组成②a、b、c【解析】1、光合作用的过程图解：2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA﹣﹣分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质﹣﹣抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。（1）地球上生命活动所需的能量主要来源于光反应吸收的光能。在碳（暗）反应中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2与RuBP（C5）结合，生成2分子C3．影响该反应的外部因素，除光照条件外还包括温度、CO2浓度等；内部因素包括色素含量及种类、酶的含量及活性等。（2）R酶由8个大亚基蛋白（L）和8个小亚基蛋白（S）组成。高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因编码并在细胞质基质中由核糖体合成后进入叶绿体，在叶绿体的中与L组装成有功能的酶。（3）①由上述实验不能得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测，因为转基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除转基因植株中R酶由蓝藻的L蛋白和甲植株的S蛋白组成。②蓝藻与甲都以DNA作为遗传物质，能体现生