3.2基因工程的基本操作程序（第1课时）高二下学期生物人教版选择性必修三

3.2基因工程的基本操作程序1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。

你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉与普通棉花

从社会中来苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。培育转基因抗虫棉用到的目的基因一、目的基因(1)定义：(2)实例：Bt抗虫蛋白基因（简称Bt基因）目的基因的筛选与获取01

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。相关信息P77：1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？

Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。1.较为有效的方法之一:随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。二、筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。2.认识基因结构和功能的技术方法DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对1.人工合成目的基因。2.通过构建基因文库来获取目的基因。3.常用

PCR特异性地快速扩增目的基因。重点了解什么是PCR？将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。什么叫基因文库？前提与方法：若基因较小、核苷酸序列已知，可通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。DNA合成仪目的基因的筛选与获取01三.目的基因的获取方法1.PCR的概念PCR是____________的缩写，是一项根据______

____的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_______，对__________________进行________的技术；①全称：______________________________②原理：______________________________③操作环境：__________________________④目的：______________________________⑤优点：______________________________聚合酶链式反应DNA半保留复制体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因PCR扩增仪控制温度PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。四、利用PCR获取和扩增目的基因结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些组分和条件？要点回顾:体内DNA复制模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶复制特点:①边解旋边复制②半保留复制碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）条件复制原则:子链的延伸方向：5'端→3'端

因为DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。ATP2.DNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用

解旋酶DNA母链合成DNA子链的原料催化合成DNA子链引物维持反应体系pH稳定提供DNA复制的模板断开氢键，打开DNA双链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的DNA聚合酶，如Taq酶）（体外用高温代替）4种脱氧核苷酸DNA聚合酶缓冲溶液引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链，体内的DNA复制通常以RNA单链为引物体外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端相关信息P77：3′5′为什么子链的延伸方向是5′→3′？DNA聚合酶3′5′模板链子链因为DNA聚合酶不能头开始合成子链DNA，只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端为什么子链合成需要引物？01目的基因的筛选与获取耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物缓冲溶液（一般添加Mg2+）3.PCR条件:四种脱氧核苷酸②激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶（2种）

①提供相对稳定的pH环境与某些离子；实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。(实际是dNTP)要有一段已知目的基因的核苷酸序列PCR扩增仪（PCR仪）——控制温度（重点）1）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA第一步：变性待扩增的DNA片段3’3’5’5’3’5’3’5’变性90℃思考2：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。01目的基因的筛选与获取4.PCR反应的过程思考1：变性破坏的是哪种化学键，是否需要酶？（重点）2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

与两条单链DNA结合。

第二步：复性DNA引物3’5’3’5’碱基互补配对思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能头开始合成子链DNA②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。引物15’3’引物25’3’4.PCR反应的过程01目的基因的筛选与获取由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物。引物设计1.引物长度：20-30个核苷酸2.引物自身不能互补配对3.两种引物之间不能互补配对（重点）3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脱氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端01目的基因的筛选与获取4.PCR反应的过程思考3：延伸过程是否需要ATP供能不需要，由dNTP水解供能（重点）PCR反应的过程、产物第一轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。

即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。01目的基因的筛选与获取变性复性延伸

过程：PCR反应的过程、产物第一轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物01目的基因的筛选与获取变性复性延伸

过程：（1）要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2【问题探究1】（2）若循环n次，理论上可获得DNA数

，其中

含引物的DNA数

，含引物的DNA链数

，共需引物对数

。共需引物个数

。2n2n+1-22n+1-22n2n－1引物个数=新增单链数=2n+1-2若消耗了引物62个,则进行了几轮的扩增。5（2）如果循环n次，则共需消耗

对引物。

则共需消耗

个引物。2n－12n+1－2（3）两种引物都结合在DNA模板链的

端；

脱氧核苷酸连接在引物的

端进行延伸。3’3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2（4）设计引物的依据是？已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。

3’用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交双链；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’【拓展思维】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？【拓展思维】PCR扩增的是整个模板DNA分子吗？不是，PCR扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段活动：构建模型，模拟PCR获取和扩增目的基因的过程材料：扭扭棒，透明胶，剪刀提示：1、DNA分子两条链反向平行2、引物是一段短单链核酸，可以定位目的基因的3′端3、DNA子链延伸的方向是从5′端到3′端4、新合成的子链可以用与母链不同颜色的扭扭棒表示3’5’3’5’3’5’5’3’（一）利用PCR在体外进行DNA片段扩增①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合；PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。探究•实践DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）PCR仪微量离心管微量移液器2.材料用具（一）DNA片段的扩增推动杆调节旋钮卸枪头按钮体积刻度吸液杆枪头（注意：加不同样品时，需要更换枪头）2.材料用具（一）DNA片段的扩增10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μL⑥PCR反应体系的配方⑤4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活。2.材料用具3.方法步骤（一）DNA片段的扩增①移液：②离心：③反应：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。可根据目的片段长度适当调整延伸时间PCR实验操作过程①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；可解离的基团pH电泳与它所带电荷相反②PCR的产物一般通过__________________来鉴定；③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象（二）利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物1.实验原理：一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。DNA分子质量越小，迁移速率越快常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）②鉴定方法：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越小，能够通过的核酸分子越小。（二）利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物1.实验原理：核酸染色剂常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。1.实验原理分子量大（长片段）分子量小（短片段）Marker:DNA分子量标准一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。DNA分子质量越小，迁移速率越快加样孔应连在电极的哪一极2.材料用具电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）（二）DNA片段的电泳鉴定①配制琼脂糖溶液

根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀②制备凝胶

将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。③加样

将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。④电泳⑤观察记录3.方法步骤梳子孔为加样孔③加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。①常使用一种有颜色的标记物指示样品迁移的速率及方向；②使样品呈现颜色，便于加样。标准参照物（Marker）DNAMarker是已知分子质量的DNA片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计样本DNA的大小。④电泳（二）DNA片段的电泳鉴定①配制琼脂糖溶液②制备凝胶③加样接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳⑤观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相荧光染色电泳结果照片①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20