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植物组织培养的基本方法（优选）植物组织培养的基本方法灭菌灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌操作。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。

1．培养基用湿热灭菌培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序按容器大小不同，保压时间有所不同（下表）。

容器的体积（ml）在121℃灭菌所需最少时间（min）２０～５０１５７５～１５０２０２５０～５００２５１０００３０2.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生物。通常采用170℃持续90分钟来灭菌。4.不耐热的物质采用过滤灭菌一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜。5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌（1）紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2米为宜。（2）熏蒸灭菌

用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是甲醛。6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70％的酒精反复涂擦灭菌，１％～２％的来苏儿溶液以及0.25～１％的新洁尔灭也可以。7.植物材料表面用消毒剂灭菌外植体的选择:外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样；取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集；器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力；外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。外植体的灭菌方法:植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。第二步是对材料的表面浸润灭菌。第三步是用灭菌剂处理。最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用的消毒液种类，涮洗3～10次左右。常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。灭菌剂使用浓度持续时间(min)去除的难易效果次氯酸钙90-100g/l5～30易很好次氯酸钠5-20g/l5～30易很好漂白粉饱和溶液5～30易很好氯化汞0.1-10g/l2-10较难最好乙醇700-750ml/l0.2-2易好过氧化氢100-120ml/l5-15最易好溴水10-20ml/l2-10易很好抗菌素4～50mg/L30～60中较好接种接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。接种前后的程序：A：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌15-20分钟，然后通风20分钟；B：手要洗净，用75%酒精擦手，在操作过程中要经常用酒精擦手；C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。D：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。

C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。1、污染：是指在组织培养过程中由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样；5、培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.所使用的外植体在常规的消毒后，可能还带有一定量的菌，可以先在培养基上进行几天的预培养，再转到分化培养基上，另外也可以通过在培养基中添加抗生素来抑菌。但光线过强刺激蒸腾加强，使水分平衡的矛盾更尖锐。C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。25～１％的新洁尔灭也可以。接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。但养分分布不均，生长速度不均衡。所使用的外植体在常规的消毒后，可能还带有一定量的菌，可以先在培养基上进行几天的预培养，再转到分化培养基上，另外也可以通过在培养基中添加抗生素来抑菌。细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。温度过高牵涉到蒸腾加强。在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基，如非洲菊、草莓等。接种的植物材料叫做外植体。培养培养：指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。（一）培养方法1．固体培养法即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。2．液体培养法即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100转／分，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。静止培养：滤纸桥培养振荡培养：磁力搅拌器、摇床、自旋式培养架(二）培养步骤：1．初代培养：即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。（1）顶芽和腋芽的发育采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长。适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其它如种子萌发后取枝条也可以。（2）不定芽的发育在培养中由外植体产生不定芽,通常首先要经脱分化过程,形成愈伤组织的细胞。多数情况下它先形成芽，后形成根。另一种方式是从器官中直接产生不定芽，如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。许多常规方法不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基，如非洲菊、草莓等。（3）体细胞胚状体的发生与发育2．继代培养：在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等,数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁出相当数量的无根苗，最后能达到边繁边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。3．生根培养：生根培养是使无根苗生根的过程。最后要使生出的不定根浓密而粗壮。生根可采用1/2或者1／4培养基，全部去掉或用低浓度的细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IAA等)。当新梢高达3cm以上时切除基部的愈伤组织。用下列方法诱导生根（1）将新梢基部浸入50或100ppmIBA溶液中处理4～8小时。（2）在含有生长素的培养基中培养4～6天。（3）直接移入含有生长素的生根培养基中。上述三种方法均能诱导新梢生根。但前二种方法对新生根的生长发育更有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。因为当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。试管内生根壮苗的阶段，目的是为了成功地移植到试管外的环境中，使试管苗适应外界的环境因子。不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18～20０℃为宜。温度过高牵涉到蒸腾加强。以及菌类易滋生等问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活．春季低温时苗床可加设电热线使基质温度略高于气温20～3０℃，这利于生根和促进根系发达，有利于提前成活。光强应比以前培养有所提高。以强度较高的漫射光为好，约4000Lx左右为宜，以维持光合作用所需光强。但光线过强刺激蒸腾加强，使水分平衡的矛盾更尖锐。并常有褐化中毒现象发生。E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。（优选）植物组织培养的基本方法一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜。（1）顶芽和腋芽的发育但养分分布不均，生长速度不均衡。所使用的外植体在常规的消毒后，可能还带有一定量的菌，可以先在培养基上进行几天的预培养，再转到分化培养基上，另外也可以通过在培养基中添加抗生素来抑菌。C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。另一种方式是从器官中直接产生不定芽，如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。如菊花，以18～20０℃为宜。消毒的化学试剂也会引起褐化；25～１％的新洁尔灭也可以。温度过高牵涉到蒸腾加强。培养物污染原因和预防措施1、污染：是指在组织培养过程中由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。污染物的长期存在会引起试管苗生活力下降，叶片缺绿，甚至死亡。2、原因：培养基及各种使用器具消毒不彻底，外植体灭菌时不彻底，操作时人为因素带入，工作区域污染等。3、控制：器具在高温灭菌后，在使用过程中需要不断地在酒精灯上进行灼烧消毒；所使用的外植体在常规的消毒后，可能还带有一定量的菌，可以先在培养基上进行几天的预培养，再转到分化培养基上，另外也可以通过在培养基中添加抗生素来抑菌。初代培养外植体的褐变

外植体褐变是指在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体有变褐色而死亡的现象。原因：很多植物都含有较多的酚类化合物，其在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在细胞受到伤害时，分隔效应被打破，酚类化合物外溢，与多酚氧化酶接触而氧化成褐色的醌类物质和水。醌类物质在酶的作用下，与外植体中的蛋白质聚合，从而使其它酶失活，组织代谢活动紊乱，生长停滞。影响因素1、植物种类和基因型：木本植物、单宁或色素含量高的植物易发生褐变；2、外植体的来源和生理状况：幼龄材料一般比成龄材料褐变轻（含酚类物质少）；同一植物冬春季取材褐变死亡率最低，其它季节不同程度增加；3、外植体的大小：小材料更易褐变，大材料切口越大，酚类氧化面越大，易褐变；消毒的化学试剂也会引起褐化；4、培养基：浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些花卉外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。5、培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。控制褐变的措施1、外植体和培养材料进行20-40天的遮光处理或暗培养，可减轻部分种类的褐化程度；2、在接种前用无菌水反复清洗外植体并对外植体进行冷藏处理，洗尽切口处渗出的酚类物质，可起到减轻褐化作用；3、控制温度和光照，在不影响正常生长和分化的前提下，尽量降低温度，减少光照；4、在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。在培养基中加入0.5-1%左右的活性炭，用以吸附褐变产生的有害物质，减轻褐变影响；5、连续转移：对容易褐变的材料可间隔12～24小时的培养后，再转移