DB12∕T 843-2018 绿豆源成分检测定性PCR法

DB12DB12ICS65.020.20天津市市场和质量监督管理委员会发布绿豆源成分检测定性PCR法Mungbean-derivedingredientsdetectio201811-07发布20181201实施天刖本标准按照GB刖本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、陈笑芸、王成、赵新、兰璞、王永、王庆平、汪小福、黄凤军、秦志I根据绿豆源特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩増。依据是否扩増获得预期的DNA片段，根据绿豆源特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩増。依据是否扩増获得预期的DNA片段，判断样品中是否含有绿豆源成分。5.1除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.21mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入8.0g氢氧化钠N（aOH)，溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。甲基氨基甲烷-盐酸T（ris-HCl)、1.5g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2)依次加入到100mL无菌去离条件下灭菌15min。5.4CTAB-Bbuffer:将1g十六烷基三甲mL无菌去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液（见5.1)调pH至8.0，加水定容至200mL。在103.4kPa(121C)条件下灭菌15min。1下列术语和定义适用于本文件。本标准绿豆源成分特异性序列位于绿豆第5号染色体。绿豆源成分检测定性PCR法2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法本标准规定了绿豆源成分的定性PCR检测方法的原理、试剂和材料、仪器、分析步骤、结果分析和表述、检出限。本标准适用于绿豆源成分的定性PCR检测。225.10琼脂糖。有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。体积混合。5.17绿豆源特异性引物：5.19石蜡油。5.22PCR产物回收试剂盒。6.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4紫外透射仪。6.5凝胶成像系统或照相系统。6.6重蒸馏水发生器或超纯水仪。3636.7其他相关仪器和设备。7.1DNA提取;转移上清液至新转移上清液至新的洁净2.0mL离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀；16000g离心10min，完全蒸发，加入100HL无菌去离子水溶解沉淀，所得溶液即为绿豆DNA，-20C贮存备用。7.2DNA的浓度和质量DNA溶液的0D260/0D280值应在1.7〜2.0之间，或质量能复合检测要求。7.3PCR扩增7.3.1.1每一个试样PCR反应设置3次重复。仪可不加）。7.3.1.5反应结束后取出PCR管，对PCR产物进行电泳检测。7.3.2.1在试样PCR扩増的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。7.4PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称取琼脂糖，加入1XTAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液，每100mL琼脂糖溶液中加入5HLEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固合成凝胶后，放入1XTAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12HLPCR产物与3HL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样空中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm〜5V/cm条件下电泳检测。电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩増条带的大小，将电泳结果形成电子文档存档或用照相系统拍照。如需通过序列分析确认PCR扩増片段是否为目的DNA片段，按照7.5和76的规定执行。7.6PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书，回收PCR扩増的DNA片段。7.7PCR产物测序验证将回收的PCR产物克隆测序，与绿豆源成分特异性序列（参见附录A)进行对比，确定PCR扩増的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析和表述8.1PCR扩增产物电泳检测结果绿豆源成分的PCR扩増产物大小为470bp，参见附录A在符合绿豆源成分的PCR产物大小为470bp的情况下，被检样品进行检测时：一一PCR扩増产物电泳检测结果阴性者判为不含绿豆源成分，表述为“未检出绿豆源成分”；一一PCR扩増产物电泳检测结果阳性者判为含有绿豆源成分，表述为“检出绿豆源成分”。本标准方法的检出限为1%(含靶序列样品DNA/总样品DNA)。4(资料性附录）绿豆源成分特异性序列注：划线部分为Mungbean—470bp—F和Mungbean—470bp—R弓丨物序列。s1TGAATGAGAGTGGTGTGAGTGAGAATAACAATCCAAGTGGCAGTCTTAACTATGAACACA61GACAAGGAAGCAAAGTAGCAATGATATAAAATGTTCAGAATCAAATTGCAGAATCCATTA121ATAAAATTTTGTAATGCAGAAGTAAGGAAAAAGTAATGTGTCCATAACACTATCCTTGCG181CTCATACTAGCTCCCCAATTTGTTTGCCTCATGCTATTATTGATCAACTACCTTATATTC241AATTCAATTCTAGATTGTAAGCACTTAAAAAATCAAGAATCTAAGAAAACAAATGCTGCA301ATGCAACCTCAACTGAAGGTAGTACAAACAGGATTGAGAAAAAGAGAGCAACAAAATAAG361AAAAAAAAGGCATAAAGAAAGTTAGCCAGTTATCATAGTTCCAGCACCTTCATCAGTTAA421AATCTCGAGCAACAAAGAGTGAGGAACCCTACCATCAATAATACTCGCGG(资料性附录）PCR检测反应体系体积PCR检测反应体系见表(资料性附录）PCR检测反应体系体积PCR检测反应体系见表B.1。PCR检测反应体系终浓度ddH2O10xPCR缓冲液25mmol/L氯化镁溶液10pmol/L下游引物DNA聚合酶试剂—1.5mmol/L0.2mmol/L0.4^mol/L0.4^mol/L2.51.5625mg/LDNA模板2.0