国家标准《氨基酸中铁和铅的测定方法原子吸收光谱法》

国家标准《氨基酸中铁和铅的测定方法原子吸收光谱法》编制说明概述1.1项目的意义及任务来源铁是人体所需一种微量元素，缺铁会引起缺铁性贫血和引起心理活动和智力发育的损害及行为改变。同时铁一旦被人体吸收，除了部分随失血丢失外，很少有其他排泄途径。如果摄入过量的铁元素，体内多余的铁以铁蛋白的形式储存起来，而铁储备过多会增加患心脏病的危险。研究发现，血红蛋白与氧的结合、分离，同铁的关系十分密切，铁过多会促进氧自由基增加，而氧自由基对机体有显著的超氧化作用，铁贮存过多会促使不稳定的自由基破坏健康的机体组织。此外，血液中的铁蛋白与胆固醇相互作用能使心脏病恶化，铁蛋白高的人心脏病发病率是正常人的两倍。人体从食物中摄取所需的大部分铁，并小心控制着铁含量。铅是一种具有积淀性的重金属元素，人体吸收到一定量后会引起重金属中毒事故。联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)，食品法典委员会(CAC)1993年食品添加剂和污染物联合专家委员会(JECFA)，建议每人每周允许摄人量(PTWD为25pg/(kg"bw)。为控制人体铅的摄人量，在食品监督领域中列为重要监测项目。所以，氨基酸中的铁和铅是氨基酸检验项目中重要的一部分，目前我国对食品中铁和铅的国家标准有GB/T5009.12-2003和GB/T5009.90-2003，国内还没有建立对氨基酸中的铁和铅的检验标准方法，国外对其已建立了标准，对铁和铅含量有严格的控制，因此，为突破国际技术壁垒，维护本国企业利益，保障国民的身体健康，对于氨基酸中的铁和铅的检验具有重要意义。本标准制订小组参考国内外氨基酸中铁和铅的各种检测方法，研究提出了原子吸收法测定氨基酸中铁和铅的检测方法，向国标委提出了制标申请，得到了国标委的立项批准，计划号：20080731-T-606本标准的制定填补了国内空白。1.2项目承担单位本标准由中华人民共和国湖北出入境检验检疫局起草完成。二、编制依据本标准的编制依据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的要求进行编制制定的。三、国内外方法概况目前对于铁的测定，国内外有一些相关研究。在国外，AACC(美国谷物化学师协会标准)40-40[1]中规定了一种定性检测方法,该方法利用铁与显色剂反应使面粉表面出现红色斑点的特性,可定性检测面粉中的三价铁。根据肉眼观测的斑点特点也可以对面粉中的铁做半定量分析。国家标准中规定谷物中铁的强化量为24mg/kg～48mg/kg。对于食品中的铁，已有国标GB/T5009.90-2003[2]《食物中铁、镁、锰的测定方法》（石墨炉原子吸收光谱法）；国标GB/T18932.12-2002[3]《蜂蜜中钾、钠、钙、镁、锌、铁、铜、锰、铬、铅含量的测定方法原子吸收光谱法》；国标GB/T18932.11-2002[4]《蜂蜜中钾、磷、铁、钙、锌、铝、钠、镁、硼、锰、铜、钡、钦、钒、镍、钻、铬含量的测定方法电感藕合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法》；对于饲料中的铁有国标GB/T13885-2003[5]《动物饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定原子吸收光谱法》；其它还有等离子体发射光谱法、比色法测定铁、重铬酸钾容量法等；在我国，铅的检验,现已有多种方法见报道：食品中的铅，已有国标GB/T5009.12-2003[6]《食品中铅的测定》（石墨炉原子吸收光谱法、氢化物原子荧光光谱法、火焰原子吸收光谱法、双硫腙比色法、单扫描极谱法）；国标GB/T5009.75-2003[7]《食品添加剂中铅的测定》（双硫踪比色法）；对大米中铅有行业标准sN/T0778一1999[8]《出口大米中铜、锌、铅、镐的测定方法原子吸收分光光度法》；对饲料中的铅有国标GB/T13080-2004[9]《饲料中铅的测定原子吸收光谱法》；对茶叶中的铅有双硫腙比色法、微分电位溶出法、微分脉冲阳极溶出伏安法、氢化物－原子荧光光谱法等；对化妆品中铅有国标GB7917.3-87[10]《化妆品卫生化学标准检验方法铅》（双硫腙萃取分光光度法、火焰原子吸收分光光度法），化妆品中的铅其它检测方法有ICP-AES法、电位溶出法等。目前，在我国对于氨基酸中的铁和铅的测定还没有统一的标准方法。虽然已有食品中的铁和铅的国标，但与食品相比，氨基酸有其特殊性，本标准拟采用目前常用的原子吸收光谱法，建立测定氨基酸中铁和铅的国家标准。本标准的制定对于氨基酸中的铁和铅的检验具有重要意义。四、主要实验技术论证4.1样品预处理方法4.1.1试样制备微量元素分析的试样制备过程应特别注意防止各种污染。所用设备如电磨、匀浆器、打碎机等必须是不锈钢制品。所用容器必须使用玻璃或聚乙烯制品。样品取样后，去杂物后、磨碎、过20目筛，立即装容器密封保存，防止空气中的灰尘和水分污染。4.1.2试样消解选用干法灰化和湿法消解对样品进行前处理，实际操作时可根据实验室条件选用以下任何一种方法消解。干法灰化:称取2.5g（精确至0.0001g）试样于瓷坩埚中，先用小火在可调式电热板上炭化至无烟，然后移入马弗炉500℃灰化6h～8h时，取出冷却。若个别试样灰化不彻底，则加1mL混合酸在可调式电炉上小火加热，反复多次直到消化完全，放冷，用硝酸(0.5mol/L)将灰分溶解，用滴管将试样消化液洗入或过滤入(视消化后试样的盐分而定)25mL容量瓶中，用水少量多次洗涤瓷坩埚，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混匀备用;同时作试剂空白。湿式消解法:称取试样2.5g（精确至0.0001g）于锥形瓶或高脚烧杯中，放数粒玻璃珠加10mL混合酸，加盖浸泡过夜，加一小漏斗在电炉上消解，若变棕黑色，再加混合酸，直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色，放冷用滴管将试样消化液洗入或过滤入(视消化后试样的盐分而定)25mL容量瓶中，用水少量多次洗涤锥形瓶或高脚烧杯，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混匀备用;同时作试剂空白。4.2仪器和分析条件4.2.1仪器所用玻璃仪器均需以硝酸(1+5)浸泡过夜，用水反复冲洗，最后用去离子水冲冼干净。原子吸收分光光度计。4.3测定（石墨炉法）4.3.1原子吸收石墨炉法测定铅的测定参考条件为波长283.3nm,狭缝0.2nm-1.0nm，灯电流5mA-7mA，干燥温度120℃,20s;灰化温度450℃，持续15s～20s，原子化温度1700℃～2300℃，持续4s～5s。;空气流量8L/min。4.3.2按照标准草案，制备铅的标准工作溶液，其浓度分别为：0μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L。标准溶液配制方法见表2。在本方法所确定的试验条件下从低到高浓度同时放入仪器进行测定，得到上述各浓度的吸光值。以铅的浓度（ug/L）为横坐标，以其吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程。线性方程及相关线性系数见表1，标准曲线见图1。由此可见，在0μg/L～80μg/L浓度范围内，铅的浓度与相应的峰面积呈良好的线性关系。表1不同浓度系列标准稀释液的配制方法元素贮备液浓度（mg/L）吸取贮备量mL定容体积（容量瓶）（mL）稀释溶液标准稀释液浓度（μg/L）铅1001000.5mol/L硝酸溶液00.15150.30250.45450.60600.8080表2铅标准溶液线性方程和相关系数铅标液浓度吸光值STD1(0μg/L)0.0096STD1(15μg/L)0.1199STD2(30μg/L)0.2123STD3(45μg/L)0.3097STD4(60μg/L)0.4078STD5(80μg/L)0.5362线性方程：y=0.0065x+0.0155，R=0.9998图1Pb标准曲线图4.3.3被测组分的浓度能产生比空白足够大的信号，这个信号能够被良好实验室在常规操作条件下以指定的置信水平定量检出，这个浓度就是测定低限。一般以产生10倍试剂空白的标准偏差的信号所对应的浓度作为测定低限。本标准设计以下试验方案：按样品前处理方法处理试剂空白样，平行做10个空白样，计算空白样品的标准偏差S空白，见表5。表3试剂空白铅的含量测定ug/L空白样品（μg/L）1234567平均标准偏差Pb3.22.10.52.21.40.53.01.91.2Pb：S空白1＝1.2μg/L测定低限＝10×S空白1×25/2.5g＝10×1.2μg/L×25mL/2.5g＝0.12mg/kg将浓度分别为1μg/L、2μg/L、5μg/L的Pb标准溶液依次进样，吸光度值明显，综合考虑，取2μg/mL为Pb的测定低限浓度，经换算，氨基酸中的Pb测定低限为0.12mg/kg,综合考虑，用原子吸收光谱-石墨炉法测定氨基酸中的铅，测定低限取为0.2mg/kg。4.3.4为确定本方法的回收率和精密度良好，设计以下实验方案：选取三个点即测定低限、两倍测定低限、四倍测定低限进行回收率和精密度试验，选取谷氨酸和丙氨酸进行回收率和精密度试验，谷氨酸加标量为0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg，丙氨酸加标量为0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg。表4谷氨酸中铅加标回收率及精密度试验次数本底（mg/kg）加标量Pb=0.2mg/kg加标量Pb=0.4mg/kg加标量Pb=0.8mg/kg实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）1未检出0.1890.000.3895.000.7897.52未检出0.1995.000.3997.500.82102.53未检出0.1890.000.40100.000.7897.54未检出0.20100.000.3895.000.7796.255未检出0.21105.000.41102.500.76956未检出0.21105.000.3792.500.82102.57未检出0.1890.000.3895.000.7695平均%――――96.4――96.8――98.0RSD%――7.2――3.6――3.3――‘表5丙氨酸中铅加标回收率及精密度试验次数本底（mg/kg）加标量Pb=0.2mg/kg加标量Pb=0.4mg/kg加标量Pb=0.8mg/kg实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）1未检出0.1995.00.3690.00.7594.02未检出0.21105.00.3997.50.7796.03未检出0.21105.00.41102.50.80100.04未检出0.1890.00.3895.00.82102.05未检出0.1890.00.40100.00.7898.06未检出0.20100.00.3895.00.7594.07未检出0.1995.00.41102.50.80100.0平均%――――97.1――97.5――97.7RSD%――6.5――4.7――3.2――4.4铁和铅的测定(火焰原子吸收法)4.4.1铅和铁的原子吸铅的测定参考条件为波长283.3nm，铁的参考条件波长248.3nm,火焰为空气-乙炔；稀释溶液0.5mol/L硝酸。4.4.2方法线性范围按照标准草案，制备铁和铅的标准工作溶液，铅浓度分别为：0mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L。铁标准溶液浓度分别为0、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、10mg/L；标准溶液配制方法见表6。在本方法所确定的试验条件下从低到高浓度依次放入仪器进行测定，得到上述各浓度的吸光值。以铅和铁的浓度（mg/L）为横坐标，以其吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程。线性方程及相关线性系数见表1，标准曲线见图1。由此可见，铅在0mg/L～10mg/L浓度范围内，铅的浓度与相应的吸光值呈良好的线性关系,铁在0～10mg/L浓度范围内，铁的浓度与相应的吸光值呈良好线性关系。表6不同浓度标液稀释元素贮备液浓度（mg/L）吸取贮备量mL定容体积（容量瓶）（mL）稀释溶液标准稀释液浓度（mg/L）铅10001000.5mol/L硝酸溶液01122446688101000.5mol/L硝酸溶液10铁100000.50.5112244881010表7铅标准溶液线性方程和相关系数铅标液浓度吸光值STD0(0mg/L)0.0001STD1(1mg/L)0.0392STD2(2mg/L)0.0775STD3(4mg/L)0.1532STD4(6mg/L)0.2349STD5(8mg/L)0.3017STD6(10mg/L)0.3917线性方程：y=0.0387x-0.0002，R=0.9996图2铅标准曲线表8铁标准溶液线性方程和相关系数铁标液浓度吸光值STD0(0mg/L)0.001STD1(0.5mg/L)0.0332STD2(1mg/L)0.0627STD3(2mg/L)0.1219STD4(4mg/L)0.2408STD5(8mg/L)0.4812STD6(10mg/L)0.6193线性方程：y=0.0611x+0.0002，R=0.9998图3铁标准曲线4.4.3方法测定低限被测组分的浓度能产生比空白足够大的信号，这个信号能够被良好实验室在常规操作条件下以指定的置信水平定量检出，这个浓度就是测定低限。一般以产生10倍试剂空白的标准偏差的信号所对应的浓度作为测定低限。本标准设计以下试验方案：按样品前处理方法处理试剂空白样，平行做10个空白样，计算空白样品的标准偏差S空白，见表5。表9试剂空白铅和铁的含量测定mg/L空白样品（μg/L）1234567平均标准偏差Pb0.090.110.070.100.080.070.060.080.018Fe0.060.080.110.080.080.190.090.0850.016Pb：S空白1＝0.018mg/L测定低限＝10×S空白1×25/2.5g＝10×0.018mg/L×25mL/2.5g＝1.8mg/kgFe：S空白2＝0.016mg/L测定低限＝10×S空白2×25/2.5g＝10×0.016mg/L×25mL/2.5g＝1.6mg/kg将浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L的Pb、Fe标准溶液依次进样，吸光度值明显，经换算，氨基酸中的Pb测定低限为1.8mg/kg,Fe测定低限位1.6mg/kg综合考虑，用原子吸收光谱-火焰法测定氨基酸中的铅测定低限取为2mg/kg、铁为2mg/kg。4.4.5样品中的铅和铁的精密度和回收率试验为确定本方法的回收率和精密度良好，设计以下实验方案：选取三个点即测定低限、两倍测定低限、十倍测定低限进行回收率和精密度试验，选取谷氨酸和丙氨酸进行回收率和精密度试验，谷氨酸加标量为2mg/kg、4mg/kg、20mg/kg，丙氨酸加标量为2mg/kg、4mg/kg、20mg/kg。表9谷氨酸中铅加标回收率及精密度试验次数本底（mg/kg）加标量Pb=2mg/kg加标量Pb=4mg/kg加标量Pb=20mg/kg实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）1未检出1.8592.5410019.798.52未检出1.9899.03.997.520.5102.53未检出2.05102.54.1102.519.2964未检出1.9597.53.89520.3101.55未检出1.9095.04.1102.520.1100.56未检出1.8592.53.997.519.6987未检出2.07103.53.895.019.999.5平均%――――97.5――98.6――99.5RSD%――4.6――3.2――2.2――表10谷氨酸中铁加标回收率及精密度试验次数本底（mg/kg）加标量Fe=2mg/kg加标量Fe=4mg/kg加标量Fe=20mg/kg实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）14.025.8189.57.7793.825.22106.024.025.7787.57.9097.024.52102.534.025.9094.08.13102.823.8299.044.025.8591.57.9798.824.12100.554.025.9295.08.10102.024.72103.564.025.8491.07.9498.023.8299.074.025.9998.58.0099.524.12100.5平均%――――92.4――98.8――101.5RSD%――4.0――3.1――2.5――表11丙氨酸中铅加标回收率及精密度试验次数本底（mg/kg）加标量Pb=2mg/kg加标量Pb=4mg/kg加标量Pb=20mg/kg实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）1未检出1.8291.03.8395.819.196.02未检出1.995.03.7894.520.3101.53未检出2.01100.54.05101.319.296.04未检出1.9597.53.997.519.597.55未检出1.995.04.12103.019.899.06未检出1.9296.03.8696.519.497.07未检出2.07103.53.9197.820.1100.5平均%――――96.9――98.0――98.1RSD%――4.3――3.1――2.3――表12丙氨酸中铁加标回收率及精密度试验次数本底（mg/kg）加标量Fe=2mg/kg加标量Fe=4mg/kg加标量Fe=20mg/kg实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）实测值（mg/kg）回收率（%）13.855.6389.07.6194.023.3597.523.855.8097.57.7798.024.15101.533.855.7494.57.90101.323.5598.543.855.87101.07.6895.823.3597.553.855.7796.07.7697.824.65104.063.855.6690.57.97103.023.0596.073.855.8198.07.8098.822.6594.0平均%――――95.2――98.4――98.4RSD%――4.5――3.1――3.4――4.5验证试验取氨基酸样品，谷氨酸和丙氨酸。经荆州出入境检验检疫局、山东出入境检验检疫局、广西出入境检验检疫局、广东出入境检验检疫局、南通出入境检验检疫局、襄樊出入境检验检疫局、六家单位对添加了铅和铁的样品进行验证试验，精密度试验原始数据见表14和15。根据GB/T6379.2-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》，分别用格拉布斯法和柯克伦法对每一单元的平均值、各实验室的方差值进行检验，计算总平均值、重复性和再现性，结果见表16(火焰法)添加水平4mg/kg验证单位谷氨酸+4mg/kg丙氨酸+4mg/kg本底（未检出）本底4mg/kg本底（未检出）本底3.5mg/kgPb(mg/kg)Fe(mg/kg)Pb(mg/kg)Fe(mg/kg)荆州出入境检验检验局4.157.894.087.364.227.953.977.52山东出入境检验检验局4.088.213.867.284.208.154.007.47广西出入境检验检验局3.687.723.767.193.757.813.927.30广东出入境检验检验局3.898.053.837.424.017.913.907.36南通出入境检验检验局3.797.883.717.553.947.763.827.68襄樊出入境检验检验局3.728.074.057.403.568.204.107.49(石墨炉法)添加水平0.4mg/kg验证单位谷氨酸+0.4mg/kg丙氨酸+0.4mg/kgPb(mg/kg)Pb(mg/kg)荆州出入境检验检验局0.350.380.410.42山东出入境检验检验局0.320.450.370.38广西出入境检验检验局0.370.340.410.36广东出入境检验检验局0.360.350.390.38南通出入境检验检验局0.380.410.380.38海南出入境检验检验局0.410.350.370.374.6各种氨基酸铁和铅的测定表样品中铁和铅含量mg/kg序号样品名称样品编号生产厂家铅含量铁含量1Β-氨基丙酸200929145远华生物未检出4.252L-色氨酸21200902678湖北八峰药业未检出4.013L-缬氨酸21000071三峡药厂未检出3.754L-异亮氨酸200917307宜昌三峡药厂未检出4.25L-组氨酸盐酸盐-水合物200916670宜昌检验检疫局未检出2.266L-半胱氨酸盐酸盐-水合物200928444武汉远大宏远股份有限公司1.14.837L-半胱氨酸盐酸盐-水合物200928445武汉远大宏远股份有限公司0.833.638L-半胱氨酸盐酸盐-水合物200928446武汉远大宏远股份有限公司1.22.999L-半胱氨酸盐酸盐-水合物200928447武汉远大宏远股份有限公司1.34.7710L-半胱氨酸盐酸盐-水合物200928448武汉远大宏远股份有限公司1.32.7811L-丝氨酸200728448湖北友芝友生物科技有限公司0.43.6912L-精氨酸L-焦谷氨酸200921273武汉阿米诺科技有限公司0.294.2513N-乙酰L-酪氨酸200804481武汉武大宏远股份有限公司0.104.0614L-精氨酸盐酸盐200919252宜昌出入境检验检疫局未检出3.2715L-精氨酸200919582宜昌出入境检验检疫局未检出3.7816L-醋酸赖氨酸200803782三峡药厂未检出4.4317L-