THBIQA 0003.3-2024 食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法 第3部分：沙丁鱼实时荧光PCR法

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T/HBIQAT/HBIQA0003.3—2024食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法3PCRDetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart3:SardinapilchardusReal-timePCRmethod2024-08-15发布 2024-10-15实施河北省检验检疫学会发布T/HBIQA0003.3—2024T/HBIQA0003.3—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。T/HBIQA0003.3-2024《食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法实时荧光PCR法系列标准》分为7个部分：1PCR2PCR3PCR4PCR5PCR6PCR法第7部分：蓝点马鲛实时荧光PCR法T/HBIQA0003.3-20243本文件主要起草人：王金凤、陈志敏、项佳林、王建昌、付琦、孙晓霞、姜彦芬、董振国、蒲静。 T/HBIQA0003.3—2024T/HBIQA0003.3—2024PAGEPAGE2食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法第3部分：沙丁鱼实时荧光PCR法范围本部分规定了食品中沙丁鱼源性成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于食品中沙丁鱼源性成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.1%（质量分数）。（）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测术语和定义下列术语和定义适用于本标准。沙丁鱼Sardinapilchardus。实时荧光PCR real-time在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct值 cyclethresholdvalue每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR（Polymerasechainreaction）DNA（deoxyribonuleicacid）Cytbb基因（Cytochromebgene）dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）CTAB（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基（tris（hydroxymethyl）aminomethane）EDTA（ethylenediaminetetraaceticacid）FAM（carboxyfluorescein）BHQ11原理实时荧光法是在提取样品DNA为模板，以沙丁鱼Cytb基因中相对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧光性分析。试剂和材料GB/T6682。表1引物和探针序列名称序列（5′-3′）目的基因内参照F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA真核生物18SrRNA基因R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTP:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1沙丁鱼F:CTCCAACATTTCGGTCTGATGACytb基因R:TCCTGTTAGGATCTGGGATGCTP:FAM-ATTTCGGATCACTCCTGGGCCTATGCT-BHQ1CTAB裂解液：20g/LCTAB，0.1mol/LTris-HCI（pH8.0），1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA（pH8.0）。CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。蛋白酶K（20mg/mL），-2075%荧光预混液（2×）。TE（Tr-ETA缓冲液10oLrHlpH8.1oLEDA（H8.0。仪器和设备仪。12000g。7.5 （0.1μL～2.5μL,1μL～10μL,10μL～100μL,20μL～200μL,100μL～1000μL）。pH0.1。0.01g。均质器。检验步骤样品前处理鱼罐头、鱼肠、鱼丸等食品取肉糜300mg，置于三氯甲烷:甲醇:水混合溶液(1:2:0.8)中室温孵育过夜，去除油脂的肌肉组织可用于核酸提取；鱼肉、鱼排、鱼糜等鱼肉制品取300mg，用生理盐水清洗后，放入研钵中，在研钵中倒入液氮，将样品在液氮中研磨成粉末或用冷冻研磨仪研磨成粉末。DNA50mg2mL1.5mL10μLK，min12000r/min5min400μL:12000r/min5，吸取上清液至另一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后室温下静置1h12000r/min1050μLDNA-20℃保存DNADNA。DNA取适量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别测定260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照公式（1）计算：c=A260×N×50 （1）公式（1）中：c ——DNA（μg/μL）；A260——260nm处的吸光值；N ——当A260/A280比值在1.7～2.0之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。实时荧光检测实时荧光反应体系实时荧光PCR反应参数见表2。每个样品各做两个平行管，可先将反应试剂及引物预混成混合液。表2 实时荧光PCR反应体系试剂名称终浓度反应体系/μL荧光PCR预混液（2×）1×12.5F(10μmol/L)400nmol/L1R(10μmol/L)400nmol/L1P(10μmol/L)400nmol/L1DNA模板(50-100ng/μL)—2.0补水至—25扩增条件℃预变性30℃15℃35s（），40试验对照检验过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。以沙丁鱼提取的DNA为阳性对照，以已知不含有沙丁鱼的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、阳性对照、阴性对照、空白对照各设置两个平行。质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：Ct值>40.0。Ct值>40.0。Ct值<30.0。Ct值＜30.0。结果判定在符合第9章的情况下，被检样品进行检测时：a）Ct值≤35.0b）Ct值≥40.0c）35.0＜Ct值＜40.0Ct值仍为＜40.0Ct值≥40.0结果表述防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行。