2024杀鲑气单胞菌病诊断方法

杀鲑气单胞菌病诊断方法杀鲑气单胞菌病诊断方法范围（AeromonasPCRPCR本文件适用于杀鲑气单胞菌病的普查和诊断，以及感染杀鲑气单胞菌病的流行病学调查、诊断和出入境鱼类检疫。（GB/T6682 GB/T18088 本文件没有需要界定的术语和定义。缩略语下列缩略语适用于本文件。BHQ1：黑洞淬灭剂1（Blackholequencher1）bp：碱基对（Basepair）CATB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammoniumbromide）Ct：扩增循环数（Cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸混合物（Deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）qPCR：实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitativerealtimepolymerasechainreaction）TAE：TAE电泳缓冲液（tirs-acetate-ethylenediaminetetraaceticacidbuffer）TSA：胰蛋白胨大豆胨琼脂TSB：胰蛋白胨大豆肉汤Tris：三羟甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane）Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）vapA：毒力阵列蛋白A（VirulencearrayproteinA）本文件中所有化学试剂，除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水：符合GB/T6682（TSA）培养基：按A.1血琼脂培养基：按A.2（TSB）培养基：按A.3电泳缓冲液：按A.41.5%琼脂糖凝胶：按A.5配制。dNTPs（10mM）：-20保存。Taq（5U/）：-20保存。DNAMarkerDL2000：-20℃4(2%)。氯仿。（5M）。PCR（10μM）：5’-CATGCTGCCAATGGTCGTGG-3’，-20PCR（10μM）：5’-CGCCTTCAGCATTGGATTTC-3’，-20PCR（10μM）：5’-TAAAGCACTGTCTGTTACC-3’，-20PCR（10μM）：5’-GCTACTTCACCCTGATTGG-3’，-20PCR（10μM）：5’-FAM-ACATCAGCAGGCTTCAGAGTCACTG-BHQ1-3’，-20℃保存。PCRPCRPCRB.4。样品采样按GB/T18088规定执行。无菌采集脾脏、肝脏、肾脏样本。消毒病灶表面，无菌采集病灶深处的组织，同时采集肾脏、脾脏、肝脏。8.2分离培养用接种环（无菌）蘸取无菌采集的病料，划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基（或血琼脂培养基）上，25℃±3℃培养24h~72h。挑取光滑、圆整、凸起、半透明的单个菌落。有菌落会出现β-溶血或色素沉着。11min～2min1min～3min95%0.5min～1min10s～30s取干净的载玻片，滴1滴～2滴生理盐水。用接种环挑取9.1中培养好的单菌落涂抹在水滴中，盖上盖玻片。400倍～600倍显微镜检。杀鲑气单胞菌菌体在原位颤动，没有运动性。5sCPCRDNADNA100~300mg8.1.24℃10.2.1.12ml700µL2%65℃700μL氯仿000r/min101.5ml212000r/min5minDNA500μL70%10.2.1.2DNA12000r/min5min25min100μLDNA-20℃DNA分别挑取TSA5mLTSB253200rpm16h～241mL1.5mL000rpm/min5min100100℃10min～133minDNA-20℃注：DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒。2510×PCR2.5µL（101µLµL、DNA（5）0.5、MgCL2（25mmol/L）2.5、DNA225。PCR混液。94℃3min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环。72℃延伸10min。8μLPCR（）2μL1.5%DNAMarkerDL2000V/cm3/4264bpPCR264bpPCRPCR扩增产物序列与NCBI99%264bpPCR按照10.1规定执行。DNA按照10.2规定执行。2510×PCR2.5µL（100.5µL（10）1µLµLDNA（5µLmmol/DNA225µL。注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同反应总体积进行适当调整。亦可使用经验证的商品化TaqMan探针实时荧光PCR扩增预混液。95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸20s，40个循环；在56℃阶段设置采集荧光。注：PCR反应参数可根据反应体系和不同品牌PCR仪做适当调整。阳性对照Ct值≤35，有典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照无典型扩增曲线或Ct值≥40，试验结果成立；否则，试验不成立。被检样品Ct值≤35，且有典型扩增曲线，判定被检样品杀鲑气单胞菌检测结果为阳性；Ct值或Ct值≥4035<Ct40Ct值≥40检测结果符合以下任何一项，判定为疑似感染：——出现典型临床症状；——组织中检测到杀鲑气单胞菌核酸。对疑似感染杀鲑气单胞菌病的样本进行细菌分离鉴定，符合以下任何一项，判定为确诊感染：——所分离细菌，理化鉴定为杀鲑气单胞菌检测结果阳性；——所分离细菌，普通PCR检测为杀鲑气单胞菌检测结果阳性；——所分离细菌，实时荧光PCR检测为杀鲑气单胞菌检测结果阳性。附录A（）胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基胰酪白15.0大豆白5.0氯化5.0琼脂15.0将A.1.11000pH7.3±0.2，121℃高压灭菌15min45℃～50成分胰酪白10.0大豆白5.0氯化3.0琼15.0灭菌纤羊或50mL～100mL制法将A.2.11000pH7.3±0.2，121℃高压灭菌15min45℃～501000mL（TSB）成分胰蛋15.0大豆白5.0氯化3.0蒸馏1000制法将A.3.1中的各种成分混匀，完全溶解后，调节pH7.3±0.2，121℃高压灭菌15min，冷却后备用。成分三羟基基烷（Tris） 4.84乙二四酸钠（EDTA-Na2） 0.744冰乙酸 1.142蒸馏1000制法将A.4.1中的各种成分混匀，完全溶解后，调节pH7.3±0.2，121℃高压灭菌15min，冷却后备用。1.5%成分泳冲液 100琼脂1.5核酸料 0.5制法将A.5.1中的各种成分混匀，加热完全溶解后，15℃~25℃冷却至固体，现配现用。附录B（资料性）疾病概述（theinfectionofAeromonassalmonicida）（Aeromonassalmonicida）γ-鲑气单胞菌有多个亚种，包括杀鲑亚种（Aeromonassalmonicidasubsp.salmonicida）、无色亚种（Aeromonassalmonicidasubsp.achromogenes)、杀日本鲑亚种（Aeromonassalmonicidasubsp.aoucdemoasaoncdasubp.haAermoasaoncdasubp.pectinolytica)（Salmotrutta）（Salvelinusfontinalis）（Squaliuscephalus）（Leuciscusleuciscus）（Anguilla（Thymallus)（Coregonus（Polyodon（Esoxlucius）（Dicentrarchuslabrax）（Petromyzonmarinus）等。（amosaaavenusapnu（Oncorhynchus(Oncorhynchusmykiss)（Salvelinus（Salmo（Thymallus)（Gadus（Hippoglossushippoglossus）（Cyprinuscarpio）（Anguillaanguilla）（Sebastesschlegeli）（Esoxlucius）等。/或粘液从排气口排出等症状。疖疮通常在背部一处410402030404天至21天～3，60℃下分钟可杀灭杀鲑气单胞菌。在被有机物污染的水中，可以存活长达23天。在死鱼体内，5℃的温度下，沙门氏菌可在内脏中存活长达6天。附录C（规范性）生化特性表C.1杀鲑气单胞菌各亚种的生化特性表生化特性杀鲑气单胞菌亚种杀鲑亚种无色亚种杀日本鲑亚种史氏亚种溶果胶亚种运动性-----β-溶血+-+--氧化酶+++++