生物公司学习培训课件：凝胶法BET检查技术教程

凝胶法BET检查技术生物有限公司xxxx年5月1、凝胶法BET定义2、凝胶法BET试验程序3、试验器具4、鲎试剂灵敏度复核试验5、干扰初筛试验6、干扰试验7、检查法凝胶法BET检查技术21、凝胶法BET定义定义：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来限量检测或半定量内毒素的方法。实验方法：

30.1mlTAL溶液0.1ml供试品溶液37±1℃

60±2min阳性（+）阴性（-）+（+）（-）2、凝胶法BET的试验程序试验准备鲎试剂灵敏度复核试验供试品干扰初筛试验干扰试验日常检查结果判断43、试验器具恒温仪器：如干式恒温仪、恒温水浴箱旋涡混合器电热恒温干燥箱-具有250℃以上恒温的

功能51）设备干式恒温仪恒温仪器恒温水浴箱干式恒温仪孵育反应温度是鲎试验的重要条件参数之一现行法规对反应温度的要求较宽松(37±1℃)严格的实验条件是实验室水平的重要标志之一6TAL-40型试管恒温仪的特点温控精确：37±0.2℃发热均匀：<0.1℃可定时及提示：0~90分钟任

意可设定时，到时蜂鸣提示试管免封口，无水蒸气或水

滴影响体积小巧，使用方便73、试验器具内毒素标准品细菌内毒素检查用水凝胶法鲎试剂82）试剂3、试验器具用具分类试验用具名称反应试管无热原玻璃试管（外径10mm×75mm）稀释容器稀释试管、无热原安瓿(2ml/支，5ml/支）移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头等其他试管架、安瓿架、异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记笔、时钟等3）试验用具

910试验用具要求玻璃器具需经250℃、30分钟以上干烤处理塑料器械，应选用标明无内毒素且对试验无干扰的器械-凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。1、浸泡2、除标签、记号3、去杂质4、清洗5、冲干净、晾干6、泡酸玻璃器具的清洗、除热原118、蒸馏水冲洗9、晾干后包装干烤7、自来水冲洗玻璃器具的清洗、除热原12试验中所使用的玻璃仪器清洁与否，直接影响试验结果。13常见问题：干烤除热原后，可以保存多久？在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外原性内毒素。——中国药品检验标准操作规程2010版-细菌内毒素检查法最好要在本实验室做确认！4、鲎试剂灵敏度复核试验实验目的验证实验室的条件是否满足BET实验的要求验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET用水等）是否满足BET实验的要求验证实验所用器具是否满足BET实验的要求

144、鲎试剂灵敏度复核试验试验步骤开启恒温仪器预热溶液C的制备鲎试剂的准备加样及恒温反应结果判断数据处理

15稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液(C溶液)混匀*BET水复溶内毒素标准品：RSE或CSE操作步骤示意图按说明书要求鲎试剂：TAL单次试验试剂：原安瓿大装量试剂：反应试管鲎试剂复溶液复溶混匀第1步第2步轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合至少30秒160.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管NC：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管37℃±1℃，孵育60min±2min混匀（水浴恒温需封口）翻转180度，观察凝胶状况操作步骤示意图第3步17何时需做这个试验呢？1、使用新批号的鲎试剂2、试验条件有任何可能会影响检验结果的改变

18灵敏度复核试验举例试剂试剂名称厂家规格标示效价数量鲎试剂(TAL)安度斯0.1ml/支(1.25ml/支)0.25EU/ml18支(2支)内毒素标准品(CSE)安度斯10EU/支1BET水(W)安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml1191）试验前，将恒温仪预热至37℃2.0ml30s2.0ml2.0ml单位(EU/mL)30s130s0.4ml3.6ml10CSEBET水1.0ml混合5分钟30s2.0ml2.0ml2.0ml0.5(2λ)0.25(λ)2.0ml30s2.0ml0.125(0.5λ)0.06(0.25λ)2）标准内毒素溶液C的制备202）鲎试剂的准备(单次试验试剂)取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两管，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列；用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解分别加入0.1mL

BET水复溶212）鲎试剂的准备(大装量试剂)取1.25ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂2支，在安瓿颈部折断，用精确移液器准确吸取1.25mlBET水分别加入两支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解。取18支（10×75）mm反应试管，按照阴性对照溶液D两管，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列：把两支鲎试剂合并后，分别取0.1ml鲎试剂溶液分装到18支反应试管中。分别加入0.1mL复溶后的鲎试剂溶液223）加样用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液C，加入复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿（或分装有0.1ml鲎试剂的反应试管）中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET水（溶液D）加入另外两管，作为阴性对照0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml分别加入CSE

0.1mLBET水鲎试剂原安瓿反应试管加样顺序从低浓度到高浓度234）恒温反应将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染245）结果判断将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180℃，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“＋”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“-”。25＋＋＋＋－－－－阳性阴性结果判断：反应管缓缓倒转180º阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱5）结果判断试验符合要求的基本条件：

NC管全部阴性（－－）

2λ管全部阳性（＋＋＋＋）

0.25λ管全部阴性（－－－－）266）数据处理举例0.125平行管内毒素标准溶液浓度(EU/ml)NC反应终点浓度X（lg反应终点浓度）0.50.250.061＋＋－－0.125－0.9032＋＋－－－0.25－0.6023＋＋－－－－0.6024＋＋－－－0.25－0.602＋0.2527λc=antilg（ΣX/4）

=antilg{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0.602)＋(－0.602)]/4}=0.210EU/ml即本批号鲎试剂的复核灵敏度（λc

）为0.210EU/ml药典要求：结论：本批TAL的灵敏度标示值符合规定。6）数据处理举例当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度值。28问题讨论1、做细菌内毒素检查试验，对环境有什么要求？是否需要在洁净度100级的环境里进行？2、换环境后，是否需要做环境验证？3、RSE、CSE、BET水开启后可以放多长时间?怎么保存？4、CSE稀释到所需浓度，封好，放在冰箱，可以保存多久？29问题讨论5、鲎试剂灵敏度复核试验是否一定要做？厂家出厂时就应该保证鲎试剂的灵敏度合格。鲎试剂复溶后要放在混合器上混合吗？鲎试剂可以稀释吗？305、干扰初筛试验目的及原理本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2λ内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出样品对鲎试验无干扰的浓度本试验可减少干扰试验的盲目性本试验不是药典规定的试验31试验步骤试验材料的准备供试品限值的确定从药典中查出L按公式计算：L=K/M试剂的选择可使用任一灵敏度的鲎试剂；一般为了试验的方便，选择灵敏度低的鲎试剂；若供试品的限值很低，则应该选择灵敏度高的鲎试剂。32试验步骤

供试品最大有效稀释倍数的确定例：某样品的内毒素限值为0.5EU/ml，则可以稀释的倍数和浓度范围如下33灵敏度λ（EU/ml)0.50.250.1250.060.03MVD0.5MVD0.25MVD0.125MVD0.06MVD0.03稀释倍数124816试验步骤

反应溶液的制备溶液A：将供试品稀释至鲎试剂常规灵敏度下所对应的MVD溶液B：含2λ浓度标准内毒素的溶液A溶液C：2λ浓度的标准内毒素溶液溶液D：BET水加样及反应0.1ml鲎试剂溶液+0.1ml各反应溶液，各平行2管结果判断34举例：硫酸庆大霉素注射液干扰初筛试验1）供试品限值硫酸庆大霉素注射液(S)，规格：1ml：2万单位；药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.50EU/mg;1000庆大霉素单位相当于1mg庆大霉素。352）试剂为了方便试验，干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验试剂名称厂家规格标示效价数量鲎试剂（TAL）安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24内毒素标准品（CSE）

安度斯10EU/支1BET水（W）安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml1363）最大有效稀释倍数的确定最大有效稀释倍数MVD=cL/λ使用λ=0.5EU/mL灵敏度的鲎试剂时，MVD0.5

=因此可计算出使用不同λ时所对应的MVD：灵敏度λ（EU/ml）0.50.250.1250.060.03对应的MVD（倍）2040801603200.5EU/ml20mg/ml×0.50EU/mg=20（倍）374）各反应溶液的制备注:S20表示样品20倍稀释液，下标表示稀释倍数;

E2λ

表示内毒素的浓度为2λ。溶液编号AD溶液内容S20S40S80S160S320W平行管溶液编号BC溶液内容S20E2λS40E2λS80E2λS160E2λS320E2λE2λ平行管38备用液溶液C的制备E100.5ml0.5mlWE0.5溶液C：E2λ溶液A的制备3.6mlW1.0mlW1.0mlS320溶液AS原液0.4mlS101.4ml1.4mlWS201.4ml1.4mlWS401.4ml1.4mlWS801.4ml1.4mlWS1600.4ml3.6mlWE1备用液39E1S100.5ml0.5mlS20E0.5E1S200.5ml0.5mlS40E0.5E1S800.5ml0.5mlS160E0.5E1S1600.5ml0.5mlS320E0.5E1S400.5ml0.5mlS80E0.5溶液B：SE2λ注意事项：制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少30秒。溶液B的制备405）加样及反应开启24支鲎试剂，分别用移液器准确吸取0.1mlBET水将鲎试剂复溶取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反应管，每浓度平行2管另外取0.1mlBET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管37±1℃反应60±2分钟416）结果判断当溶液D为阴性；溶液C为阳性时，试验有效结果1：溶液A系列反应的结果全是阴性，溶液B系列全部是阳性结果2：溶液A系列反应的结果全是阴性，溶液B系列在某一浓度处才开始是阳性结果3：溶液A系列与溶液B系列反应的结果全是阳性结果4：溶液A系列与溶液B系列反应的结果全是阴性426）结果判断溶液编号AD溶液内容S20S40S80S160S320W平行管溶液编号BC溶液内容S20E2λS40E2λS80E2λS160E2λS320E2λE2λ平行管--++----------++++++++++结果1：溶液A系列反应的结果全是阴性，溶液B系列全部是阳性-无干扰436）结果判断溶液编号AD溶液内容S20S40S80S160S320W平行管溶液编号BC溶液内容S20E2λS40E2λS80E2λS160E2λS320E2λE2λ平行管--++----------++++++++结果2：溶液A系列反应的结果全是阴性，溶液B系列在某一浓度处才开始是阳性-某浓度开始无干扰--446）结果判断溶液编号AD溶液内容S20S40S80S160S320W平行管溶液编号BC溶液内容S20E2λS40E2λS80E2λS160E2λS320E2λE2λ平行管--++++++++++++结果3：溶液A系列与溶液B系列反应的结果全是阳性-样品内毒素含量高或增强++++++++++456）结果判断溶液编号AD溶液内容S20S40S80S160S320W平行管溶液编号BC溶液内容S20E2λS40E2λS80E2λS160E2λS320E2λE2λ平行管------------++结果4：溶液A系列与溶液B系列反应的结果全是阴性-抑制----------466）结果判断-本试验结果溶液A、D均为阴性；溶液C均为阳性，试验有效溶液B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为≥S40

溶液编号AD溶液内容S20S40S80S160S320W平行管溶液编号BC溶液内容S20E2λS40E2λS80E2λS160E2λS320E2λE2λ平行管--++----------++++++--++47问题讨论1、在什么情况下，要做干扰初筛试验，方法学建立是否一定要做干扰初筛试验？2、内毒素溶液和供试品溶液的稀释一次不能超过10倍，为什么？会有什么影响？486、干扰试验目的：确定供试品在某种浓度下是否适合做细菌内毒素检查。原理：通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。至少对3批样品进行干扰试验49试验步骤试验材料的准备供试品限值的确定鲎试剂的选择MVD的计算反应溶液的制备加样及反应结果判断50新品种建立方法鲎试剂的来源改变鲎试剂的配方、生产工艺改变供试品的来源改变供试品的配方、生产工艺改变试验环境中发生了其它有可能影响试验结果的变化在何种情况下需做干扰试验？51举例：硫酸庆大霉素注射液干扰试验1）供试品限值硫酸庆大霉素注射液(S)，规格：1ml：2万单位；药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.50EU/mg;1000庆大霉素单位相当于1mg庆大霉素。522）试剂的选择根据干扰初筛试验的结果，供试品在40倍稀释（对应鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml）时无干扰一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度做干扰试验。这里我们选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行干扰验证试验。why532）试剂的选择试剂名称厂家规格标示效价数量鲎试剂（TAL）安度斯0.1ml/支0.125EU/ml36内毒素标准品（CSE）

安度斯10EU/支1BET水（W)安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml13）最大有效稀释倍数的计算MVD=cL/λ=80（倍）544）各反应溶液的制备溶液编号CD溶液内容E0.25E0.125E0.06E0.03W平行管溶液编号BA溶液内容S80E0.25S80E0.125S80E0.06S80E0.03S80平行管55溶液C的制备0.4ml30s10CSEBET水1.0ml1.8ml1.03.6ml30s30s30s1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml30s1.8ml1.8ml(EU/ml)溶液C混合5分钟0.25(2λ)0.125(λ)0.06(0.5λ)0.03(0.25λ)0.5(4λ)56溶液A的制备S原液0.3ml2.7mlWS101ml3mlWS400.6ml0.6mlWS80硫酸庆大霉素S0.3mlS102.7ml1.0ml3.0ml溶液A：S80BET水0.6ml0.6mlS4057溶液B的制备E0.5S400.5ml0.5mlS80E0.25E0.25S400.5ml0.5mlS80E0.125E0.125S400.5ml0.5mlS80E0.06E0.06S400.5ml0.5mlS80E0.03585）加样及反应开启36支鲎试剂，先分别用0.1mlBET水复溶,再分别加相应的溶液0.1ml（A、B、C和D）37±1℃反应60±2分钟0.25EU/ml(2λ)0.125EU/ml(λ)0.06EU/ml(½λ)0.03EU/ml(¼λ)BET水S80E0.25(SE2λ)S80E0.125(SEλ)S80E0.06(SE½λ)S80E0.03(SE¼λ)S80596）结果判断反应结果1-本试验结果溶液编号C（Es系列）D溶液内容E0.25

E0.125

E0.06

E0.03W平行管溶液编号B（Et系列）A溶液内容S80E0.25

S80E0.125

S80E0.06

S80E0.03S80平行管－－－－－－－－－－－－－－－－－－－+++++++++++++++++60结果计算及判断药典规定：当溶液A和溶液D（阴性对照）的所有平行管都为阴性，且0.5λ

≤

Es≤

2λ时，试验有效。当0.5Es≤Et

≤2Es时，供试品在该浓度下无干扰。

ES=antilg4(lg0.125)×4=0.125EU/mlEt=antilg=0.104EU/ml(lg0.06)+(lg0.125)×3461本试验：1）0.5λ=0.06，2λ=0.25

Es=0.125，0.5λ<Es<2λ，有效!2）0.5Es=0.06，2Es=0.25 Et=0.104，0.5Es<Et<2Es

，无干扰

结论：使用灵敏度λ=0.125EU/ml的鲎试剂对样品(S)的80倍稀释液(S80)作BET，无干扰结果计算及判断626）结果判断反应结果2-无干扰溶液编号C（Es系列）D溶液内容E0.25

E0.125

E0.06

E0.03W平行管溶液编号B（Et系列）A溶液内容S80E0.25

S80E0.125

S80E0.06

S80E0.03S80平行管－－－－－－－－－－－－－－－+++++++++++－－－－－+++++636）结果判断反应结果3-无干扰溶液编号C（Es系列）D溶液内容E0.25

E0.125

E0.06

E0.03W平行管溶液编号B（Et系列）A溶液内容S80E0.25

S80E0.125

S80E0.06

S80E0.03S80平行管－－－－－－－－－－－++++++++++－－－－－++++++++++646）结果判断反应结果4-增强溶液编号C（Es系列）D溶液内容E0.25

E0.125

E0.06

E0.03W平行管溶液编号B（Et系列）A溶液内容S80E0.25

S80E0.125

S80E0.06

S80E0.03S80平行管－－－－－－－－－－－－－－－+++++++++++++++++++++656）结果判断反应结果5-抑制溶液编号C（Es系列）D溶液内容E0.25

E0.125

E0.06

E0.03W平行管溶液编号B（Et系列）A溶液内容S80E0.25

S80E0.125

S80E0.06

S80E0.03S80平行管－－－－－－－－－－－－－－－+++++++++++－－－－－－－－－－66问题讨论1、溶液B怎样制备？A、等比稀释法：取等量的浓度为4λ的内毒素溶液和浓2倍的供试品溶液，混合；例如制备S80E0.25

，取等量的0.5EU/ml内毒素溶液和40倍供试品溶液混合B、用供试品代替水稀释内毒素：例如制备S80E0.25

，用80倍的供试品溶液稀释内毒素溶液大家看看这种方法来制备溶液B合理吗？制备S80E0.25,先取0.1mlS80复溶0.1ml/支的鲎试剂再加入0.1mlE0.2567问题讨论2、是否每个品种都要做干扰试验，还是只是稀释的品种要做？3、方法验证都要取至少3批样品，至少两个厂家的鲎试剂来做干扰试验吗？3批样品是连续的三批还是任意取3批？4、干扰试验要求“供试品溶液应未检验出内毒素且不超过MVD的溶液”，这句话怎么理解？687、检查法—凝胶限度试验

反应项目设置编号内毒素浓度／配制内毒素的溶液平行管数A无／供试品溶液2B2λ／供试品溶液2C2λ／检查用水2D无／检查用水2697、检查法—凝胶法限度试验结果判断溶液A溶液D溶液C溶液B符合规定----++++不符合规定++--++++需复测+---++++复测符合规定------++++复测不符合规定+-----++++70结果判断举例：硫酸庆大霉素注射液凝胶限度试验1）供试品限值硫酸庆大霉素注射液(S)，规格：1ml：2万单位；药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.50EU/mg;1000庆大霉素单位相当于1mg庆大霉素。712）试剂根据干扰试验结果，供试品在80倍稀释，使用鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml条件下，对BET无干扰本试验选择TAL灵敏度为0.125EU/ml，供试品稀释80倍检查试剂名称厂家规格灵敏度或效价数量TAL安度斯0.1ml/支0.125EU/ml8CSE安度斯10EU/支1BET水(W)安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml1硫酸庆大霉素(S)——1ml/支20000U/ml1723）各反应溶液制备S原液0.3ml2.7mlWS100.6ml1.8mlWS400.6ml0.6mlWS80E100.4ml3.6mlWE11.6ml1.6mlWE0.50.6ml0.6mlWE0.25E0.5S400.6ml0.6mlS80E0.25溶液C溶液A溶液B734）加样及反应开启8支鲎试剂，分别加0.1mlBET水复溶；再分别加入相应的溶液，每浓度平行2管37±1℃反应60±2分钟溶液D（W）溶液C（E0.25）溶液A（S80）溶液B（S80E0.25）各0.1mL各0.1mL各0.1mL各0.1mL74当需要复检时，A溶液平行4管，若所有平行管均为阴性，则供试品合格；否则不合格。溶液编号ABCD溶液内容S80S80E0.25E0.25W试验有效合格不合格需复检复检合格复检不合格++－－++++－－－+－－－－－－－+5）结果判断757、日常检查-凝胶半定量试验凝胶半定量试验系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按下表制备溶液A、B、C、D。按照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。767、日常检查-凝胶半定量试验编号内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水1

2

4

8——

——

——

——2

2

2

2B2λ/供试品溶液12λ2C2λ/检查用水检查用水12482λ

1λ

0.5λ

0.25λ2

2

2

2D无/检查用水——————277注：

A为不超过MVD并且通过干扰实验的供试品溶液，从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。

B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）

C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列

D为阴性对照7、日常检查-凝胶半定量试验78结果判断79试验有效条件溶液D：－－

溶液B：＋＋

溶液C：0.5λ≤λc≤2λ结果计算所有平行管的反应终点浓度的几何平均值即为供试品的内毒素浓度[CE=antilg（∑X/2）]7、日常检查-凝胶半定量试验当溶液A所有平行管均为阴性时，供试品溶液的内毒素浓度小于λ乘以初始稀释倍数当溶液A所有平行管均为阳性时，供试品溶液内毒素浓度大于或等于λ乘以最大稀释倍数7、日常检查-凝胶半定量试验80举例：氯化钠注射液凝胶半定量试验1）内毒素限值氯化钠注射液(S),规格：250ml/2.25g;药典要求：氯化钠注射