生物技术制药全册配套完整课件3

生物技术制药全册配套完整课件3生物技术制药教师组

微生物与生化制药实验室张革zhangge@助教2016年财富美国500强分行业榜：医药118121强生（JOHNSON&JOHNSON）74,331美国167170诺华公司（NOVARTIS）59,593瑞士189196瑞士罗氏公司（ROCHEGROUP）54,494.7瑞士211191辉瑞制药有限公司（PFIZER）49,605美国241238赛诺菲（SANOFI）45,246.6法国259241默沙东（MERCK）42,237美国276357中国医药集团（Sinopharm）40,105.7中国309265英国葛兰素史克公司（GLAXOSMITHKLINE）37,871.5英国455468阿斯利康（ASTRAZENECA）26,095英国478--GileadSciences公司（GileadSciences）24,890美国近年来，全球医药市场的发展重心正在逐步从小分子化学药转向生物技术药，后者在全球医药市场的比重从2006年的13%攀升至2015年的20%左右。2011-2016，全球药品销售将保持3-5%的增速，生物技术药物的销售连续保持7%以上的增速，未来将是全部药品销售收入增速的2倍以上。预计到2020年，全球生物技术药物将占全部药品销售收入比重的三分之一以上。历年FDA新批药品中,生物技术药物的比重已超过20%，2011-2016年达到30-40%

目前，生物技术药物约占全球免疫类药物销售总额的79%，肿瘤类药物销售总额的35%。

目前全球已有100多个生物技术药物上市销售，另有400多个品种可能完成临床研究投放市场世界前20位的畅销药物中，生物技术药物占到7种。2014年药物全球排行榜最新公布：艾伯维关节炎药物Humira（阿达木单抗）销售额130亿美元成为全球最畅销药物

生物技术概念：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，以提供产品或为社会提供服务的技术。生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、生物转化等。第一章绪论基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术。生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、生物转化等。酶工程是生物技术的条件。发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。蛋白质工程是从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。细胞工程是生物技术的基础，既是反应器又是一门工程技术。第二节生物技术药物生物技术制药概念：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品，叫作生物技术制药。一般来讲：采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质、核酸类药物，称为生物技术药物。生物药物和生物技术药物1、生物药物biologicaldrug指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。2、生物技术药物biotechnologicaldrug采用DNA重组技术或其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。3、生化药物运用生物化学研究方法，将生物体中起重要生理生化作用的各种基本物质经过提取、分离、纯化等手段制造出的药物；或者将上述这些已知药物加以结构改造或人工合成创造出的自然界没有的新药物。主要有氨基酸、多肽蛋白类、核酸类、多糖、脂、细胞生长调节因子等。4、生物制品指以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织作为起始原料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂。包括：疫（菌）苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、变态反应原、细胞因子、激素、酶及辅酶、发酵产品、McAb、DNA重组产品、体外免疫试剂等。一、生物技术药物的分类生物药物的分类方法有二种:按原料来源分类按生理功能和临床用途分类1.按原料来源分类应用重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类药物；基因药物,核酸疫苗、基因治疗剂、反义RNA等；动物、植物组织、微生物来源的天然生物药物；合成与部分合成的生物药物。2.按生理功能和临床用途分类治疗药物预防药物:疫苗诊断药物其它生物医药用品3.按作用类型细胞因子类；激素；酶类；疫苗单抗反义核酸RNAi基因治疗药物。4.按生化特性多肽类蛋白类核酸类PEG化多肽或蛋白二、生物技术药物的特性1.理化特性分子量大结构复杂稳定性差（失活变性，被降解）2.药理学特性治疗的针对性强，治疗的生理生化机制合理，疗效可靠。细胞色素C：治疗缺氧性疾病（治疗细胞缺氧）药理活性高:ATP直接供能，效果确切、显著毒副作用小:主要有:蛋白质、核酸、糖类、脂类半衰期短种属特异性生理副作用常有发生:免疫反应、过敏反应3.在生产的制备中特殊性浓度低、提取纯化工艺复杂原料药中目标产物的降解片段稳定性差易变性、失活、易污染4.质量控制（1）化学药物：性状、鉴别、检查、含量生物技术药物：基本要求、制造、检定（2）制造项下特殊规定：细胞株，菌种、代次等（3）检定项下特殊规定：需理化检验指标生物活性指标我国生物技术制药现状

biotechnologicalpharmaceutics已上市的基因工程药物和疫苗

1995年白细胞介素-21996年α1b-干扰素α2a-干扰素

α2b-干扰素

1997年粒细胞集落因子红细胞生成素

1992年乙型肝炎疫苗目前大批的临床试验，上百种药物我国已批准生产的生物技术药物和疫苗rhuIFNα1b(外用)rhuIFNα1brhuIFNα2arhuIFNα2a(酵母)rhuIFNα2brhuIFNα2a(栓剂)rhuIFNα2b(凝胶剂)rhuIFNγrhuEGF(外用)EGF衍生物rhuIL2rhuIL2125SerrhuG－CSFrhuGM－CSFrhuEPOrhuGHbFGF(外用)RSK抗IL28单抗乳膏剂人胰岛素乙肝疫苗痢疾疫苗病毒性角膜炎乙肝、丙肝乙肝、丙肝、疱疹等乙肝、丙肝乙肝、丙肝白血病等妇科病疱疹等类风湿烧伤、创伤烧伤、创伤癌症辅助治疗癌症辅助治疗刺激产生白细胞刺激产生白细胞、骨髓移植产生红细胞矮小病创伤、烧伤溶血栓(心梗)银屑病糖尿病预防乙肝预防痢疾

国内生物技术药物的市场总额约为180亿元人民币，占全球生物技术药市场的2%，而中国整体医药市场在全球医药市场中的比重则已达到7%。十三五以来,生物产业被中国政府确定的战略性新兴产业之一十三五”规划中，未来几年内生物制药产业年均增速更要达到20%。

2024/9/8中山大学药学院张革26(四）载体DNA与目的基因的连接DNA分子体外重组：连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接。形成重组子（recombinant)的过程。1.粘性末端的连接：经双酶切获得粘性末端，用连接酶进行连接2.平头末端的连接：连接效率低，一般采用加尾法、接头法3.连接效率：目的基因与载体DNA的摩尔比大于1

2024/9/8中山大学药学院张革27不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。定向克隆连接反应？2024/9/8中山大学药学院张革282024/9/8中山大学药学院张革29问题：如何加入合成接头？2024/9/8中山大学药学院张革302024/9/8中山大学药学院张革31EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ2024/9/8中山大学药学院张革32cDNA克隆的过程2024/9/8中山大学药学院张革33（五）重组DNA导入宿主细胞宿主细胞：原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌链球菌真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞原核细胞的转化方法：电穿孔转化法化学转化法2024/9/8中山大学药学院张革34导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)◆转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.◆转染(transfection):

以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程.2024/9/8中山大学药学院张革35表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。1.重组DNA导入大肠杆菌2024/9/8中山大学药学院张革36氯化钙转化法：在基因克隆技术中，转化(transformation)特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。是利用低温（0℃）和氯化钙（CaCl2）低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态（competence）。

转染法：如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入宿主细胞。体外包装是将重组DNA分子与λ噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具有感染力的λ噬菌体粒子。2024/9/8中山大学药学院张革372024/9/8中山大学药学院张革38重组DNA导入酵母酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。2024/9/8中山大学药学院张革39酵母电转化法：酵母用山梨醇处理，制备感受态细胞；将线性化DNA、感受态细胞置于电转仪中，通过电击将DNA导入细胞；电击后应立即加入冰冷的山梨醇溶液（是为了修复电击受损的酵母细胞，加入的越快越有利于细胞的恢复）。2024/9/8中山大学药学院张革40重组DNA导入链霉菌链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。2024/9/8中山大学药学院张革41原生质体转化法：原生质体protoplast：人工条件下用溶菌酶等除去细胞壁后，所留下的部分。用PEG处理原生质体(化学助融剂如PEG加Ca2+）加入DNA。

2024/9/8中山大学药学院张革42重组DNA导入哺乳类细胞哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。显微注射法磷酸钙转染法葡聚糖转染法阳性介质转染法电穿孔法细胞融合法病毒感染法2024/9/8中山大学药学院张革432024/9/8中山大学药学院张革44（六）重组子的筛选与鉴定载体遗传标记法抗生素抗性筛选法如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上进行培养，仍可长出菌落。此法缺点是假阳性率高在含有抗生素的培养基中能够生长的抗性细胞内可能存在哪几种类型的载体？2024/9/8中山大学药学院张革452024/9/8中山大学药学院张革46互补筛选法采用遗传缺陷型宿主细胞、而重组子含有编码该基因的DNA序列。最常用的为蓝白斑筛选某些载体，如M13噬菌体载体，pUC质粒系列等，它们的载体上都携带lacZ基因一段序列，它编码β-半乳糖苷酶的α肽，而宿主细胞为lacZ△Ml5的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有x-gal和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培养基中的无色的x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色：2024/9/8中山大学药学院张革472024/9/8中山大学药学院张革482024/9/8中山大学药学院张革49营养缺陷型筛选法用某些物理因素或化学因素处理宿主细胞，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。导入编码某些营养成分基因的载体，可使营养缺陷型细胞在缺少该营养成分的培养基中生长。2024/9/8中山大学药学院张革50组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救2024/9/8中山大学药学院张革51噬菌斑筛选法：噬菌体成功感染细菌将导致溶菌未插入外来DNA的空载体由于长度过小不能装配成噬菌体颗粒。2024/9/8中山大学药学院张革522.核酸分子杂交法菌落(或噬菌斑)原位杂交(insituhybridization)将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。2024/9/8中山大学药学院张革53取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出DNA。再用碱处理，使DNA变性，经烘烤将变性DNA固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。2024/9/8中山大学药学院张革542024/9/8中山大学药学院张革55DNA印迹分析（Southernblotting)通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的DNA分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些DNA分子物质的过程。NorthernBlotting（Northern印迹）

2024/9/8中山大学药学院张革562024/9/8中山大学药学院张革572024/9/8中山大学药学院张革583.限制性酶谱分析法将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1-2种RE酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段大小。2024/9/8中山大学药学院张革59XhoINotIXhoIMEKK11200bpPromoter400bppUC-mT2700bpColony12313100bp1200bp400bp2700bpXhoIcuttingXhoI+NotIcutting1200bppUC-mT/pLMP1-MEKK14300bp实例2024/9/8中山大学药学院张革604.DNA序列测定为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。2024/9/8中山大学药学院张革615.目的基因表达产物测定法例：免疫斑点测定法如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法实验操作极似菌落(或噬菌斑)原位杂交。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影；若加入的抗体用酶偶联(酶标)，那么此酶就可将无色底物水解成有色产物。2024/9/8中山大学药学院张革62基因载体目的基因

质粒噬菌体病毒PCRcDNA人工合成基因文库限制性内切酶有切口的载体有切口的目的基因DNA连接酶

重组体

转化转染体外包装带重组体的宿主细胞

表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达2024/9/8中山大学药学院张革63

以质粒为载体的DNA

克隆过程2024/9/8中山大学药学院张革64二、原核细胞表达的特点及选择外源基因表达的调控元件启动子:是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列plac启动子:最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子ptrc启动子:是trp启动子和lac启动子的拼合启动子λPL:λ噬菌体的转录启动子PL,该启动子受控于λ噬菌体cI基因产物T7启动子:是当今大肠杆菌表达系统的主流2024/9/8中山大学药学院张革65核糖体结合位点(rbs):原核微生物的mRNA结合核糖体的序列称为SD序列(shine-dalgarnosequence)。SD序列位于AUG上游3-11个核苷酸处的一段3-9个碱基的DNA序列,该序列和核糖体蛋白S1与16SrRNA的3′端互补，形成核糖体-mRNA复合体，共同起始蛋白质的合成。SD序列与AUC之间的距离可直接影响表达效率。终止子：是基因3‘端可被RNA聚合酶识别并停止转录功能的特定序列。2024/9/8中山大学药学院张革662.外源基因在大肠杆菌中的表达形式大肠杆菌被内膜、外膜分隔为胞内、周质、胞外三个区域表达可定位于胞内、周质、胞外胞内表达率高，但易行成包涵体2024/9/8中山大学药学院张革67胞内表达的两种方式非融合蛋白的胞内表达表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子-细菌的RBS-真核基因的AUG-结构基因-*。易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应StopATGSDP目的基因2024/9/8中山大学药学院张革68非融合型表达载体PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元件：强启动子，SD，ATG：第一个密码子ATGPSDTAAMCS2024/9/8中山大学药学院张革692024/9/8中山大学药学院张革70融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达载体 C端融合基因ATGTAA N端融合基因ATGTAA2024/9/8中山大学药学院张革71融合蛋白的表达融合蛋白氨基端是原核序列羧基端是真核序列；优点：操作简便蛋白质在菌体内比较稳定易高效表达；StopATGSDP目的基因tagtag2024/9/8中山大学药学院张革72Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相载体（1）融合型载体----pGEX系列2024/9/8中山大学药学院张革732024/9/8中山大学药学院张革741.小分子量或易降解，或对宿主有毒的目的蛋白的表达2.GST标签纯化树脂GSTResin纯化2024/9/8中山大学药学院张革75（2）融合型载体----His融合1.His-Tag分子量小，无抗原性2.Ni-NTAResin

(His标签纯化树脂)亲和纯化2024/9/8中山大学药学院张革76

pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，1.可用亲和层析(SPA)。简化下游工艺。2.溴化氢裂解，不用酶（3）融合型载体----IgG融合2024/9/8中山大学药学院张革77融合表达质粒pBG-2的结构2024/9/8中山大学药学院张革78分泌型表达：将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。2024/9/8中山大学药学院张革79目标蛋白在周质空间中表达的优点大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为100种，只占菌体总蛋白数量的4%。蛋白水解酶的含量与在细胞质中相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的产生。周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。2024/9/8中山大学药学院张革803.大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素宿主菌的选择外源基因密码子的使用稀有密码子：AGA、AGC、ATA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC共八种采用稀有密码子会导致：表达效率低下、错配率高可采用定点突变的策略进行同义突变2024/9/8中山大学药学院张革81mRNA的结构：mRNA的一级结构对翻译效率的影响采用偏好密码子（增加T、A含量）大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源DNA或RNA并对其进行降解。mRNA的二级结构对翻译效率的影响发夹的形成的双重作用—即可保护mRNA不被降解、但阻碍翻译的起始和延伸2024/9/8中山大学药学院张革82表达载体的选择（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的启动子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因；（4）具有抑制子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子；（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。2024/9/8中山大学药学院张革83外源蛋白的稳定性组建融合蛋白；利用信号肽，分泌型表达；特异性突变；位点特异突变，改变二硫键位置；蛋白酶缺陷型宿主2024/9/8中山大学药学院张革842024/9/8中山大学药学院张革85三、真核细胞表达的特点及选择由于：原核表达系统缺乏蛋白翻译后加工修饰多以包涵体形式存在外源蛋白在原核生物中不稳定，易被降解真核表达系统包括酵母表达系统昆虫细胞表达系统哺乳类细胞表达系统2024/9/8中山大学药学院张革861.酵母表达系统最常用的是巴斯德毕赤酵母（pichiaPastoris)其优点为：高表达量：高稳定性翻译后修饰功能分泌表达2024/9/8中山大学药学院张革87影响外源基因的在酵母中表达的因素外源基因的结构mRNA的5‘端非翻译区（5‘UTR）的序列和长度起始密码子旁侧序列:易形成RNA二级结构阻止翻译。富含A/T序列导致提前终止偏爱密码子胱氨酸的含量：影响合成效率2024/9/8中山大学药学院张革88表达形式及信号肽的选择大多选择分泌表达：但是信号肽具有选择性，所以选择合适的信号肽对于提高某种重组蛋白质的表达量是非常重要的。标准的分泌信号肽a因子和碱性磷酸酶基因PHO1，但在表达某些外源基因中失灵糖基化：与动物细胞类似2024/9/8中山大学药学院张革89启动子：醇氧化酶-1（AOX1，AOX2）基因的启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等，均为整合型载体2024/9/8中山大学药学院张革90毕赤酵母表达系统宿主菌株的表现型根据对甲醇利用的情况，可将宿主分为3种表型:Mut＋，Muts（slow），Mut－：在甲醇培养基中生长速率与野生型类似，称为甲醇利用正表型，即Mut＋；当AOX1被其它基因取代，则需依赖AOX2，其甲醇代谢速度慢，称为甲醇利用慢表型，即Muts。当AOX基因全部缺失，则不能利用甲醇，成为甲醇利用负表型，即Mut-。负表型Mut-为常用菌株。2024/9/8中山大学药学院张革91转化子的拷贝数拷贝数越高，其产量越高。但存在负效应，会引起细胞生长量的降低诱导条件甲醇诱导的时间、浓度、温度的选择.30°外源蛋白的降解选用蛋白酶缺失型宿主菌2024/9/8中山大学药学院张革922024/9/8中山大学药学院张革932.昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。Sf9、sf21细胞昆虫细胞表达系统的优点：可表达较大的外源基因可表达不同生物来源的外源基因与高等生物相似的转录后加工、修饰杆状病毒具有高度宿主专一性昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。

2024/9/8中山大学药学院张革942024/9/8中山大学药学院张革95多角蛋白启动子polyhedrin2024/9/8中山大学药学院张革962024/9/8中山大学药学院张革972024/9/8中山大学药学院张革982024/9/8中山大学药学院张革993.哺乳动物细胞表达系统由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。但利用哺乳动物细胞表达系统表达外源蛋白，其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。2024/9/8中山大学药学院张革1002024/9/8中山大学药学院张革1012024/9/8中山大学药学院张革102将外源基因导入哺乳动物细胞的方法：感染性病毒颗粒感染宿主细胞通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。

2024/9/8中山大学药学院张革103二、真核细胞表达制品的安全性的问题由真核细胞生产的产品可能存在与肿瘤相关的DNA病毒DNA尤其是逆转录病毒我国目前规定：每剂量的药物所含DNA不得大于100pg。基因工程制药-1

geneticengineeringpharmaceutics张革中山大学药学院微生物与生化制药实验室zhangge@2024/9/8中山大学药学院张革104基因工程（GeneEngineering):基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的.

其基本步骤

(1)提取目的基因.

(2)目的基因与运载体结合.形成一个重组DNA分子.

(3)将目的基因导入受体细胞.(4)目的基因的表达.基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制2024/9/8中山大学药学院张革1052024/9/8中山大学药学院张革1061071、限制性核酸内切酶是一类能识别特殊核甘酸序列，并水解DNA分子的磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵作用。一、基因工程菌的构建与筛选

（一）工具酶2024/9/8中山大学药学院张革107Ⅱ型酶识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。1081）II型限制性内切酶的基本特征5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点2024/9/8中山大学药学院张革1081092）核酸内切酶作用后的断裂方式

粘性末端：2024/9/8中山大学药学院张革109平末端：

2024/9/8中山大学药学院张革1102024/9/8中山大学药学院张革1113）同裂酶（isoschizomers)

指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。SmaI(SerratiamarcescensSB) CCC^GGGXmaI(Xanthomonasmalvacaerum) C^CCGGG2024/9/8中山大学药学院张革1124）同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。

。杂种位点（hybridsite）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。GGATCC TGATCACCTAGGACTAGTBamHⅠBclⅠG GATCACCTAGTGGATC

ACCTAGT2024/9/8中山大学药学院张革1136）影响核酸内切酶活性的因素（1）DNA的纯度：为提高RE对低纯度DNA的反应效率，一般:a.增加RE的用量b.扩大酶催化反应的体系(稀释)c.延长酶催化反应的保温时间。（2）DNA的甲基化程度RE是原核生物限制-修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的E.Coli菌株制备质粒DNA。2024/9/8中山大学药学院张革114（3）酶切消化反应的温度：大多数37℃,但也有例外SmaI是25℃、ApaI是30℃；MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；还有些RE最适温度高达60℃以上（4）DNA的分子结构：某些RE切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。还有一些RE切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。2024/9/8中山大学药学院张革115（5）反应系统的组成氯化镁,氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低RE的活性，还可能导致识别序列的改变。Tris-HCl：维持最适的pH值（pH＝7.4）。β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。2024/9/8中山大学药学院张革1162024/9/8117限制性内切酶在DNA克隆中的应用2024/9/8中山大学药学院张革117限制性内切酶市场新英格兰公司(NewEnglandBiolabs，NEB)是目前限制性内切酶市场主要供应厂商。超过30%已知的限制性内切酶是首先在NEB发现的北美市场，Promega的产品欧洲市场，RocheApplied和Fermentas公司。日本市场，Takara的产品

2024/9/8中山大学药学院张革1182、DNA连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。2024/9/8中山大学药学院张革119大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。可以封闭双螺旋DNA上具有5‘-磷酰基和3’-羟基的缺口（nick），不能封闭裂口（gap）；因此，只能连接粘性末端的DNA片段，不能拼接DNA平头末端；用于粘性末端DNA或切口间连接。2024/9/8中山大学药学院张革120T4DNA连接酶（DNAligase）

该酶常从T4噬菌体的感染细胞中提取，是由T4噬菌体基因组所编码的，它可催化DNA中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。基因工程中常用的连接酶是T4连接酶。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。2024/9/8中山大学药学院张革1213、DNA聚合酶DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均缩写为DDDP。2024/9/8中山大学药学院张革122大肠杆菌DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ（PolI）、

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolI和PolⅡ的主要功能参与DNA的合成；

PolⅢ的功能同DNA的复制有关；

PolⅠ

同DNA分子克隆的关系最为密切。2024/9/8中山大学药学院张革123（1）大肠杆菌DNA聚合酶IDNA聚合酶Ⅰ的酶活性：

5’→3’的聚合酶活性；

5’→3’的外切酶活性；

3’→5’的外切酶活性（较低）。3′5′3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性3′5′3′5′5′3′2024/9/8中山大学药学院张革124（2）Klenow聚合酶Klenow片段（Klenowfragment）：E.coliDNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个aa片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，但失去了5’→3’外切酶活性。

5’→3’聚合酶活性；

5’→3’外切酶活性；

3’→5’外切酶活性。5’→3’聚合酶活性；

3’→5’外切酶活性部分水解2024/9/8中山大学药学院张革125126用途⑴补平3‘-凹端利用5‘→3‘DNA聚合酶活性

在模板和引物(DNA或RNA)存在的条件下,以dNTP作底物,沿5‘→3‘方向合成与模板互补的DNA。

2024/9/8中山大学药学院张革1262024/9/8127⑵3’-凹端标记2024/9/8中山大学药学院张革1272024/9/8128⑶、3‘-凸端削平利用单链特异性的3→5外切核酸酶活性

2024/9/8中山大学药学院张革128(3)T4噬菌体DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。在没有dNTP存在的情况下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3’→5’的方向从3’-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。2024/9/8中山大学药学院张革1293′→5′外切酶活性3′T5′3′5′GTCAGTCACAC2024/9/8中山大学药学院张革1303′→5′外切酶活性dATP3′T5′3′5′GTCAGTCAdATPdATPdATPCAC2024/9/8中山大学药学院张革1314.T7噬菌体DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性；特点：极佳的连续合成能力应用：（1）用于长模板DNA的引物延伸反应；（2）通过单纯的延伸或取代合成途径标记DNA3`末端；（3）使双链DNA的5`或3`突出末端变成平末端。2024/9/8中山大学药学院张革1325.TaqDNA聚合酶显著特点：热稳定性70℃反应2h残留活性为原来的90%；93℃反应2h残留活性为原来的60%；94℃反应2h残留活性为原来的40%。应用：（1）DNA序列测定（2）PCR(polymerasechainreaction)对DNA的特定片段进行体外扩增。2024/9/8中山大学药学院张革1336.逆转录酶（reversetranscriptase）

逆转录酶这类酶来自于逆转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成DNA。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）逆转录酶两种。RNA指导的DNA聚合酶。2024/9/8中山大学药学院张革134活性：5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。用途：（1）在体外以mRNA为模板合成cDNA；（2）对有5`突出末端的DNA片段作末端标记（补平）；（3）双脱氧法测序；（4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针。2024/9/8中山大学药学院张革135（7）末端转移酶末端转移酶(terminaltransferase):

末端脱氧核苷酸转移酶。来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。功能：催化5`脱氧核苷三磷酸进行5`→3`方向的聚合作用,逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端。是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。用途：

(1)用于给外源DNA片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴；

(2)标记DNA片段的3`末端。2024/9/8中山大学药学院张革136137

与聚合酶的不同：2024/9/8中山大学药学院张革137逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端同聚物加尾2024/9/8中山大学药学院张革138大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌

2024/9/8中山大学药学院张革139碱性磷酸酶功能：催化核酸脱5’-P基团，使DNA或RNA片段5’-P末端转换成5’-OH末端。来源：有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前者叫bacterialalkalinephosphatase(BAP);后者叫calfintestinalalkalinephosphatase(CIP)

用途：去除DNA片段5‘磷酸，防止自身环化；同位素32P标记前的去除5‘磷酸。2024/9/8中山大学药学院张革1405‘3’3‘5’P--OH-PHO-碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶5‘3’3‘5’HO--OH-OHHO-2024/9/8中山大学药学院张革141T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）来源：T4噬菌体感染的E.coli。功能：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA/RNA的5‘-OH端某些情况下，上述的多聚核苷酸的反应可以反方向进行，将ATP的γ-磷酸基团与多聚核苷酸的5’端磷酸基团交换，从而不必用碱性磷酸酶对底物进行脱磷酸化。用途：标记DNA的5’-末端；使缺失5‘-P末端的DNA发生磷酸化作用。2024/9/8中山大学药学院张革142T4多核苷酸激酶的活性正向反应交换活性2024/9/8中山大学药学院张革143S1核酸酶来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）功能：是一种高度单链特异的核酸内切酶。注意：对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。2024/9/8中山大学药学院张革144P--OHP--OHP--OHP--OHP--OHP--OH单链DNA或RNA带缺口的双链DNA5‘-磷酸单核苷酸或寡核苷酸S1核酸酶S1核酸酶2024/9/8中山大学药学院张革1452024/9/8中山大学药学院张革146(三）载体载体(vector)，基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子。基因工程中有三种主要类型的载体∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒。2024/9/8中山大学药学院张革147载体必须具备的几个性能分子较小，可携带比较大的DNA片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种RE的切割位点，但每一种RE又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。2024/9/8中山大学药学院张革1482024/9/8中山大学药学院张革149载体的分类根据功能克隆载体:

克隆一个基因或DNA片断表达载体:

用于一个基因的蛋白表达整合载体:

把一个基因插入到染色体组中2024/9/8中山大学药学院张革150根据来源：

质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体真核细胞表达载体其中质粒DNA是最常用的载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和λ噬菌体DNA的结合体，运载能力最高。在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。2024/9/8中山大学药学院张革151（1）质粒（plasmid）载体

质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。2024/9/8中山大学药学院张革152质粒的生物学特性：1）质粒DNA的构型：SC型：共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型：开环DNA（ocDNA）L型：线性DNA（cDNA）2024/9/8中山大学药学院张革153作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因(Ori)选择性记号(Amp,Kana)多克隆位点(MCS)2024/9/8中山大学药学院张革1542024/9/8中山大学药学院张革1552024/9/8中山大学药学院张革156cos:cohensive-endsite12个核苷酸组成的完全互补的5'单链突出序列

2024/9/8中山大学药学院张革157（二）目的基因常用制备方法1.化学合成法

较短的基因<100bp

大片段怎么合成？1977年，加拿大Itakara将人工合成的生长激素释放因子基因在E.coli中表达，这是首次高等生物基因通过基因工程高效表达并产业化。干扰素、人胰岛素、加压素等的产业化生产2024/9/8中山大学药学院张革158

合成两条基因互补链片断，经退火成为两端黏性末端的DNA片断退火2024/9/8中山大学药学院张革1592.PCR法适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法2024/9/8中山大学药学院张革1602024/9/8中山大学药学院张革1612024/9/8中山大学药学院张革1623.基因文库法:基因文库（genelibrary)：是指某一特定生物体全部基因组的克隆集合，包括所有外显子和内含子序列。基因文库的构建：鸟枪法（shotgun)2024/9/8中山大学药学院张革163Shotgunlibraty2024/9/8中山大学药学院张革164基因文库的应用2024/9/8中山大学药学院张革1654.cDNA文库法cDNA（complementaryDNA）为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomicDNA）不同而无内含子；在mRNA存在的3′末端的多A序列的核苷序列，外显子序列、先导序列以及后续序列等。2024/9/8中山大学药学院张革166cDNA文库指某生物某发育时期所转录的全部

mRNA，

经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典

cDNA

文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA

加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。2024/9/8中山大学药学院张革167(四）载体DNA与目的基因的连接DNA分子体外重组：连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接。形成重组子（recombinant)的过程。1.粘性末端的连接：经双酶切获得粘性末端，用连接酶进行连接2.平头末端的连接：连接效率低，一般采用加尾法、接头法3.连接效率：目的基因与载体DNA的摩尔比大于1

2024/9/8中山大学药学院张革168不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。定向克隆2024/9/8中山大学药学院张革169问题：如何加入合成接头？2024/9/8中山大学药学院张革1702024/9/8中山大学药学院张革171EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ2024/9/8中山大学药学院张革172cDNA克隆的过程2024/9/8中山大学药学院张革173（五）重组DNA导入宿主细胞宿主细胞：原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌链球菌真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞原核细胞的转化方法：电穿孔转化法化学转化法2024/9/8中山大学药学院张革174导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)◆转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.◆转染(transfection):

以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程.2024/9/8中山大学药学院张革175表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。1.重组DNA导入大肠杆菌2024/9/8中山大学药学院张革176氯化钙转化法：在基因克隆技术中，转化(transformation)特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。是利用低温（0℃）和氯化钙（CaCl2）低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态（competence）。

转染法：如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入宿主细胞。体外包装是将重组DNA分子与λ噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具有感染力的λ噬菌体粒子。2024/9/8中山大学药学院张革177重组DNA导入酵母酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。2024/9/8中山大学药学院张革178酵母电转化法：酵母用山梨醇处理，制备感受态细胞；将线性化DNA、感受态细胞置于电转仪中，通过电击将DNA导入细胞；电击后应立即加入冰冷的山梨醇溶液（是为了修复电击受损的酵母细胞，加入的越快越有利于细胞的恢复）。2024/9/8中山大学药学院张革179重组DNA导入链霉菌链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。2024/9/8中山大学药学院张革180原生质体转化法：原生质体protoplast：人工条件下用溶菌酶等除去细胞壁后，所留下的部分。用PEG处理原生质体(化学助融剂如PEG加Ca2+）加入DNA。

2024/9/8中山大学药学院张革181重组DNA导入哺乳类细胞哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。显微注射法磷酸钙转染法葡聚糖转染法阳性介质转染法电穿孔法细胞融合法病毒感染法2024/9/8中山大学药学院张革182（六）重组子的筛选与鉴定载体遗传标记法抗生素抗性筛选法如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上进行培养，仍可长出菌落。此法缺点是假阳性率高在含有抗生素的培养基中能够生长的抗性细胞内可能存在哪几种类型的载体？2024/9/8中山大学药学院张革1832024/9/8中山大学药学院张革184互补筛选法采用遗传缺陷型宿主细胞、而重组子含有编码该基因的DNA序列。最常用的为蓝白斑筛选某些载体，如M13噬菌体载体，pUC质粒系列等，它们的载体上都携带lacZ基因一段序列，它编码β-半乳糖苷酶的α肽，而宿主细胞为lacZ△Ml5的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有x-gal和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培养基中的无色的x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色：2024/9/8中山大学药学院张革1852024/9/8中山大学药学院张革1862024/9/8中山大学药学院张革187营养缺陷型筛选法用某些物理因素或化学因素处理宿主细胞，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。导入编码某些营养成分基因的载体，可使营养缺陷型细胞在缺少该营养成分的培养基中生长。2024/9/8中山大学药学院张革188组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救2024/9/8中山大学药学院张革189噬菌斑筛选法：噬菌体成功感染细菌将导致溶菌未插入外来DNA的空载体由于长度过小不能装配成噬菌体颗粒。2024/9/8中山大学药学院张革1902.核酸分子杂交法菌落(或噬菌斑)原位杂交(insituhybridization)将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。2024/9/8中山大学药学院张革191取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出DNA。再用碱处理，使DNA变性，经烘烤将变性DNA固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。2024/9/8中山大学药学院张革1922024/9/8中山大学药学院张革193DNA印迹分析（Southernblotting)通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的DNA分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些DNA分子物质的过程。NorthernBlotting（Northern印迹）

2024/9/8中山大学药学院张革1942024/9/8中山大学药学院张革1952024/9/8中山大学药学院张革1963.限制性酶谱分析法将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1-2种RE酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段大小。2024/9/8中山大学药学院张革197XhoINotIXhoIMEKK11200bpPromoter400bppUC-mT2700bpColony12313100bp1200bp400bp2700bpXhoIcuttingXhoI+NotIcutting1200bppUC-mT/pLMP1-MEKK14300bp实例2024/9/8中山大学药学院张革1984.DNA序列测定为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。2024/9/8中山大学药学院张革1995.目的基因表达产物测定法例：免疫斑点测定法如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法实验操作极似菌落(或噬菌斑)原位杂交。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影；若加入的抗体用酶偶联(酶标)，那么此酶就可将无色底物水解成有色产物。2024/9/8中山大学药学院张革200基因载体目的基因

质粒噬菌体病毒PCRcDNA人工合成基因文库限制性内切酶有切口的载体有切口的目的基因DNA连接酶

重组体

转化转染体外包装带重组体的宿主细胞

表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达2024/9/8中山大学药学院张革201

以质粒为载体的DNA

克隆过程2024/9/8中山大学药学院张革202（七）原核细胞表达的特点及选择外源基因表达的调控元件启动子:是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列plac启动子:最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子ptrc启动子:是trp启动子和lac启动子的拼合启动子λPL:λ噬菌体的转录启动子PL,该启动子受控于λ噬菌体cI基因产物T7启动子:是当今大肠杆菌表达系统的主流2024/9/8中山大学药学院张革203核糖体结合位点(rbs):原核微生物的mRNA结合核糖体的序列称为SD序列(shine-dalgarnosequence)。SD序列位于AUG上游3-11个核苷酸处的一段3-9个碱基的DNA序列,该序列和核糖体蛋白S1与16SrRNA的3′端互补，形成核糖体-mRNA复合体，共同起始蛋白质的合成。SD序列与AUC之间的距离可直接影响表达效率。终止子：是基因3‘端可被RNA聚合酶识别并停止转录功能的特定序列。2024/9/8中山大学药学院张革2042.外源基因在大肠杆菌中的表达形式大肠杆菌被内膜、外膜分隔为胞内、周质、胞外三个区域表达可定位于胞内、周质、胞外胞内表达率高，但易行成包涵体2024/9/8中山大学药学院张革205胞内表达的两种方式非融合蛋白的胞内表达表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子-细菌的RBS-真核基因的AUG-结构基因-*。易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应StopATGSDP目的基因2024/9/8中山大学药学院张革206非融合型表达载体

PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元件：强启动子，SD，ATG：第一个密码子ATGPSDTAAMCS2024/9/8中山大学药学院张革2072024/9/8中山大学药学院张革208融合型表达载体

PSDForeignDNA融合型表达载体 C端融合基因ATGTAA N端融合基因ATGTAA2024/9/8中山大学药学院张革209融合蛋白的表达融合蛋白氨基端是原核序列羧基端是真核序列；优点：操作简便蛋白质在菌体内比较稳定易高效表达；StopATGSDP目的基因tagtag2024/9/8中山大学药学院张革210Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相载体（1）融合型载体----pGEX系列2024/9/8中山大学药学院张革2112024/9/8中山大学药学院张革2121.小分子量或易降解，或对宿主有毒的目的蛋白的表达2.GST标签纯化树脂GSTResin纯化202