第十六章 心肌损伤标志物检验

第十六章

心肌损伤标志物检验

第一节概述

第二节心肌损伤标志物的选择与评价第三节心肌损伤标志物测定第一节概述

心脏是人体最重要的器官之一，它与血管组成人体的血液循环系统。担负着氧、二氧化碳、营养物质、中间代谢产物、激素等物质的运输。急性心肌梗死（AMI）是最常见的疾病之一，且发病率呈逐年增加的趋势。急性心肌梗死的早期诊断对于治疗是非常重要的。一、心脏的结构和功能

(一)心脏的解剖与生理

心脏分为左心和右心，被房间隔和室间隔分开。左心室→主动脉→毛细血管→下腔静脉→右心房（体循环）。右心室→肺动脉→肺泡毛细血管→肺静脉→左心房（肺循环）。

（二）心肌的超微结构心肌细胞占心脏重量一半以上，细胞内含有大量的肌原纤维和高度发达的肌管系统。肌原纤维由粗肌丝和细肌丝构成。粗肌丝主要由肌球蛋白分子组成。每条粗肌丝约有200～300个肌球蛋白分子，每个肌球蛋白分子又分为头、颈和尾三部分，形如豆芽。头部尾部肌球蛋白颈部细肌丝由肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白（Tn）三种蛋白组成。在细肌丝中，肌动蛋白单体聚合成双股螺旋链，构成细肌丝的主干。肌动蛋白单体聚合成双股螺旋链

肌球蛋白和肌动蛋白因能直接参与心肌的舒缩故称为收缩蛋白，占肌原纤维蛋白的80%左右。原肌球蛋白和肌钙蛋白不直接参与收缩，但在心肌收缩过程中起着重要调节作用故称为调节蛋白。二、心脏疾病的诊断心脏疾病的诊断技术常用的有物理诊断（心电图、超声心动图、核素心血管造影、CT等）和化学诊断（酶类标志物、蛋白类标志物测定等）。

（一）冠心病的定义冠状动脉性心脏病简称冠心病，又称缺血性心脏病，指各种原因使冠状动脉管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病。

（二）冠心病的分型

根据冠状动脉病变的部位、范围和程度的不同，1979年WHO将冠心病分为五型：隐匿型（无症状）、心绞痛型、心肌梗死型、缺血性心肌病型和猝死型。在动脉硬化初期，当血管腔狭窄＜50%时，由于冠状动脉有较强的储备能力，心肌的血液供应未受影响，病人无症状。当冠状动脉管腔狭窄＞50%～75%，安静时尚能代偿，而运动、心动过速、情绪激动造成心肌需氧量增加时，导致短暂的心肌供血不足，表现为心绞痛；若病人休息时也出现心绞痛，且持续时间较长（＞10min），则表现为不稳定性心绞痛；若病情继续进展，某支冠状动脉闭塞，血供急剧减少或中断，其供血区域心肌因持久性缺血而发生局部坏死，称急性心肌梗死（AMI）。AMI因发病急，常致心源性猝死。（三）急性心肌梗死的诊断标准

血液生化检查对缺血性心脏疾病的诊断和治疗提供了重要的实验室依据。急性心肌梗塞（AMI）是心脏疾病中的主要疾病，发病急和死亡率较高，早期诊断困难。1969年，WHO规定AMI的诊断必须满足下面的两条：

1.典型的病史和长期的胸痛；2.明显的心电图改变；3.心肌酶的异常。但是酶类标志物存在特异性较差等不足，新的生化标志物心肌肌钙蛋白在灵敏度和特异性方面均优于酶学测定，因此，WHO诊断标准的第三条受到了挑战。2000年，欧洲心脏病学会（ESC）和美国心脏病学会（ACC）修订了AMI的诊断标准，将心肌损伤标志物（心肌肌钙蛋白，cTn）的异常变化作为诊断AMI的必要条件。

心肌损伤时的血中生化标志物检测值异常是急性心肌梗死（AMI）的主要诊断标准之一。一般认为，反映急性心肌损伤的理想的生化标志物应具备的特点主要有：高度心脏专一性；心肌损伤后很快增高；增高后持续较长时间；容易检测；可很快得到检测结果（在1小时内）；其诊断价值已经临床证实。迄今为止，尚无完全符合上述要求的标志物。第二节心肌损伤标志物的选择与评价

酶类标志物

蛋白类标志物LDH及同工酶CK及同工酶AST心肌肌钙蛋白肌红蛋白心肌损伤标志物一、血清酶标志物

20世纪50年代LDH、AST、HBDH用于AMI的诊断。20世纪60年代肯定CK在诊断AMI中特异性更高。20世纪70年代发现CK-MB特异性更高。是公认的诊断AMI的“金标准”。

（一）天冬氨酸氨基转移酶自1954年发现AMI患者血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）升高，而使AST成为诊断AMI的第一个血清酶标志物。AST分布较广，主要存在于肝脏、心脏、骨骼肌和肾脏。AST有两种同工酶，胞浆型（AST-s）和线粒体型（AST-m）。在AMI发作6~8小时，血清中AST-s酶活性增强，当出现AST-m酶时表明心肌细胞损伤严重。【参考范围】

AST：0－40U/L【临床意义】既往认为AST主要存在于心肌中，主要用于诊断AMI。但目前由于AST在AMI时升高迟于CK，恢复早于LDH，故诊断AMI价值越来越小，国外不少学者认为诊断AMI，完全可以不测AST。

（二）乳酸脱氢酶及同工酶LDH是由两种亚基（H和M）组成的四聚体，有五种同工酶，心肌细胞中的LDH主要是LDH1。LDH1活性增高可作为诊断心肌梗塞的一个有用指标。心肌梗塞发生后24～48小时，LDH1开始升高，2～4天达到高峰，8～9天恢复正常。LDH1/LDH2比值＞1.0是AMI的特异性指标，且持续时间可达半个月左右，特别适用于就诊较晚的病人。

【测定方法】

乳酸脱氢酶根据催化反应方向的不同，有两大类测定LDH方法，一大类为国际临床化学协会（IFFC）推荐方法，以丙酮酸为底物；另一大类以乳酸为底物，在我国应用较普遍。【参考范围】LDH：成人120～130U/L（L→P法）儿童140～260U/L（L→P法）LDH同工酶：成人LDH114%～26%；LDH229%～39%；LDH320%～26%；LDH48%～16%；LDH56%～16%；LDH1/LDH20.45～0.74；

【临床意义】

LDH增高主要见于AMI、充血性心衰和心肌炎；还见于病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌、梗阻性黄疸、肌肉损伤、肌萎缩、某些恶性肿瘤（白血病，结肠癌……）等。AMI在常测酶中，LDH升高最慢（8～10h），但升高时间最长（5～10d），峰值可达10倍正常上限。在LDH同工酶中LDH1＞LDH2，并可持续到两周（部分病例总LDH正常）。

（三）肌酸激酶及同工酶主要存在于骨骼肌和心肌细胞，是由一个M亚基和一个H亚基组成的二聚体，有三种同工酶；CK-MM，CK-MB，CK-BB。心肌中CK-MB的活性是骨骼肌的5倍。CK-MB分子量86000，一般在AMI发病4～8小时升高，12～20小时达到高峰，由于它升高和消失都较另外的血清酶标志物早，特别是特异性和敏感性均较优，七十年代初以来被公认为是诊断AMI的“金标准”。

【参考范围】

CK：成年男性45～180U/L（37℃）

女性25～130U/L（37℃）

儿童75～540U/LCK-MB：10～25U/L或CK-MB/CK＜5%

【临床意义】

CK及其同工酶是目前世界上临床测定次数最多的酶，80年代初期统计分别达一亿次和一千万次。此酶测定主要用于早期诊断AMI和判断溶栓治疗的疗效以及判断疾病预后，特别在无Q波型AMI，此时心电图无Q波变化，常需其它检查来协助临床医师诊断和鉴别诊断AMI。

AMI常测定的酶中CK增高最早（4～8h），24h达峰值，2～3d恢复正常，中度升高，常在3000U/L以下。

CK-MB由于大量存在于心肌组织中，其它组织和器官中含量很少，所以CK-MB是目前诊断AMI的一个极其可靠的生化指标，特异性可达95％乃至更高。一般认为其灵敏度比CK总活性稍差，但也有文献报道，约有12.5％AMI患者总CK不高，但CK-MB超过正常。

（四）AST、LDH和CK的特异性比较

（1）AST在心肌细胞中含量最多，但也大量存在于其它器官，故诊断特异性较低。（2）LDH分布广泛，特异性不高，电泳分析LDH1可提高LDH的特异性。（3）CK在心肌细胞中的含量仅次于骨骼肌，CK分子量较小，且主要存在于胞浆中，故在发生AMI时，较其它酶更早进入血液。（五）AMI后心肌酶的时相变化急性心肌梗塞血清酶活力增高时间和倍数

酶延缓时间（小时）活力高峰期（小时）维持天数增高倍数CK-MB3～816～241～420总CK4～1020～303～610AST4～1020～303～61LDH6～1230～607～146AST-m8～124884（六）心肌酶的生理变异1.性别

CK在男女之间有明显差异，男性明显高于女性，因CK主要存在于肌肉组织中，男性肌肉比女性发达。2.年龄新生儿血清LDH、CK为成人的2～3倍，随年龄增长逐步降低，到14岁时达到成人水平。LDH1在儿童期比成人高，正常儿童可出现LDH1＞LDH2。3.运动剧烈运动可引起心肌酶升高，升高的程度和运动量及持续的时间有关，也与运动者是否经常锻炼有关。二、蛋白类标志物

血清心肌酶的测定对AMI的诊断有一定的帮助，但仍存在许多不足；主要为：1.酶活性升高出现较晚，对AMI的早期诊断受到一定的限制。

2.持续时间短，AMI发生3天后CK即可恢复正常。3.特异性较差，其它组织的损伤也可导致心肌酶的升高。而现在发展起来的蛋白类标志物，如肌红蛋白、肌钙蛋白等对AMI的诊断明显优于酶类标志物。

（一）肌红蛋白（Mb）

肌红蛋白是存在于心肌和骨骼肌胞浆中的色素蛋白，不存在于平滑肌中，分子量为17500，半衰期约15分钟。肌红蛋白在AMI发病后1～4小时就可在血中检测到增高，6～7小时达到峰值，是目前代表心肌损伤的升高最早的生化标志物之一。

肌红蛋白无心肌特异性，但其心肌和骨骼肌中含量丰富，AMI时能迅速释放入血，具有高度的敏感性。因此，肌红蛋白的阴性有助于排除AMI的诊断。但其特异性较差。Mb的测定方法很多，主要有免疫化学法，如荧光免疫法、放射免疫法、酶联免疫法和化学发光免疫法等。

（二）心肌肌钙蛋白（cTn）

作为心肌损伤标志物，在临床上已应用了多年（1987年用于AMI的诊断）。由于其高度的心肌特异性，对于心肌损伤的高度敏感性及较长的诊断窗口期，cTnI

已被国外临床医生及检验人员广泛接受，正逐渐取代CK－MB，成为判断心肌损伤，特别是诊断AMI的“金标准”。

在心肌细胞膜完整状态下，cTnI、cTnT不能透过细胞膜进入血循环，故健康人血内不含或含极低量的cTnI和cTnT，当心肌缺血缺氧，发生变性坏死，细胞膜破损时，cTnI、cTnT弥散进入细胞间质，较早地出现在外周血中。心肌肌钙蛋白在发病后出现较早（4小时），持续时间长（4～10天），而且对心肌损伤的敏感性和特异性都较高，故是目前诊断AMI较好的确定标志物。1994～1995年cTnT、cTnI分别被美国食品及药品管理局（FDA

）批准用于临床AMI诊断。

（三）CK-MB质量

1985年，Chan等首先报道了CK-MB质量分析的方法。CK-MB质量分析的方法测定其蛋白浓度（µg/L），避免了活力测定方法中可能遇到（如巨CK等）的干扰。CK-MB质量分析方法采用抗CK-M抗体和抗CK-B抗体或采用CK-MB抗体，适合于自动化分析，具有高度的灵敏性（最低检测限<µg/L）和准确性，测定时间短（最快仅需7min），明显优于其他分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛接受。

心肌损伤标志物的选择心肌损伤标志物依其特点的不同可分为：

1.早期标志物

指在症状出现6小时内血液升高的标志物。Mb、CK、CK-MB、cTnT和cTnI可作为早期标志物，其中Mb是AMI发生后最早出现的标志物，AMI发生后0.5～2小时升高，CK和CK-MB是3～8小时，cTnT和cTnI是3～6小时。

2.中晚期标志物对症状发生后2～3天或更长时间的病人，可选择中晚期标志物进行测定。LDH及其同工酶、cTnT和cTnI可作为中晚期标志物，AMI发生后，LDH及其同工酶升高可维持6～10天，cTnI可维持5～7天，cTnT可维持10～15天。而早期标志物Mb仅维持18～30小时，CK和CK-MB维持2～3天。3.排除标志物

可作为排除标志物的有Mb、cTnT和cTnI，Mb在症状出现早期为阴性一般可排除AMI，但症状出现晚期Mb阴性不能排除AMI，同样，中晚期cTnT和cTnI不升高也不能完全排除AMI。

4.确证标志物

是指在症状出现后6～12小时升高，并能维持异常升高数天，且具有较高的灵敏度和特异性的标志物。cTnT和cTnI是目前认为最好的确证标志物。蛋白类标志物虽优于心肌酶类标志物，但测定花费较高，而心肌酶分析价格低廉、方法成熟，也不失为有效的AMI辅助诊断指标。第三节心脏标志物的测定

一、肌酸激酶的测定（一）测定方法简介CK测定的方法有化学法、酶法、荧光法和化学发光法，在临床上广泛应用的有化学法和酶法。1.肌酸显色法在肌酸激酶的催化下，磷酸肌酸与ADP反应生成肌酸和ATP，生成的肌酸与双乙酰、α-萘酚直接结合生成红色化合物。磷酸肌酸＋ADP肌酸＋ATP肌酸＋双乙酰＋α-萘酚红色化合物540nmCK酶活力单位定义：1ml血清在37℃与底物作用1h产生1μmol肌酸为1个CK活性单位，若将此单位乘以1000/60可换算成国际单位（U/L）。方法简便，试剂易得，灵敏度能满足临床要求，但特异性较低，显色不稳定。

2.酶偶联法

在CK的催化下，磷酸肌酸与ADP反应生成肌酸和ATP；随即在己糖激酶（HK）催化下，生成的ATP使葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖（G6P）；再在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下（G6PDH），6-磷酸葡萄糖与NADP+反应，生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH；在340nm波长下，监测NADPH的生成速率。

【参考范围】男性：46~171U/L(37℃)女性：34~145U/L(37℃)

【注意事项】1.总CK测定值超过2000U/L时，建议在测定CK前，采用不含CK的混合血清稀释样本，混合血清在56℃孵育2h后即不含CK，测定结果乘以稀释倍数。因为血清中存在内源性的抑制剂，如用生理盐水稀释，CK活性将随血清稀释倍数的增加而增加。2.最好采用血清标本，肝素抗凝血浆亦可。勿用柠檬酸盐、EDTA和氟化物作抗凝剂，否则会影响测定结果。3.红细胞中不含CK，轻度溶血对测定无影响，但中度和重度溶血时，红细胞释放出腺苷酸激酶（AK）、ATP及6-磷酸葡萄糖等干扰测定的成分，影响测定结果。4.黄疸和脂血可干扰测定。

二、肌酸激酶测定的临床意义肌酸激酶（CK）主要存在于骨骼肌、脑组织和心肌细胞中，血清CK活性测定主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断和鉴别诊断及预后判断。1.临床上主要用于AMI的诊断。在AMI时，血清中CK活性可显著升高，升高倍数为5～25倍，其增高的程度与心肌损伤的程度基本一致。但在心肌损伤，特别是急性心肌梗死时可显著升高，为应用最广泛的心肌损伤指标之一。3.骨骼肌疾病和损伤，CK活性极度升高，可高达参考范围上限200倍。4.脑血管意外、脑膜炎等中枢神经系统疾患以及甲状腺功能减退等均可致血清CK活性升高。5.某些药物如拉贝洛尔、两性霉素B、利多卡因、琥珀酰胆碱、奎尼丁、贝特类降血脂药等亦可致CK活性升高。二、肌钙蛋白的测定目前，临床实验室cTnT测定多采用酶联免疫吸附试验（ELISA法），检测试剂盒至今仍仅一个厂家生产，为德国Roche公司独家专利；cTnI检测方法较多，定性检测采用胶体金免疫层析法，定量检测多采用化学发光免疫法、ELISA法和免疫比浊法。（一）测定方法简介1.胶体金免疫层析法快速检测cTnI此法集免疫反应与色谱层析之特点，用胶体金代替酶标记抗cTnI，使待测样品中cTnI与金-抗cTnI结合物结合，通过层析，在包被有抗cTnI处形成“抗cTnI-cTnI-金标抗体”夹心物而出现肉眼可见的紫红色水平带。该方法最低检出限为0.3μg/L。具有标本用量少，不需任何设备，易于操作，整个检测过程在10min内即可完成。2.化学发光免疫法该法是采用针对cTnI的单克隆抗体建立的双抗体夹心法。用单克隆抗cTnI抗体包被于固相载体磁性微粒上，作为捕获抗体；用碱性磷酸酶（ALP）标记另一抗体，为检测抗体；样品中的cTnI（抗原）与此二抗体结合形成复合物；在反应体系中，加入磷酸酯发光剂（AMPPD），AMPPD在ALP催化下去磷酸化，生成具有荧光活性的物质。

3.免疫比浊法测定血清cTnI在溶液中，抗原抗体按一定比例反应时，形成抗原抗体免疫复合物，均匀分散在溶液介质中，光线通过溶液时，混浊液内的颗粒能够吸收光线，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比。目前，测定血清cTnI普遍采用胶乳增强免疫比浊法，这是新一代免疫测定技术，胶乳使抗原抗体复合物体积增大，大大提高了免疫比浊法的敏感性，最低检出限达到了ng/ml水平。

4.ELISA法测定