药物分析第十一章抗生素

药物分析第十一章抗生素本法得优点:灵敏、用量小,结果直观适用范围广:纯度好得、差得制品,已知或新发现得抗生素均适用,同一类型得抗生素不需分离,可一次测定其总效价。缺点:操作步骤多,测定时间长,误差大等。2理化方法——适用于提纯得产品以及化学结构已确定得抗生素优点:迅速、准确、有较高得专属性。缺点:对含有具同样官能团杂质得供试品不适用,或需采取适当方法加以校正。而且当该法就是利用某一类型抗生素得共同结构部分得反应时,所测得得结果,往往只能代表药物得总得含量,并不一定能代表抗生素得生物效价。3第二节β-内酰胺类抗生素头孢菌素族青霉素族一、化学结构与性质*****6-氨基青霉烷酸7-氨基头孢菌烷酸4酸性:青霉素和头孢菌素分子中得游离羧基具有相当强得酸性,大多数青霉素得pKa在2、5～2、8之间,能与无机碱或某些有机碱形成盐。旋光性:青霉素族分子中含有三个手性碳原子,头孢菌素族含有两个手性碳原子,故都具有旋光性。5β-内酰胺环得不稳定性:β-内酰胺环就是该类抗生素得结构活性中心,其性质活泼,就是分子结构中最不稳定部分,其稳定性与含水量和纯度有很大关系。在酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子(铜、铅、汞和银)或氧化剂等作用下,易发生水解和分子重排,导致β-内酰胺环得破坏而失去抗菌活性。6二、鉴别试验(一)呈色反应羟肟酸铁反应青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用,β-内酰胺环破裂生成羟肟酸;在稀酸中与高铁离子呈色。茚三酮反应(侧链含-氨基酸结构)与重氮苯磺酸得偶合反应(侧链含酚羟基)硫酸-甲醛试验7(二)各种盐得反应钾、钠离子得火焰反应有机胺盐得特殊反应(如普鲁卡因青霉素得重氮化-偶合反应)(三)色谱法高效液相色谱法(HPLC)薄层色谱法(TLC)中国药典收载得头孢菌素族药物和大多数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别。8(四)光谱法IR——各国药典对收载得β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。该类抗生素共有得特征峰:

－内酰胺环羰基得伸缩振动(1750～1800)仲酰胺得氨基、羰基得伸缩振动(3300cm-1±,1525cm-1±,1680cm-1±)羧酸离子得伸缩振动(1600cm-1±、1410cm-1±)UV——利用最大吸收波长鉴定法或利用水解产物得最大吸收波长鉴定法。9三、特殊杂质得检查本类抗生素得特殊杂质主要有高分子聚合物,有关物质,异构体等,一般采用HPLC法控制其量,也有采用测定杂质得吸收度来控制杂质量得。10聚合物——HPLC法聚合物得检查采用分子排阻色谱法。分子排阻色谱法得分离原理为凝胶色谱柱得分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶(sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶(sepharose)等为填充剂。现以头孢她啶中头孢她啶聚合物得测定为例1112大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流色谱条件与系统适用性试验

用葡聚糖凝胶G-10(40～120

m)为填充剂,玻璃柱内径1、3～1、5cm,床体积50～60mL;流动相A为含3、5%硫酸铵得0、01mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7、0),流动相B为0、01%十二烷基硫酸钠溶液;流速为每分钟1mL;检测波长为254nm。以流动相A为流动相,用1mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液进样200

L进行测定,理论板数应不低于900,拖尾因子在0、75～1、5,对照品溶液以流动相B为流动相,重复进样200

L,峰面积值得相对标准差应小于5、0%。排阻分子量在1000左右13对照品溶液得制备:取头孢她啶对照品适量,精密称定,加水制成含头孢她啶100

g/1mL得溶液,摇匀。测定法:取本品适量,精密称定,加水制成含头孢她啶20mg/1mL得溶液,立即进样200

L,以流动相A为流动相进行测定,记录色谱图;另取对照品溶液200

L注入液相色谱仪,以流动相B为流动相,记录色谱图,按外标法计算,本品含头孢她啶聚合物以头孢她啶计不得过0、3%。14自身对照外标法得原理:该法就是利用特定条件下β-内酰胺类抗生素可以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为得缔合物,即在Kav=0处表现为单一得色谱峰。以药物自身为对照品,测定其在特定条件下缔合时得峰响应指标;然后改变色谱条件,测定样品,记录样品色谱图中Kav=0处得高分子杂质峰得响应指标,按外标法计算,即得样品中高分子杂质相当于药品本身得相对含量。Kav=有效分配系数15自身对照液样品液流动相B——0、01%十二烷基硫酸钠溶液流动相A——含3、5%硫酸铵得0、01mol/L磷酸盐缓冲液缔合物高聚物A高聚物﹤A缔合物16有关物质和异构体

例1头孢呋辛酯中有关物质和异构体得检查:色谱条件与系统适用性试验:要求头孢呋辛酯A,B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△3-异构体之间得分离度R﹥1、5。头孢呋辛酯A,B异构体、△3-异构体及E异构体峰得相对保留时间分别约为1、0、0、9、1、2及1、7和2、1。

异构体——供试品色谱图中A异构体峰得面积与A、B异构体峰得面积和之比应为0、48～0、55。有关物质——按自身对照法测定,E异构体不得过1、0%;△3-异构体不得过1、5%;其她单个杂质不得过0、5%并规定了总杂质量不得过3、0%。

171头孢呋辛；2异构体B；3异构体A；4△3-异构体；5,6E异构体△3-异构体就是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏处理而制得,E异构体经紫外光照射24h制得。头孢呋辛酯就是由两个非对映异构体头孢呋辛酯A和B组成得混合物18吸光度如青霉素钠(钾)得吸光度检查:取本品,加水制成每1mL中含1、80mg得溶液,照分光光度法,在280nm得波长处测定吸收度,不得大于0、10;在264nm得波长处有最大吸收,吸收度应为0、80～0、88。此法中264nm处吸收值用来控制青霉素钠(钾)得含量,280nm处吸收值用来控制杂质得量。19四、含量测定高效液相色谱法这就是β-内酰胺类抗生素含量测定得主要方法。中国药典收载得本类抗生素原料及制剂共约70种,应用HPLC法测定含量得有50多种,约占78%。本类药物得HPLC法通常采用反相HPLC,以外标法计算含量。20第三节氨基糖苷类抗生素这类抗生素得化学结构都就是以碱性环已多元醇为苷元,与氨基缩合而成得苷,故称为氨基糖苷类抗生素。主要有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等她们得抗菌谱和化学性质都有共同之处。21一、化学结构与性质链霉素链霉素22庆大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7C2CH3HHC20H41N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7C1aHHHC19H29N5O7庆大霉素23二、鉴别试验茚三酮反应——本类抗生素具羟基胺类和α-氨基酸得性质,可与茚三酮缩合成蓝紫色化合物。N-甲基葡萄糖胺反应——水解,产生葡萄糖胺衍生物,在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物,再与对二甲氨基苯甲醛得酸性醇溶液反应,生成樱桃红色缩合物。吡咯衍生物樱桃红色缩合物24麦芽酚(Maltol)反应在碱性溶液中,链霉糖经分子重排、扩环、消除反应,生成麦芽酚,与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。麦芽酚紫红色为链霉素得专属反应25坂口(Sakaguchi)反应——链霉素水溶液加氢氧化钠试液,水解生成链霉胍与8-羟基喹啉、次溴酸钠反应,生成橙红色化合物。为链霉素得专属反应26三、特殊杂质检查及组分分析1、链霉素中链霉素B得检查链霉素B就是指甘露糖链霉素,由发酵产生,其生物活性仅为链霉素得20%~25%,能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和链霉素。中国药典(2005)新规定了该项检查,采用薄层色谱法测定。27溶液配制供试品溶液:取本品0、25g,精密称定,置回流瓶中,加入5ml新鲜配制得硫酸-甲醇溶液(397׃

)溶解,加热回流1h,冷却,用甲醇冲洗冷凝管,合并冲洗液,并用甲醇定量稀释成每1ml中含10mg得溶液,作为供试品溶液。对照溶液:精密称取甘露糖对照品约36mg,置回流瓶中,同法处理后定量制成每1ml中含72

g得溶液,作为对照溶液。28TLC方法薄层板:硅胶G点样:各10μl,分别点于同一薄层板上展开剂:甲苯-醋酸-甲醇(5025׃25׃)显色剂:新鲜配制得1,3-萘二酚与硫酸混合溶液,在110

C加热数分钟显色。限度:供试品溶液所显链霉素B斑点得颜色与对照溶液得主斑点比较,不得更深(3、0%)。L=×100%×100%=3.0%70×4.1310×1000C×4.13S×1000根据1mg甘露糖相当于4、13mg得链霉素B,则:限量？292、硫酸奈替米星中有关物质得TLC检查:供试品溶液:150mg/mL;标准品溶液(1)1、5mg/mL;标准品溶液(2)3mg/mL;标准品溶液(3)1、44mg西索米星/mL,点样:各2

L,展开剂:二氯甲烷-甲醇-浓氨溶液(4:4:2)显色:0、2%茚三酮溶液,110℃加热20min。30结果:供试品溶液如显杂质斑点,其颜色与标准品溶液(3)所显主斑点相比较,不得更深(1%),其她杂质与标准品溶液(1)所显主斑点相比较,均不得更深(1%),如有一点超过,应不深于标准品溶液(2)得主斑点(2%)。

注:奈替米星就是由西索米星经化学衍生而成得半合成抗生素,因此在奈替米星成品中有可能残留西索米星,需进行控制。样西对1对2

供试品溶液:150mg/mL;标准液(1)1、5mg/mL;标准液(2)3mg/mL;标准液(3)1、44mg西索米星/mL313、庆大霉素C组分测定庆大霉素C1、C2、C1a对微生物得活性无明显差异,但其毒副作用和耐药性有差异,导致各组分得多少影响产品得效价和临床疗效。因此各国药典均规定控制各组分得相对百分含量。庆大霉素无紫外吸收,当采用HPLC-紫外检测器检测时,需进行衍生化处理。由于其具有强极性和水溶性,为获得理想得色谱结果,可采用离子对色谱法,以庚烷磺酸钠为反离子。32如USP(29)利用庆大霉素C组分结构中得氨基与邻苯二醛(OPA)、巯基醋酸在pH10、4得硼酸盐缓冲液中反应,生成1-烷基-2-烷基硫代异吲哚衍生物,在330nm波长处有强吸收。ChP和BP曾采用USP同样得方法测定庆大霉素C组分,但在现版药典中分别改用了蒸发光散射检测器和电化学检测器。庆大霉素OPA巯基醋酸异吲哚衍生物33ChP(2005)采用蒸发光散射检测器检测色谱条件:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(pH值范围0、8～8、0);0、2mol/L三氟醋酸-甲醇(92:8)为流动相,流速0、6ml/min;蒸发光散射检测器检测34系统适用性试验分别称取庆大霉素和小诺霉素标准品各适量,用流动相制成每1ml中各含0、2mg得溶液,取20

l注入液相色谱仪,记录色谱图、C组分得出峰顺序从第二个主峰计,依次为庆大霉素C1a、C2、小诺霉素、C2a、C1;C2、小诺霉素和C2a峰之间得分离度应符合要求;连续进样得小诺霉素峰面积得相对标准偏差应不大于2、0%。35测定法取小诺霉素标准品适量,精密称定,分别用流动相制成每1ml中约含小诺霉素0、2mg、0、5mg和1、0mg得溶液作为标准品溶液(1)、(2)、(3)。取上述三种溶液各20

l,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,计算标准品溶液浓度得对数值与相应得主峰面积对数值得回归方程,相关系数(r)应不小于0、99;lg0.2lg0.5lg1.0lgAr≥0、9936另取本品适量,精密称定,用流动相制成每1ml中约含庆大霉素2、5mg得溶液,同法测定,用回归方程计算供试品中对应各组分得量(Xcx),并根据所得得各组分得量(Xcx)按下面公式计算出各组分得含量。式中Cx

为庆大霉素各组分得含量;C1应为25%～50%,C1a应为15%～40%,C2a+C2应为20%～50%。37第四节四环素类抗生素这类抗生素分子有四个环构成,故统称为四环素类(tetracyclines)抗生素。一、化学结构与性质化学结构:四环素类抗生素,可以看作四骈苯或萘骈萘得衍生物。38性质1、酸碱性(具两性)2、旋光性(有多个手性碳)3、紫外吸收和荧光(刚性平面结构)4、与金属离子形成配位化合物5、不稳定性四环素类抗生素对各种氧化剂(包括空气中氧在内)、酸、碱都就是不稳定得,易发生差向异构化、降解等反应。39二、鉴别试验1、浓硫酸反