大鼠颈动脉再狭窄模型的建立以及P27靶向治疗支架内再狭窄在体研究

1/1大鼠颈动脉再狭窄模型的建立以及P27靶向治疗支架内再狭窄在体研究华中科技大学硕士学位论文大鼠颈动脉再狭窄模型的建立以及P27靶向治疗支架内再狭窄的在体研究姓名：

谈宝珍申请学位级别：

硕士专业：

内科学（心血管）指导教师：

吕家高2010-04华中科技大学硕士学位论文大鼠颈动脉再狭窄模型的建立以及P27靶向治疗支架内再狭窄的在体研究中文摘要目的：

成功建立颈动脉再狭窄的大鼠模型，并观察慢病毒介导组织特异性启动子SM22alpha驱动p27基因对动物模型的血管平滑肌增殖的抑制效果。

方法：

使用球囊法损伤大鼠颈总动脉，HE染色观察颈总动脉血管内皮的平滑肌细胞增殖情况。

将SM22alpha驱动的p27重组慢病毒转入动物模型，对照组术后注射紫杉醇。

运用HE染色和免疫组化的方法观察并对比二者术后的血管内皮平滑肌细胞的增殖情况。

结果：

HE染色显示，球囊损伤7、14、28天的大鼠颈动脉上均有新生内膜形成，并伴有平滑肌细胞增生。

且三个时间点的血管中膜内膜比和狭窄率有显著性差异（p0.05）。

感染p27重组慢病毒的大鼠血管内膜下平滑肌细胞增生极少，仅从光镜下可见细微的增生情况。

p27重组慢病毒转染的大鼠血管内膜中膜比和狭窄率与阳性对照紫杉醇组有明显差异。

结论：

采用球囊扩张的方法可使大鼠颈动脉形成明显的狭窄，其病理过程与支架内再狭窄相似，可用于再狭窄的形成机制和药物治疗研究。

SM22alpha驱动的p27重组慢病毒能顺利感染颈动脉再狭窄的动物模型，并特异性抑制了血管平滑肌细胞的增殖。

关键词：

支架内再狭窄；大鼠；颈动脉再狭窄；p27；血管平滑肌细胞；增殖2华中科技大学硕士学位论文StudyonModelEstablishmentofCarotidRestenosisinRatsandTargetedTharepiesofIn-stentRestenosisAbstractObjective:Toestablishtheratsmodelofcarotidrestenosis,andinvestigatetheinhibitioneffectsofp27genespecificitydrivenbySM22alphagene(Lenti-SM22alpha-p27)promoterontheproliferationofvascularsmoothmusclecells(VSMCs).Methods:Injuriedthecarotidofratsbyballoon,observedtheproliferationofVSMCsinintima.InfectedanimalswithLenti-SM22alpha-p27,andcontrasttheproliferationofVSMCstotheratsinjectedbyTaxolatthesametime.Results:Therewereallneointimaformedinballooninjuriedcartiods,andwouldbethickerwhentimegoesonin28days.theratstreatedbyp27havefewVSMCsproliferationandsignificantlydifferentfromratscuredbytaxol.Conclusion:Thepathophysiologyappearedinballooninjuriedratswassimilartoin-stentrestenosis(ISR),canbeusedforthestudiesofISR.TheLenti-SM22alpha-p27caninfectVSMCssuccessfullyandover-expressedp27tohaveasignificantinhibitionofproliferlationtoVSMCs.Keywords:ISR;rat;carotidrestenosis;p27;VSMCs;proliferlation3华中科技大学硕士学位论文英文缩写词表AbbreviationsCHDCDKCDKDESECFVIIIISRPCIcoronaryarteryheartdiseasecyclindependentkinasecyclindependentkinasedrug-elutingstentendothelialcellAnti-factorVIIIin-stentrestenosisPercutaneouscoronaryintervention冠心病细胞周期依赖酶细胞周期依赖酶药物洗脱支架内皮细胞VIII因子相关抗原抗体支架内再狭窄经皮冠状动脉介入治疗PTCApercutaneoustransluminalcoronary经皮冠状动脉腔内血管成angioplasty，形术SPFVSMCSpecificpathogensFreevascularsmoothmusclecell1无特定病原体血管平滑肌细胞独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。

尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。

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月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：

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本论文属于不保密□。

（请在以上方框内打）学位论文作者签名：

年指导教师签名：

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月日年月日华中科技大学硕士学位论文前言冠心病（coronaryarteryheartdisease,CHD），是一种最常见的心脏病，是指因冠状动脉狭窄、供血不足而引起的心肌机能障碍和(或)器质性病变，也是全世界发病率最高的疾病之一。

目前治疗冠心病最有效的方法是经皮冠状动脉介入治疗（percutaneouscoronaryintervention，PCI）。

自1977年发明经皮冠状动脉腔内血管成形术（percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA）以来，冠心病的介入治疗已进入支架时代。

虽然近年来支架置入成功率较高，可达90%以上，但是仍然有20-55%的患者在术后形成支架内再狭窄（in-stentrestenosis，ISR）,严重影响预后。

目前对ISR的研究显示，IRS的形成由多种因素参与而促成，其中大量研究表明，血管内膜的增厚和血管重建是发生IRS的主要原因。

血管内皮细胞（endothelialcell，EC）在正常状态下能分泌生长抑制因子和NO，从而抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖。

同时完整的血管内皮能隔绝多种生长因子（如纤维母细胞生长因子、血小板生长因子等）以减轻其对血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell,VSMC）的刺激，使平滑肌细胞稳定在静息状态。

介入治疗不可避免的会对血管内皮细胞造成损伤，从而使平滑肌细胞接触到各种生长因子而可能发生不受控制的增殖。

目前针对冠脉内细胞增殖的有关治疗如局部放疗、药物涂层支架等已广泛应用于临床，并产生了一定的疗效，尤其是雷帕霉素，紫杉醇等药物，通过抑制细胞周期依赖酶（cyclindependentkinase，CDK）抑制细胞周期，显著降低了ISR的发生率。

但是也存在一定缺陷，由于这些药物无靶向性，同时抑制了平滑肌细胞和内皮细胞的增殖，延迟了内膜修复，有导致迟发性血栓的危险。

另一方面，血管内膜内皮细胞功能受损，对平滑肌细胞的接触抑制功能丧失，促进了平滑肌细胞的增殖和迁移。

因此，选择具有靶向性控制平滑肌细胞增殖的药物作为支架的涂层成为目前心血管疾病介入治疗研究的热点。

随着利用抑癌基因在抑制肿瘤细胞增生方面研究的深入，利用抑癌基因负性调节细胞的生长已成为研究治疗细胞增生性疾病的重点和热点。

p27是最重要的抑癌基因之一，是广谱的细胞周期依赖酶抑制剂。

已有大量研究证实，p27可通过连接不同的细胞周期蛋白-细胞周期依赖激酶复合物如cyclinD-CDK4、4华中科技大学硕士学位论文cyclinD-CDK6、cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2等，进而广泛的抑制CDKs的活性，在真核细胞的细胞周期调控中起关键作用。

本研究拟模仿PCI术后再狭窄的原理，使用球囊损伤大鼠颈总动脉，建立大鼠颈总动脉再狭窄模型，并将由SM22alpha启动子驱动的p27重组慢病毒导入由球囊损伤的大鼠颈动脉再狭窄模型中。

观察慢病毒中的外源性p27是否能靶向性转染至大鼠受损的血管平滑肌细胞并控制其增殖，抑制血管内膜的增生，为p27作为基因治疗PCI术后再狭窄的研究提供一定的理论基础。

5成的血管弹性回缩和血管重建。

本实验拟通过模拟PTCA的手术方式对大鼠行华中科技大学硕士学位论文第一部分大鼠颈动脉再狭窄模型的建立经皮冠状动脉腔内血管成形术（PTCA）是目前治疗冠心病最有效的方法之一。

但其术后高发的支架内再狭窄（ISR）率严重影响了PTCA的疗效。

对PTCA术后发生的支架内再狭窄的研究成为目前介入治疗冠心病的重大热点和难点之一。

相关研究发现:发生ISR的主要机制为血管内膜的过度增生以及扩张血管后造[1]颈总动脉球囊扩张术,建立与ISR病理特征相似的大鼠颈总动脉再狭窄模型，为研究和治疗ISR提供可靠的动物在体实验模型。

1材料和方法1.1主要材料1.1.1实验动物体重300-400gSPF级雄性Wistar大鼠15只由同济医院动物实验中学提供。

许可证号：

SCXK(鄂)2008-00051.1.2实验设备单人双目手术显微镜（10x）1.1.3实验药品中科院光电技术研究所科奥达公司碘伏消毒液6%水合氯醛合剂10%中性缓冲福尔马林青霉素注射剂160万单位装低分子肝素钠注射剂4000单位：

0.4毫升1.1.4实验器材AvionPlus球囊扩张导管1.25F手术器械若干医用缝合针（角1/2弧）6同济医院药剂科（自制）同济医院药剂科（自制）同济医院药剂科（自制）华北制药厂赛诺菲安万特中国集团购于同济医院器材科购于同济医院器材科购于同济医院器材科华中科技大学硕士学位论文医用缝合线（3号）医用球囊扩张压力泵实验动物固定板1.1.4主要试剂HE染色试剂VIII因子相关抗原抗体（FVIII）购于同济医院器材科同济医院心导管室提供自制上海沪峰化工有限公司美国Abcm公司1.2实验方法1.2.1手术器械消毒采用高压蒸汽灭菌法将手术器械，棉球消毒。

球囊扩张导管和球囊扩张压力泵用75%消毒酒精浸泡。

1.2.2称重，麻醉，固定1.2.2.1实验动物称重将盛放大鼠用的容器放在称重台上清零，抓住实验用大鼠尾部中段提起，轻轻放入容器中，将容器放入称重台，待称重台读数显示稳定后读取大鼠重量。

1.2.2.2实验动物麻醉，固定1．根据大鼠重量按5ml/kg计算6%水合氯醛注射量。

将水合氯醛溶液中的沉淀摇匀后，用注射器抽取相应剂量水合氯醛溶液备用。

2．左手抓住鼠尾中段提起大鼠，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用拇指和食指捏住鼠耳后面的皮肤，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，使其腹部向上。

大鼠性情比较凶猛，抓取过程中一定要佩戴帆布手套，以免咬伤。

左手尽可能多的捏紧大鼠耳后的皮肤和背部的皮肤，以防被大鼠回头咬手。

如果大鼠体积较大或左手力量较小，可用右手固定大鼠，左手操作。

3.右（左）手将注射针头于大鼠左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。

药液注射完毕抽出针头，将大鼠放7华中科技大学硕士学位论文回容器。

腹腔注射时入针位置应在下腹并靠近腹部中线。

注射器针头穿过腹肌时会有突破感，这时需将注射器回抽确定无血后才可将麻药缓慢注入，以免麻药注入肠道或腹腔脏器，造成大鼠死亡。

4.将失去行动能力的大鼠腹部朝上放到固定板上，用橡皮筋分别固定四肢。

1.2.3分离颈外动脉1.2.3.1备皮用粗剪刀剪去大鼠颈部被毛。

剪刀应紧贴大鼠颈部皮肤，不可用手提起被毛，以免剪破皮肤。

剪下的毛应集中放在一个有水容器内，勿留在手术野和固定板周围，以保证手术野的清洁和防止其他手术器械和注射器等夹毛。

1.2.3.2分离组织，暴露颈外动脉手术显微镜下沿颈正中线剪开大鼠皮肤，沿颈正中线钝性分离浅筋膜、甲状腺等，暴露左侧颈动脉三角。

继续钝性分离颈动脉三角，可见跳动的颈总动脉。

沿颈总动脉向大鼠头部方向寻找，可以见颈总动脉向上分为颈外动脉和颈内动脉。

分别分离出颈外动脉和颈内动脉如（图1-1），位于颈总动脉分叉处上方的血管为颈外动脉，下方为颈内动脉。

临时结扎颈内动脉，将一尺寸裁剪合适的铝箔片折叠后垫入颈外动脉下方，如（图1-2，1-3）。

铝箔片可为后面颈外动脉的剪开和导管的进入提供受力点，在一定程度上防止剪开颈外动脉时和插入导管过程中发生抖动，减少流血，方便手术操作。

结扎颈外动脉远心端。

注意事项：

1.钝性分离外周组织时应动作轻柔，沿肌肉走向分离。

尽量少用锐器剪割浅筋膜和肌肉，以免流血过多影响手术视野。

2.铝箔片应折叠后将对折的一边朝向颈总动脉分叉处插入颈外动脉下方，游离端比较锋利，易将血管割伤。

3．结扎颈外动脉后，应检查结扎处到颈总动脉间的颈外动脉段有无细小的动脉分支，若有细小分支，应结扎，否则球囊插入过程中会引起颈外8华中科技大学硕士学位论文动脉开口处出血，影响手术操作。

1.2.4插入球囊导管，损伤血管内膜连接球囊导管与压力泵，检查球囊有无破损，确定完好后抽出球囊内空气，放置一边备用。

用动脉夹将颈总动脉夹闭，在显微镜视野下在尽量靠近颈外动脉结扎处的血管壁上轻轻剪开一个破口擦去流出的血液。

将导管球囊端轻轻插入开口处，缓慢送入颈总动脉如图1-4。

球囊进入颈总动脉时会有轻微阻力，可缓慢转动球囊并继续向前，直到球囊到达动脉夹处。

松开动脉夹，迅速将球囊全部送入颈总动脉段，压力泵将球囊充气，定压到4bar，阻断血流30秒，如图1-3。

将球囊在颈总动脉来回抽动3-5次，抽出球囊结扎颈外动脉近心端。

冲洗球囊，检查导管通畅性。

注意事项：

1.若剪开颈外动脉后有连续性流血，应压迫开口处止血，并检查颈总动脉是否完全夹闭，颈外、颈内动脉是否结扎紧，颈外动脉段上是否有未结扎的细小分支，及时处理出血原因。

2.若球囊刚进入颈外动脉时就感觉有阻力，可能是球囊进入血管外膜而未真正进入管腔或抵在血管壁上。

此时不能使用蛮力继续推进，应退出球囊重新进入，或者调整方向稍稍转动球囊后再尝试进入。

3．松开动脉夹时插管处会有大量血液涌出，应尽快将球囊充气止血，并擦净流出血液。

时间过长会导致血凝块在手术视野内形成，影响操作。

1.2.5缝合，抗凝，抗感染松开颈内动脉结扎处，确定无出血后用青霉素溶液冲洗伤口，缝合。

皮下注射低分子肝素钠溶液防止血栓生成，肌肉注射青霉素抗感染。

术后两天继续注射青霉素防止感染，正常饮食。

注意事项：

若使用抗凝药物为一般肝素，应在手术前注射。

低分子肝素钠抗凝起效快，且效果优于一般肝素，故可在术后使用以免术前使用引起手术过程中流血过多。

9华中科技大学硕士学位论文1.2.6取大鼠颈总动脉手术后7日、14日和28日分别取大鼠手术侧血管和未手术侧血管作为手术组和对照组。

1.2.6.1麻醉，固定大鼠取术后大鼠，称重，腹腔注射致死剂量6%水合氯醛溶液，待大鼠丧失行动能力后腹部朝上放到固定板上，用橡皮筋分别固定四肢。

1.2.6.2分离组织，取出血管沿颈正中线剪开外皮，钝性分离左侧肌肉，暴露左侧颈总动脉。

剪开胸骨，分离左侧颈总动脉。

分别结扎颈总动脉近心端和远心端，用镊子夹住颈总动脉，轻轻剪下颈总动脉段。

再钝性分离右侧颈动脉三角，结扎右侧颈总动脉的近心端和远心端，剪下颈总动脉段，作为对照组。

注意事项：

1.手术后大鼠颈动脉三角的组织会发生粘连，导致结构模糊，不易找到颈总动脉。

可在分离颈部浅层肌肉后寻找手术时留下的颈外动脉结扎处的线头，循结扎处向下分离，即可看见颈总动脉。

2.结扎手术侧颈总动脉远心端的位置应在颈总动脉分叉处，在距离分叉处大约一个球囊左右距离的地方结扎颈总动脉。

距离太长容易将球囊未损伤的颈动脉段也剪下，影响对实验结果的观察。

3.手术侧的颈总动脉弹性较弱，用力牵拉会导致动脉断裂。

且动脉周围组织粘连较紧，分离动脉时应小心操作，轻柔剥离。

4.取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构。

1.2.7组织的固定，切片，染色1.2.7.1组织石蜡包埋和切片1.将取下的动脉段用0.9%生理盐水冲洗后放入10%中性缓冲福尔马林溶液中固定24小时。

10华中科技大学硕士学位论文2.倒掉福尔马林溶液，加pH7.4PBS,每隔8小时更换一次，4℃保存，换液3天。

3.打开烘箱，调温至62℃，融石蜡。

4.酒精梯度脱水（30％、50％、70％、80％、90％、95%、100％2），隔30分钟更换一次。

5.50％酒精＋50％二甲苯30分钟（过渡步骤）。

6.100％二甲苯，时刻观察组织块至透明。

7.放入烘箱中已经预融的50％石蜡＋50％二甲苯中，30分钟。

8.100％石蜡两遍，每次2小时。

(若石蜡浸润不够，仍有二甲苯，则包埋后的石蜡块较脆，易分层、断裂。

)9.100％石蜡纸盒内凝固（先用蜡打底，再放入组织块，浇上蜡包埋，放入4℃冰箱或水中冷凝，标明组织块放入方向），4℃存放备用。

10.修块。

11.融化石蜡抹于块底，贴在木块上，压实。

12.切片（5－10m）,将切片平展于平板上，光面朝上。

13.将光面朝下，将石蜡薄切片放于水面上（水温40℃），使其伸展。

（时间勿太长）14.将石蜡薄片贴在预先处理好的玻片上。

15.40℃烘烤过夜。

注意事项：

1.固定液应充足，体积应在所取标本体积20倍以上。

2.组织块在二甲苯中的时间不宜过长，使组织透明即可。

若较长时间后透明度仍不好，应检查原因，如因脱水不充分，应重新脱水。

3．烘箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能超过60℃；浸蜡时间不宜过长。

浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。

4.包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。

5.包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织11华中科技大学硕士学位论文周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：

a.脱水不彻底。

b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。

c.组织内还残留有较多的透明剂，d.石蜡不纯。

6.包埋箱中的温度必须保持恒定。

1.2.7.2石蜡切片脱蜡，HE染色1．脱蜡二甲苯I10分钟二甲苯II5分钟2．水化100%酒精I5分钟100%酒精II5分钟95%酒精I5分钟95%酒精II5分钟85%酒精3分钟75%酒精2分钟蒸馏水冲洗1分钟3．染色苏木精染色5分钟自来水洗盐酸酒精分化15秒自来水洗（镜检）自来水洗15分钟0.5%伊红染色1分钟蒸馏水洗2分钟75%酒精2分钟85%酒精2分钟95%酒精I5分钟95%酒精II5分钟12华中科技大学硕士学位论文100%酒精I5分钟100%酒精II5分钟二甲苯I5分钟二甲苯II5分钟4．封片上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡注意事项：

1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的处理是不一样的。

2．染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度及实验室的实际情况等灵活掌握。

在室温高、切片、染色液又是新配制的，染色时间就要短，反之时间就长。

3．伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。

4．在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时，这样可以使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。

5．二甲苯在HE染色中有脱蜡、透明的作用。

二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时