DB37T-动物疫病鉴别检测技术 第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒编制说明

《动物疫病鉴别检测技术第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒》地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源任务来源于《2019年度标准化综合改革暨“山东标准”建设计划项目》中的“乡村振兴标准化建设项目”（鲁标改办发〔2019〕6号），本文件由山东省畜牧兽医局提出，由山东省畜牧业标准化技术委员会归口，由山东省滨州畜牧兽医研究院牵头组织编制。起草单位、起草人及任务分工地方标准由山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司与威海市畜牧业发展中心共同起草，起草人及任务分工见下表。姓名性别职务/职称工作单位任务分工沈志强男研究员山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司主持制定标准、负责全面审核王金良男研究员山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司标准文本及编制说明的统稿、校对于新友男副研山东绿都生物科技有限公司标准文本及编制说明的起草、修改谢金文男副研山东省滨州畜牧兽医研究院标准检测方法的建立肖跃强男研究员山东省滨州畜牧兽医研究院标准检测方法的验证曲光刚男研究员山东省滨州畜牧兽医研究院试验数据分析魏凤男副研山东省滨州畜牧兽医研究院征求意见稿反馈意见的收集与整理董林男副研山东省滨州畜牧兽医研究院依据反馈意见对检测方法的再次验证。孟卫芹女助研山东省滨州畜牧兽医研究院标准文本的内容修改。赵国清男工程师威海市畜牧业发展中心标准文本的格式修改及提交材料的准备。（三）起草过程收到立项批复后，启动标准的编写。主要过程及时间节点见下表。时间内容2019年9月-2019年10月实验研究、查阅相关技术资料和文献调研。2019年11月－2019年12月编写《动物疫病鉴别检测技术第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒》，试验验证及分析相关实验数据，并进行修订、完善。2020年1月-2022年2月进行项目专家函审；收集、汇总专家修改意见，继续反复试验验证，完善检测技术方法，形成《动物疫病鉴别检测技术第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒》送审稿。2022年3月-2023年1月申请山东省地方标准审查，依据专家意见对标准及编制说明文本进行修改。2023年2月召开地方标准审查会议。邀请9位专家对标准案进行整体审查，范围、规范性引用文件、术语与定义等审查，题目、前言审查，试剂或材料、仪器审查，结果判定审查，附录审查及检测技术审查。2023年3月-2023年7月依据专家审查会意见对标准及编制说明文本进行修改与完善，形成《动物疫病鉴别检测技术第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒》报批稿，并申请山东省地方标准报批。二、地方标准制定目的和意义猪瘟（Classicalswinefever,CSF），也称猪霍乱，是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）引起猪和野猪的一种急性、高度接触性传染病，死亡率高达90%以上，该病以稽留高热、出血、梗死、坏死和高死亡率为主要特征，可分为急性、亚急性、慢性、非典型性或不明显型猪瘟，给养猪业造成严重的经济损失。被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的动物疫病，被我国列为二类动物传染病。猪瘟在家猪和野猪中传播广泛，发达国家采取前期疫苗免疫+检测扑杀控制猪瘟，后期采取检测+扑杀消灭猪瘟的策略，已有20多个国家宣布消灭了猪瘟。猪瘟兔化弱毒脾淋苗是将猪瘟兔化弱毒毒株接种于成年兔子，然后无菌采集兔子体内含毒浓度比较高的淋巴结和脾脏，再将收集到的淋巴结和脾脏进行减毒制备而成的疫苗，又称之为“脾淋苗”，在我国猪瘟疫病防控过程中发挥了重要作用；目前，我国仍然采取以疫苗免疫预防为主，检测净化扑杀为辅的策略防控净化猪瘟。近年来猪瘟流行方式和发病特点发生了很大变化，给兽医临床诊断带来了很大困难。中国猪瘟兔化弱毒株疫苗的大规模应用，导致常规的猪瘟病毒核酸检测难以区分猪瘟病毒的强毒感染和免疫接种的疫苗弱毒，迫切需要建立一种快速、特异的标准技术来来区分猪瘟强毒和猪瘟疫苗弱毒。该检测标准的制定实施，将为猪瘟的实验室诊断和猪瘟疫苗弱毒检测提供技术标准，有助于猪瘟疫病的确诊和猪瘟兔化弱毒脾淋苗及猪瘟细胞苗生产质量的控制，为保障我省养猪业的健康发展发挥引领和示范作用。三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据（一）标准编制原则本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。（二）主要技术内容和确定依据本文件确立了猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR鉴别方法技术规范。技术内容和确定依据如下。主要技术内容确定依据鉴别检测结果判定SYBRGreenⅠ荧光染料法工作原理及DNA序列的差异可产生不同的Tm值特异性兽医诊断制品注册分类及注册资料要求（中华人民共和国农业部公告第2335号）敏感性可重复性符合率主要研究结果如下：1.引物设计及合成对GenBank中公布的Shimen株、HCLV株、Alfort株、Brescia株等25株CSFV的基因组全序列进行比较分析，设计4条引物（见表1），方法建立用的试验样品为市售商品化猪瘟兔化弱毒疫苗及含有猪瘟强毒株扩增目的基因的阳性DNA质粒。表1标准所用引物名称和序列引物名称引物序列（5′—3′）猪瘟疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT猪瘟疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT猪瘟强毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT猪瘟强毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA注：引物由生物公司合成，用DEPC水溶解并稀释至100μmol/L后，-20℃保存备用；根据需要配制10μmol/L工作液，-20℃保存供检测使用。2.样品总核酸的制备用商品化试剂盒进行猪瘟弱毒疫苗及带有猪瘟强毒扩增目的基因核酸溶液进行猪瘟样品总核酸的制备。3.SYBRGreenΙ荧光RT-PCR反应体系荧光定量PCR扩增体系见下表2和3。表2猪瘟疫苗弱毒荧光RT-PCR反应体系试剂加入量/个反应2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μLExTaqHS（5U/µL）0.5μL猪瘟疫苗弱毒上游引物1.0μL猪瘟疫苗弱毒下游引物1.0μLRNaseFreedH2O7.5μL检测样品RNA溶液2.0μL总体积25.0μL表3猪瘟强毒荧光RT-PCR反应体系试剂加入量/个反应2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μLExTaqHS（5U/µL）0.5μL猪瘟强毒上游引物1.0μL猪瘟强毒下游引物1.0μLRNaseFreedH2O7.5μL检测样品RNA溶液2.0μL总体积25.0μL4.反应程序中退火温度的优化42℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，(52-60)℃退火10s，72℃延伸20s，72℃时收集荧光（40个循环）；溶解曲线分析，60℃1min，以0.1℃/s的速率升温，直到97℃，整个过程连续采集荧光，最后40℃冷却，绘制扩增产物的熔解曲线。5.结果判定依据猪瘟疫苗弱毒、猪瘟强毒及阴性对照Ct数值、熔解曲线及溶解峰的情况，确定反应程序中最优的退火温度为55℃，并在此最优程序下确定结果判定标准。5.1猪瘟疫苗弱毒检测结果判定5.1.1若检测样品无Ct值并且无典型的扩增曲线，但熔解曲线Tm值为（81.5±0.5）℃未出现熔解峰，则判为猪瘟疫苗弱毒阴性（见图1）。5.1.2若检测样品Ct值≤30.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值为（81.5±0.5）℃出现熔解峰，则判为猪瘟疫苗弱毒核酸阳性。5.1.3若检测样品30.0＜Ct值≤35.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值为（81.5±0.5）℃出现熔解峰，则判为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为猪瘟疫苗弱毒核酸阳性，否则为阴性。5.2猪瘟强毒检测结果判定5.2.1若检测样品无Ct值并且无典型的扩增曲线；或有Ct值，并出现扩增曲线，但熔解曲线Tm值为（83.3±0.9）℃未出现熔解峰，则判为猪瘟强毒阴性（见图2）。5.2.2若检测样品Ct值≤30.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值在（83.3±0.9）℃出现熔解峰，则判为猪瘟强毒核酸阳性。5.2.3若检测样品30.0＜Ct值≤35.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值在（83.3±0.9）℃出现熔解峰，则判为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为猪瘟强毒核酸阳性，否则为阴性。图1猪瘟疫苗弱毒熔解曲线分析1为猪瘟疫苗弱毒；2为猪瘟强毒；3为阴性对照。图2猪瘟强毒熔解曲线分析1为猪瘟强毒；2为猪瘟疫苗弱毒；3为阴性对照。6.特异性实验以最优反应体系分别扩增猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株、已知猪瘟强毒株的RNA以及BVDV、PRV、PPV、PCV2、PRRSV基因组，均无特异峰值出现，表明本方法具有较好的特异性（如图3和图4所示）。图3猪瘟疫苗弱毒检测方法特异性分析图4猪瘟强毒检测方法特异性分析7.敏感性实验以10倍系列稀释的含有猪瘟疫苗弱毒与猪瘟强毒目的基因的质粒为模板，进行荧光定量RT-PCR扩增，结果表明将模板稀释10000倍后仍能得到特异性扩增，经计算均为在(1-10)X101拷贝/μL（如图5和图6所示）。图5猪瘟疫苗弱毒检测方法敏感性分析图6猪瘟强毒检测方法敏感性分析8.可重复性委托5家单位，依据《动物疫病鉴别检测技术第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒》标准征求意见稿，对送检的猪瘟活疫苗、含有猪瘟弱毒的兔脾脏组织，猪瘟强毒核酸物质进行复核验证。五家单位复核验证结果表明：经复核验证，标准文本中鉴别检测技术敏感、特异，具有很好的可重复性，可有效检测鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒。9.与商品化试剂盒检测结果符合率用该方法对各地送检的24份猪瘟病料进行检测，熔解曲线分析显示有10份样品属于强毒，12份样品属于疫苗弱毒，2份样品结果不明确，与深圳市康百得生物科技有限公司的猪瘟病毒RT-nPCR检测试剂盒的符合率为91.67%。10.采样、运输与保存采集猪扁桃体、猪和兔（脾脏、淋巴结、肾脏、肺脏、盲肠）等组织器官样品、猪全血样品、猪排泄物样品、细胞培养物等样品按2%（V/V）加入5×105.0个兔感染量/mL猪瘟兔化弱毒，分装成若干份，分别存放于2℃～8℃、-20℃及-70℃条件,不同时间取出进行样品处理、核酸提取及扩增，评价不同保存条件对检测样品的影响，检测结果见表4。样品进行核酸提取前做如下处理：1）组织样品：样品加入5倍体积4℃预冷的DEPC水，充分2）排泄物样品：4℃、10000r/min离心5min，取上清液0.5mL转入离心管中编号备用。3）细胞培养物：10000r/min离心5min，取上清液0.5mL转入离心管中编号备用。4）全血样品：全血样品直接用做核酸提取。表4不同保存条件下检测Ct值一览表组织样品全血样品排泄物样品细胞培养物6ha：25.36±0.132;b:(-)；c:(-)12ha：25.21±0.186;b:(-)；c:(-)24ha：26.35±0.385;b:(-)；c:(-)36ha：28.26±0.525;b:(-)；c:(-)15da：(-);b:25.28±0.252；c:(-)30da：(-);b:25.52±0.275；c:(-)45da：(-);b:25.28±0.252；c:(-)60da：(-);b:25.42±0.378；c:(-)75da：(-);b:25.89±0.259；c:(-)90da：(-);b:26.22±0.132；c:(-)105da：(-);b:28.45±0.652；c:(-)120da：(-);b:(-)；c:25.48±0.158180da：(-);b:(-)；c:25.35±0.189360da：(-);b:(-)；c:25.85±0.145注：“-”表示未进行检测。a表示采集的样品在2℃～8℃条件下保存；b表示采集的样品在-20℃保存；c表示采集的样品在-70℃保存。依据在不同保存条件下，样品检测Ct数值的变化，在2℃～8℃条件下保存24h后及在-20℃保存3个月后，检测数值发生了较大变化，病毒含量较低样本会导致假阴性结果的出现；基于此，标准文本中规定了采集的样品在2℃～8℃条件下保存，时间不超过24h；-20℃条件下保存不超过3个月。-70℃保存条件下样品，在保存360天进行检