间充质干细胞的分离培养、三系分化与鉴定-操作指南

操作指南间充质干细胞的分离培养、三系分化与鉴定间充质干细胞的分离脂肪MSC分离培养

骨髓MSC分离培养人脐带MSC分离培养间充质干细胞的扩增MSC细胞复苏

MSC细胞传代

MSC细胞冻存间充质干细胞的三系分化MSC的成骨分化

MSC的成脂分化

MSC的成软骨分化间充质干细胞的鉴定标志物MSC表面标志物流式细胞术鉴定P/

01040507间充质干细胞的分离培养︑三系分化与鉴定目录P/P/P/获取

脂肪组织消化酶震荡消化PBS清洗离心过滤接种SVF：脂肪血管基质组分(Stromal

vascular

fraction,SVF),主要包含脂肪间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞等。酶消化法分离脂肪MSC间充质干细胞的分离脂肪MSC分离培养小鼠脂肪组织获取1.3天龄到4周龄(推荐小周龄)小鼠，颈椎脱臼法处死后于75%酒精浸泡10min。2.将小鼠横向，背面朝上放置，背部中心竖向剪开皮肤1cm；沿着开口处撕去腹股沟皮肤，暴露对称的腹股沟部位白色脂肪组织，钝性剥离。脂肪MSC分离培养(酶消化法)消化：取脂肪组织25mL，4℃PBS冲洗3次，去除筋膜及红细胞，眼科剪剪碎，4℃PBS冲洗3次，每5mL脂肪分装入50mL离心管，加入2倍体积的0.075%I型胶原酶，37℃恒温摇床以80r/min的摇速震荡消化1h，待充分消化后，加入与酶等体积的含10%FBS的DMEM-F12完全培养基终止消化。离心与计数：300g，离心10min，去除上层未消化的脂肪组织、油脂及中层清液，5mL红细胞裂解液重悬沉淀，室温静置5min，200g，离心5min，去除上清液，完全培养基重悬沉淀，200目筛网过滤后，取样计数，根据计数结果调整细胞浓度，最终以(1-5)×104/cm2接种于培养皿中，置于37℃，5%CO培养箱中培养。2接种培养：48h后首次换液，之后每3d换一次液，待细胞生长至80%-90%融合时，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化后按1:2传代培养。间充质干细胞的分离、扩增和三系分化间充质干细胞（MSC）是一种源自中胚层的多能干细胞，能够从骨髓、脂肪、脐带、胎盘、脐血、皮肤等多样的组织里分离获取，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，不仅能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，还能分化为肌细胞、肝细胞、胰岛细胞等多种细胞类型。间充质干细胞在组织工程、基因治疗和免疫治疗等诸多方面展现出巨大的应用前景，为医学领域带来了新的希望和突破方向，对于多种疾病的治疗和研究都有着重要意义。SVF

1小鼠骨髓MSC分离培养(全骨髓法、骨片法）选取2-3周龄的4-6只小鼠，颈椎脱臼法处死后于75%乙醇浸泡5min，剪开腹股沟区域皮肤，沿着开口向下拉剥脱表皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织，放置于含有PBS的无菌培养皿中，冲洗

3次。剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔，10mL注射器抽取骨髓间质干细胞培养基反复冲洗骨髓腔直至骨头发白。全骨髓法：收集骨髓悬液置于离心管中，4℃200g离心5min，培养基重悬，调整细胞浓度以1×106cells/mL接种至T25培养瓶当中，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，24h后初次换液，48h、72h分别轻柔换液，接下来根据细胞生长状态，约每2-4天换液一次，待贴壁细胞达到80%~90%融合后，按1:2比例传代。骨片法：(1)将冲去骨髓的股/胫骨剪为1-3mm3的碎片，用含有1.0mg/mlⅡ型胶原酶的完全培养基(含5%FBS)在37℃摇床中以200rpm振荡消化1-2h。当骨碎片松散时停止消化，弃去上清消化液，用完全培养基冲洗3次，然后将骨碎片接种于培养皿中，加入适量新鲜的完全培养基(含10%FBS)淹没骨碎片，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。每2-3d换一次液，待贴壁细胞达到80%~90%融合，用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%)进行消化，按1:3比例进行传代培养。骨髓MSC分离培养人骨髓MSC分离培养(密度梯度离心法）1.无菌条件下抽取骨髓液5mL(抽取的骨髓放入含抗凝剂的采血管内，采集后24h内进行实验)，加等量PBS稀释混匀，300g离心10min，弃去脂肪层，将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液

(1.077g/mL)上面，800g离心30min。2.小心吸取界面白膜状层的单个核细胞，加2倍体积PBS混悬，300g离心10min，弃上清并重复洗涤2次。3.BMSCs完全培养基重悬细胞，以2×105/mL的密度接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，3d后首次换液去除悬浮细胞，之后每2-3天换液一次，观察细胞形态及生长变化，待细胞生长达80%-90%融合时(约12d)，用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%)进行消化，按1:2比例进行传代培养。参考文献doi:10.1038/nprot.2009.238

doi:10.1007/978-1-4939-3584-0_1稀释骨髓液分离液离心前血浆

BMMNC分离液

红细胞等离心后

2骨髓MSC的分离培养人脐带MSC分离培养（组织块贴壁法）1.无菌取新鲜脐带约10cm，放入培养皿中，用含双抗的PBS浸泡清洗3次，去除血液，使用镊子沿脐带外表向两边刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，将脐带组织剪成2cm左右的小段。2.将每段脐带用眼科剪纵向剖开，剔除血管(1条脐静脉，2条脐动脉)，直接将剩余脐带组织剪成大小约2mm3的组织块，或剥离其中的凝胶状组织(华通氏胶)剪成肉糜状放入离心管中。3.脐带组织：将组织块均匀散布在培养皿中(组织块间距0.5cm)，每个组织块轻柔滴加一滴MSC培养基，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养，2h后轻柔沿培养皿侧壁补充培养基。华通氏胶：离心管中加入MSC培养基，将组织块均匀的重悬在完全培养基中，然后接种到培养皿中，轻轻摇晃培养皿，使组织块均匀分布，然后放置于37

℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养。4.1-3d观察细胞生长情况，7d后首次换液，此后3～4d换液1次。当细胞达到80%-90%融合度时(约12-15d)，用胰酶消化传代，将组织转移到一个新的培养皿中，可按上述方法继续培养。脐动脉umbilical

arteries脐带血umbilical

cord

blood脐静脉umbilical

vein华通胶

Wharton’s

Jelly脐带结构脐带组织培养华通氏胶培养

3间充质干细胞的扩增MSC细胞复苏液氮中取出冻存的MSC细胞，迅速放入37℃水浴当中，及时观察，当细胞基本解冻后，要迅速将冻存管从水浴中取出。使用移液管将冻存管中的全部内容物轻轻吸移到无菌的15mL离心管中。缓慢滴加预热至37°C的间充质干细胞培养基(勿将培养基一次性迅速加到离心管中。由于渗透压冲击，这样做可能导致细胞活力降低)，缓慢上下吹吸两次以轻混细胞悬液。将离心管以100~200g，离心5min，吸弃上清；加入间充质干细胞培养基重悬，调整细胞密度以5,000-6,000个细胞/cm2接种于培养瓶中，放置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养。每2~3天更换一次培养基，当细胞达到约80％-90%的融合时，进行传代。MSC细胞传代吸弃培养瓶中的培养基，使用不含钙镁离子的DPBS清洗细胞，吸弃DPBS，加入适量37°C预热的胰蛋白酶(例:T25培养瓶约3mL)，37℃孵育，直至细胞完全解离(约3‒5分钟)。加入培养基，轻轻上下吹吸，使细胞分散为单细胞悬液，收集液体至离心管当中。 100~200g，离心5分钟,吸弃上清，培养基重悬沉淀，调整细胞密度以5,000-6,000个细胞/cm2接种于培养瓶中，每2~3天更换一次培养基。当MSC生长缓慢时，建议添加一些细胞因子促进MSC的生长例如:20ng/mL

EGF(cat#:10605-HNAE/50482-MNCH)、20ng/mL

FGF2

(cat#:10014-HNAE/50037-M07E)、10ng/mLPDGF-BB

(cat#:10572-HNAE)、10ng/mL

TGF-β

(cat#:10804-HNAC)MSC细胞冻存制备细胞冻存液：1mL冻存液配方为0.9mLMSC培养基加0.1mL二甲基亚砜(DMSO)(最终浓度10%） 将收获的细胞沉淀(推荐细胞冻存密度在2×106

个/mL)使用1mL细胞冻存液重悬，轻轻吹吸混匀，确保细胞分布均匀，加入到4°C预冷的冻存管中。将细胞冻存管放入含有异丙醇的冻存盒中，置于-20℃冰箱2h，于-80℃冰箱中过夜，然后取出冻存管移入液氮容器内储存。

4准备0.1%明胶包被的细胞培养皿（培养皿加适量明胶包被液，覆盖孔板底部即可，孵育30min，吸弃包被液），准备诱导成骨分化完全培养基（α-MEM，10%

FBS，1%

P/S，0.05mM抗坏血酸，10mM

β-甘油磷酸钠，100nM地塞米松)。取细胞融合达85%左右的MSC，用胰蛋白酶消化，细胞解离后，加入MSC完全培养基停止消化，300g离心5min。 调整细胞密度以5×103cells/cm2接种于处理后的6孔板当中，每孔加入2mLMSC完全培养基，当细胞融合度达到60%时，用诱导成骨分化完全培养基代替MSC完全培养基，开始进行成骨分化，同时，在标准完全培养基中（α-MEM，10%

FBS）培养未分化的MSC作为对照。37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养细胞2-4周。每周更换两次成骨培养基。ALP碱性磷酸酶染色：在成骨诱导后的第7天，使用碱性磷酸酶试剂盒评估细胞的ALP活性。茜素红染色：在成骨诱导后的第21天，吸弃孔板内的诱导成骨分化完全培养基，PBS清洗1-2次，加入4%多聚甲醛溶液(覆盖细胞表面即可)，固定细胞30min，吸弃固定液，PBS清洗1-2次，加入适量茜素红工作液（覆盖细胞表面即可），室温下染色

5-10分钟，吸弃染色液，PBS清洗1-2次，显微镜下观察成骨染色效果。MSC的成脂分化准备0.1%明胶包被的细胞培养皿（培养皿加适量明胶包被液，覆盖孔板底部即可，孵育30min，吸弃包被液），准备诱导成脂分化培养基A（高糖DMEM，10%FBS，1%P/S，1μM地塞米松，0.5mM

IBMX，100μM吲哚美辛，10μg/mL胰岛素）以及诱导成脂分化培养基B（高糖DMEM，10%FBS，1%P/S，10μg/mL胰岛素）。取细胞融合达85%左右的MSC，用胰蛋白酶消化，细胞解离后，加入完全培养基停止消化，300g离心5

min。间充质干细胞的三系分化MSC的成骨分化茜素红染色参考100μm100μm100μm骨髓-间充质干细胞DOI

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10.3389/fbioe.2023.1152207脂肪-间充质干细胞DOI

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10.3389/fbioe.2023.1152207脐带-间充质干细胞

DOI:

10.1111/jdi.14077

5调整细胞密度以2-3×104

cells/cm2接种于处理后的6孔板当中，每孔加入2mL MSC完全培养基，当细胞融合度达到90-100%时（细胞过饱和情况更利于进行成脂分化），用诱导成脂分化培养基A代替生长培养基，开始进行成脂分化，诱导2天后，吸弃培养基，加入诱导成脂分化培养基B，诱导1天，继续换为A液进行诱导，如此交替循环培养至14天，进行细胞形态学观察，出现足量、大小适宜的脂滴后，进行油红O染色。油红O染色：取油红O干粉0.5g加入到100mL异丙醇中，充分溶解，避光密封4℃保存,为储存液，取储存液与蒸馏水以3：2比例混匀，定性滤纸过滤，避免沉淀，取滤液作为工作液。吸弃培养基，PBS清洗1-2次，加入4%多聚甲醛溶液(覆盖细胞表面即可)，固定细胞30min，吸弃固定液，PBS清洗1-2次，加入适量油红O工作液（以六孔板为例，每孔1mL），染色15-30min，吸弃染液，PBS/蒸馏水清洗3次，显微镜下观察成脂染色效果。油红O染色参考MSC的成软骨分化准备诱导成软骨分化培养基（高糖DMEM，20ng/ml

TGF-β3(cat#:10434-H01H)，100nM地塞米松,1%ITS，50μg/ml抗坏血酸,1mM丙酮酸钠,40μg/ml脯氨酸）取细胞融合度达80-90%的MSC，用胰蛋白酶消化，细胞解离后，加入完全培养基停止消化，取3-4×105个MSC细胞转移到15mL离心管中，200g离心5min。吸弃上清，沿着离心管壁轻柔加入2mL诱导成软骨分化培养基（务必确保细胞不被吹散，如细胞吹散，需要再次离心沉淀），小心地将离心管盖半旋拧松，便于气体交换，放入37℃，5%CO2

培养箱中培养。静置培养24-48h后，轻弹离心管底部，使球形的细胞团块脱壁悬浮在培养基中，轻柔更换分化培养基，放入37℃，5%

CO2培养箱中培养，此后每2-3天更换新鲜的分化培养基，每日早晚轻弹离心管底部，使软骨球更趋于圆球状。软骨球在诱导过程中直径逐渐变大，表面变得光滑呈胶质，持续诱导14-24d后，软骨球直径达到1.5-2mm，即可固定、切片和用番红-O、阿尔新蓝或抗体染色以鉴定软骨细胞。阿利辛蓝染色：软骨球用PBS轻柔清洗1-2次，中性甲醛或福尔马林固定后，经石蜡包埋切片，将石蜡切片脱蜡，阿利辛蓝染液浸染30min，自来水流水冲洗2min，蒸馏水冲洗30s，终止染色，显微镜下观察染色情况。骨髓-间充质干细胞DOI

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10.3389/fbioe.2023.1152207脂肪-间充质干细胞DOI

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10.3389/fbioe.2023.1152207脐带-间充质干细胞

DOI:

10.1111/jdi.14077100μm50μm100μm

6/web2024/msc18.png/web2024/msc32.jpg/web2024/msc33.jpg/web2024/msc4.png阿利辛蓝染色参考表1.MSC鉴定标志物骨髓-间充质干细胞DOI

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10.3389/fbioe.2023.1152207脂肪-间充质干细胞DOI

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10.3389/fbioe.2023.1152207脐带-间充质干细胞DOI:

10.1155/2022/9124277100μm100μm100μm

7间充质干细胞的鉴定标志物MSC表面标志物为确保间充质干细胞的质量和一致性，国际细胞治疗协会（ISCT）制定了一套严格的体外培养细胞标准：（1）贴壁培养；（2）表达一系列特定的细胞表面标志物（表1）；（3）具备体外三系分化的能力。临床用MSC根据《临床研究用人间充质干细胞质量检验规范（征求意见稿）》的建议需加测CD44、CD166（表2）。靶点货号HMSC03HMSC07MSC阳性标志物（≥95%）CD10510149-MM13-A√√CD7310904-MM07-P√√CD9016897-MM10-C√√CD4510086-MM05-F√√MSC阴性标志物（≤2%）CD3468035-XM01-F√√CD14

or

CD11b10073-MM06-F√√CD79α

or

CD1911880-MM17-F√√HLA-DR68038-XM01-F√√靶点货号HMSC03HMSC07MSC阳性标志物（≥95%）CD4412211-MM02-F√√CD16610045-MM03-A√Cultured

hMSCs

from

umbilical

cord

are

analyzed

by

MSC07.

Cells

demonstrate

negative

expression

of

CD45,

CD34,

CD14,

CD19,

HLA-DR(figure

A)

as

well

as

positive

expression

of

CD73

(Figure

B),

CD90

(Figure

C),

CD105

(Figure

D),

CD44

(Figure

E),

CD166

(Figure

F).

The

bluelinesare

cellswith

isotypeantibodies

(tube

6).

The

redlinesarecells

withantibodies

targeting

tomarker

(tube

5).流式细胞术鉴定义翘神州提供两款专门用于鉴定人间充质干细胞的试剂盒（Cat#:HMSC03

，Cat#:HMSC07），检项全面，简便易用，检测结果精准可靠。以下为使用流式细胞术鉴定间充质干细胞的具体操作流程。取细胞融合率90%左右的MSCs，弃培养基，PBS清洗三次，用胰蛋白酶消化，细胞解离后，加入完全培养基停止消化，300g离心5min。以1×107

~2×107

cells/mL的浓度重悬细胞，每个试管分别加入50μL细胞悬液。以HMSC07试剂盒为例，准备8个试管，每种抗体加20μL，轻柔混