药物分析讲稿-第十二章-甾体激素类药物的分析

药物分析讲稿-第十二章甾体激素类药物的分析第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松第十二章甾体激素类药物的分析第一节基本结构与分类甾体激素类药物是一类具有甾体结构的激素类药物，是临床上一类较为重要的药物。甾体激素类药物种类较多，但基本骨架相同，均具有环戊烷并多氢菲的母核。其基本骨架及位次编号如下:甾体激素类药物主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类，性激素又分为雌性激素、雄性激素和蛋白同化激素及孕激素等。一、甾体激素类药物的类型及结构特征大多数甾体激素类药物是由雌性激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素及肾上腺皮质激素的基本结构衍生而来的。(一)雌性激素天然的雌性激素为雌二醇，结构如下:对雌二醇进行结构改造，得到一系列高效、长效的雌激素类药物。《中国药典》收载的雌激素类药物有雌二醇(estradiol)、炔雌醇(ethinylestradiol)、炔雌醚(quinestrol)、戊酸雌二醇(estradiolvalemte)、苯甲酸雌二醇(estradiolbenzoate)等。雌激素类药物的母核有18个碳原子，A环为苯环，C3位上有酚羟基，C17位上有β-羟基，有些药物的C17-羟基形成了酯，有的药物C17位上有乙炔基(如炔雌醇)。(二)雄性激素和蛋白同化激素天然的雄性激素为睾酮。结构如下:雄性激素类药物的母核有19个碳原子，蛋白同化激素在C10位上一般无角甲基，其母核只有18个碳原子。A环上有?4-3-酮基，形成共轭体系，具有紫外吸收;C17位有β-羟基或由它们形成的酯(如丙酸睾酮)。《中国药典》收载的该类药物有丙酸睾酮(testosteronepropionate)、甲睾酮(methyl-testosterone)、苯丙酸诺龙(rmndrolonephenylpropionate)等。第1页共9页第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松(三)孕激素天然的孕激素为黄体酮，结构如下:孕激素类药物的母核有21个碳原子，A环有?4-3-酮基;C17位有甲酮基;有的药物C17位有α-羟基或与酸形成的酯，还有的具有乙炔基。《中国药典》收载的孕激素及口服避孕药有黄体酮(progesterone)、炔诺酮(norethisterone)、炔诺孕酮(norgestrel)、醋酸氯地孕酮(chlonnadinonlacetate)和醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)等。(四)肾上腺皮质激素天然的肾上腺皮质激素(简称皮质激素)为氢化可的松，基本结构如下:第2页共9页第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松肾上腺皮质激素类药物的母核有21个碳原子;A环上有?4-3-酮基，为共轭体系，具有紫外吸收;C17位上有α-醇酮基，具有还原性;有的药物C17位上还有α-羟基;部分药物C11位有羟基和酮基，C1、C2之间有双键，6α或9α位有卤素取代或有C16-α-羟基等。《中国药典》收载的肾上腺皮质激素类药物有氢化可的松(hydrocorfisone)、醋酸泼尼松(prednisoneacetate)、醋酸地塞米松(dexamethasoneacetate)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、地塞米松磷酸钠(dexamethasonesodiumphosphate)、倍他米松(betamethasone)等。二、特征官能团与分析方法第二节鉴别试验甾体激素类药物的鉴别试验，主要是根据甾体母核和各种官能团的特征反应进行。常用的鉴别方法有呈色反应、沉淀反应、制备衍生物测定熔点、水解产物的反应、紫外分光光度法、红外分光光度法、薄层色谱法及高效液相色谱法等。一、呈色反应(一)与强酸的呈色反应许多甾体激素类药物能与硫酸、盐酸、高氯酸、磷酸等强酸反应呈色。其中以与硫酸的呈色反应应用-较为广泛。此反应为甾酮和硫酸的反应，反应机理为酮基先质子化，形成正碳离子，再与HS04作用呈色。《中国药典》收载的某些甾体激素类药物与硫酸的呈色反应和荧光现象以及加水稀释后的变化情况见表12-1。甾体激素类药物与硫酸的呈色反应，操作简便，反应灵敏。不同的药物可形成不同的颜色或荧光而能第3页共9页第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松相互区别，目前为各国药典所采用。(二)官能团的呈色反应不同的甾体激素类药物具有不同的官能团，利用官能团的显色反应可以区别不同的药物。1、羰基的呈色反应本类药物结构中C3-酮基和C20-酮基能与某些羰基试剂如2，4-二硝基苯肼、硫酸苯肼、异烟肼等发生缩合反应，形成黄色的腙而用于鉴别。具有?4-3-酮结构的甾体激素类药物可立刻反应;具有?1，4-3-酮结构的甾体激素类药物反应需l,3min;具有C20-酮基的甾体激素类药物反应需更长时间。2、C17-α-醇酮基的呈色反应肾上腺皮质激素药物分子结构中C17位上有α-醇酮基，具有还原性。能与碱性酒石酸铜试液(斐林试剂)、氨制硝酸银试液(多伦试剂)以及四氮唑盐(即氯化三苯四氮唑)反应而呈色。四氮唑盐具有氧化性，与C17-α-醇酮基反应后被还原为有色的甲而显色。此显色反应广泛应用于皮质激素的分析。3、甲酮基的呈色反应甾体激素类药物分子结构中含有甲酮基以及活泼亚甲基时，能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基苯、芳香醛等反应呈色。其中与亚硝基铁氰化钠的反应是黄体酮的灵敏、专属的鉴别方法。在一定条件下，黄体酮显蓝紫色，其他甾体激素类药物均不显蓝紫色，而显淡橙色或不显色。4、酚羟基的呈色反应雌激素类药物C3位为酚羟基时，可与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮染料。二、沉淀反应(一)与碱性酒石酸铜(斐林试剂)的沉淀反应肾上腺皮质激素类药物C17位上的α-醇酮基具有还原性，与斐林试剂能生成橙红色的氧化亚铜沉淀。如醋酸泼尼松龙的鉴别方法为:取本品20mg，加甲醇lml，温热溶解后，加热的碱性酒石酸铜试液lml反应，即生成橙红色沉淀。(二)与氨制硝酸银(多伦试剂)的沉淀反应肾上腺皮激素类药物C17位上的α-醇酮基具有还原性，能与氨制硝酸银反应生成黑色单质银的沉淀。如醋酸去氧皮质酮的鉴别反应为:取本品5mg，加乙醇5ml溶解后，加氨制硝酸银试液0.5ml，即生成黑色沉淀。(三)与硝酸银的沉淀反应含有炔基的甾体激素类药物，遇硝酸银试液，即生成白色的炔银盐沉淀。如炔雌醇的鉴别方法为:取本品10mg，加乙醇lml溶解后，加硝酸银试液5,6滴，即生成白色沉淀。第4页共9页第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松六、红外分光光度法甾体激素类药物结构复杂，有的药物之间结构仅有细小的差异，仅靠化学鉴别法难以区别。红外光谱特征性强，为鉴别本类药物提供了有效而可靠的手段。目前，各国药典收载的甾体激素原料药，几乎都采用红外分光光度法作为鉴别方法。《中国药典》采用此法鉴别黄体酮、炔雌醇、炔诺酮、炔诺孕酮、苯丙(药品红外光谱集)一致。如炔酸诺龙和地塞米松等药物。药典规定供试品的红外吸收图谱应与对照的图谱雌醇的红外吸收光谱图，见图12-1。第三节特殊杂质检查甾体激素类药物多由其他甾体化合物经结构改造而制得，因而在制备过程中可能会引入原料、中间体、异构体、降解产物以及溶剂和试剂等杂质。在甾体激素类药物的检查项下，除一般杂质的检查外，还需检查其特殊杂质“有关物质”的限量。此外，根据药物在生产和贮存过程中可能引入的杂质，有些甾体激素还规定有游离磷酸盐、甲醇和丙酮、雌酮、硒、乙炔基等其他检查项目。如地塞米松磷酸钠检查游离磷酸盐、甲醇和丙酮;炔雌醇、炔诺孕酮检查乙炔基;曲安奈德、醋酸地塞米松检查硒;炔雌醇检查雌酮等。一、有关物质有关物质是本类药物中存在的具有甾体结构的其他物质，可能是合成的原料、中间体、副产物以及降解产物，是多数甾体激素类药物中的主要特殊杂质。各国药典普遍采用薄层色谱法和高效液相色谱法检查甾体激素类药物中的有关物质。(一)薄层色谱法《中国药典》利用薄层色谱法检查有关物质。一般采用主成分自身对照法(高低浓度对照法)。即将供试品制成高、低二种浓度的溶液，高浓度溶液作为供试溶液，低浓度溶液作为对照溶液。利用供试溶液图谱中杂质斑点的数目和颜色与对照溶液图谱的主斑点进行比较，通过杂质斑点总数和各单一杂质的量进行控制。举例如下:例12-2醋酸泼尼松龙中有关物质的检查取本品，加三氯甲烷-甲醇(9:1)制成每lml中约含4mg的溶液，作为供试品溶液;精密量取3ml，置100ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(9:1)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385:60:15:2)为展开剂，展开，晾干，在105?干燥10min，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。3ml，4mg/ml低浓度液体的含量,,0.12mg/ml100ml第5页共9页第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松0.12低浓度液体相当于高浓度液体的3,(),，100%,3%4例如:盐酸异丙嗪中有关物质的检查。有多个杂质而且结构不清。供试溶液10mg/ml，对照溶液(1)0.15mg/ml，(2)0.05mg/ml。要求:供试液杂质斑点不多于3个;杂质斑点与对照(2)的主斑点比较，不得更深;如有一点超过，应不深于对照液(2)的主斑点。例12-3醋酸氟轻松中有关物质的检查供试品溶液;精密量取lml，取本品，加三氯甲烷-甲醇(9:1)溶解并制成每lml中约含3mg的溶液，作为置50ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(9:1)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述ul，分别点于同一硅胶G薄层板上;以三氯甲烷-甲醇(97:3)为展开剂，展开，晾干，在105?两种溶液各5干燥10min，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。1ml，3mg/ml低浓度液体的含量,,0.06mg/ml50ml0.06低浓度液体相当于高浓度液体的2,(),，100%,2%3(二)高效液相色谱法用高效液相色谱法检查有关物质，一般采用主成分自身对照法，即采用供试品溶液的稀释液作为对照，以对照液主峰的面积作为参比，以控制药物中杂质的量。例12-4丙酸睾酮中有关物质的检查《中国药典》收载的丙酸睾酮中有关物质的检查方法为:取本品，加甲醇分别制成每lml含lmg的供试品溶液与每lml含0.01mg的对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10ul注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高达记录仪满量程的20,。再精密量取供试品溶液与对照品溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的2倍。供试品溶液如显示杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积。例12-5醋酸可的松中有关物质的检查醋酸可的松中有关物质的检查方法为:取本品，用乙腈制成每lml中约含lmg的溶液，作为供试品溶液;精密量取lml，置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20ul注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高达记录仪的满量程的50,。再精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。供试品溶液如显示杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍。二、游离磷酸盐游离磷酸盐是甾体激素类药物在生产过程中，由磷酸酯化时残存的过量磷酸盐。采用钼蓝比色法检查。本法是利用在酸性溶液中磷酸盐与钼酸铵作用，生成磷钼酸铵，再经还原形成磷钼酸蓝(钼蓝)在740nm波长处有最大吸收。例12-6地塞米松磷酸钠中游离磷酸盐的检查《中国药典》收载的地塞米松磷酸钠中游离磷酸盐的检查方法为:精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml使溶解;另取标准磷酸盐溶液4.0ml，置另一25ml量瓶中，加水11ml;各精密加钼酸铵硫酸试液2(5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液lml，加水至刻度，摇匀，在20?放置30,50min。照分光光度法，在740nm波长处测定吸光度。供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度。三、甲醇和丙酮某些甾体激素类药物在生产工艺中使用大量的甲醇与丙酮。甲醇对人体有害，因此药典规定作甲醇与第6页共9页第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松丙酮残留量检查。《中国药典》采用气相色谱法检查，规定采用气相色谱法测定时不得出现甲醇峰，该法测定甲醇时检测限为3.1ng。丙酮则采用外标法测定，规定不得过5.0,(g/g)。五、雌酮以JP(13)收载的炔雌醇中的雌酮的检查为例，检查方法为:取本品5mg，溶于0.5ml乙醇，加间二硝基苯0.05g，再加新配制的稀氢氧化钾-乙醇液0.5ml，在暗处放置1h后，再加乙醇10ml，溶液呈现的颜色不得比对照液(不加本品同样方法制成)更深。第四节含量测定根据甾体激素类药物的官能团和整个分子结构特征，可采用比色法、紫外-可见分光光度法、荧光法、气相色谱法和高效液相色谱法测定其含量。二、紫外-可见分光光度法(二)四氮唑比色法1、四氮唑的种类两种:2，3，5-三苯基氯化四氮唑(缩写为TTC)，其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲，λmax红四氮唑(缩写为RT)。蓝四氮唑(缩写BT)，其还原产物为暗蓝色的双甲，λmax在480~490nm，也称在525nm左右。2、反应原理肾上腺皮质激素C17-α-醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲。生成的颜色随所用试剂和条件的不同而定，多为红色或蓝色。3、测定方法USP(23)采用蓝四氮唑;中国药典(1995版)和BP(1993)采用红四氮唑。4、影响因素四氮唑比色法广泛用于肾上腺皮质激素类药物的含量测定，但测定时的各种因素如肾上腺皮质激素的结构、溶剂和水分、反应温度和时间、碱的浓度、空气中氧及光线等，对形成有色甲的反应速度、呈色强度、稳定性都有影响。因此，应严格控制实验条件，才能获得满意的结果。(1)取代基的影响一般认为，C11-酮基比C11-羟基的甾体激素类药物反应速度快;C21-羟基酯化后比其未酯化的母体羟基的反应速度慢;当酯化的基团是三甲基醋酸酯、磷酸酯、琥珀酸酯时，反应速度更慢。(2)溶剂和水分的影响含水量大时会使呈色速度减慢，但含水量不超过5,时，对结果几乎无影响。因此可采用95,的乙醇。为了减少整个反应液中水分的含量，则采用无水乙醇。另外，醛具有一定还原性，会使吸光度增高，故一般应采用无醛乙醇作溶剂。(3)温度和时间的影响呈色反应速度随温度增高而加快，一般以室温或30?恒温条件下显色，结果的重现性较好。《中国药典》中采用的反应条件是25?的暗处反应40min。(4)碱的种类及加入顺序的影响在各类有机碱中，以氢氧化四甲基铵最为理想，能得到满意结果，故最为常用。有人指出，当皮质激素和氢氧化四甲基铵长时间(24h)接触后，皮质激素有部分分解。因此，以先加四氮唑盐溶液再加碱液为好。用甲醇或乙醇将10,的氢氧化四甲基铵溶液稀释后再用，反应完毕后溶液中碱的浓度约为0.01mol/L。(5)空气中氧及光线的影响反应以及产物对光敏感，因此必须用避光容器并置于暗处显色，同时在达到最大呈色时间后，立即测定吸光度。氯化三苯四氮唑形成的甲对空气中氧敏感，氧能明显影响颜色强度和稳定性。因此，BP曾规定在加入试剂后要往容器中充氮气。(6)干扰物影响有些还原性物质如抗坏血酸、还原性糖、多元酚、硫醇等都能与四氮唑盐反应而引起干扰，但在甾体激素原料药及制剂的分析中不易遇到。而某些赋形剂如聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对蓝四氮唑(BT)的显色反应有较显著的干扰，山梨醇和角鲨烯也有干扰。因此，测定油膏、冷霜等制剂时应先分离后方能测定。(三)异烟肼比色法1、原理甾体激素类药物C3-酮基及某些其他位置的酮基都能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合生成黄色异烟腙，在一定波长下具有最大吸收。因此，可用比色法测定甾体激素类药物的含量。第7页共9页第十二章甾体激素类药物的分析桂林医学院药学-唐岩松某些具有两个酮基(C3-酮基和C20-酮基)的甾体激素类药物可形成双腙，如黄体酮、氢化可的松等。2、测定方法3、影响因素异烟肼比色法测定甾体激素类药物的含量，可受到各种因素的影响，如溶剂、酸的种类和浓度、水分、温度、光线和氧、反应的专属性等方面的影响。在操作中应严格控制条件，才能获得满意结果。(1)溶剂的选择只有用无水乙醇或无水甲醇作为溶剂才能得到满意的结果。其他溶剂因受到异烟肼盐酸盐在其中溶解度小的限制而不能使用。试剂在无水甲醇中的稳定性较好，呈色强度也比在乙醇中高，但由于甲醇对制剂辅料植物油的溶解度较无水乙醇小，故一般多选用乙醇。(2)酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度一般使用盐酸。当盐酸与异烟肼反应的摩尔比为2:1时可获得最大的吸光度，即按上述操作中盐酸浓度为0.0074mol/L(在1000ml醇中含0.625ml浓盐酸)，异烟肼试液(0.5mg/m1)的浓度相当于0.00365mol/L。也可以使用0.0037mol/L的硫酸，若用醋酸则需将其浓度增大到25,(V/V)，约为4.4mol/L。(3)水分、温度、光线和氧的影响当溶剂中含水量增加时，缩合产物异烟腙将发生水解，从而使吸光度降低。因为甾体激素与异烟肼缩合成腙的反应为可逆反应，水分可促使反应逆转而水解。温度升高，反应速度加快。当在具塞玻管中不致使溶剂挥发和吸收水分的情况下，光与氧不影响反应。(4)反应的专属性具有?4-3-酮基的甾体激素类药物在室温放置不到lh，即可定量与异烟肼反应;其他甾酮化合物需在长时间放置或加热后方可反应完全，如C20-酮化合物(黄体酮、可的松等)反应就较慢;C1