医药卫生行业微生物知识学习培训课件（控制菌、微生物检验、消毒、灭菌、微生物污染药品的途径）

医药

工业微生物知识目录微生物概况与药品生产相关的几类微生物几种控制菌微生物污染药品的途径消毒、灭菌工艺验证、设备验证环境检测微生物检验医药卫生行业微生物知识学习培训课件3什么是微生物？一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称(一般个体<0.1mm)。是一些个体微小、构造简单的低等生物。微生物概况原核细胞型：细菌放线菌支原体衣原体立克次氏体螺旋体等真核细胞型：霉菌酵母菌非细胞型：病毒

噬菌体

分类4微生物特性种类多分布广个体小面积大生长旺繁殖快吸收多转化快适应强异变异5微生物特性

种类多

分布广无处不在无孔不入高温高压酸性碱性已知10万种，占总量的20%，开发利用的仅占1%1g肥沃土壤含20亿个微生物，1g贫瘠土壤含3~5亿个空气8000~3500个/m3贺庆瑞6个体小

比表面积大杆菌的宽度是0.5微米，因此80个杆菌“肩并肩”地排列成横队，也只有一根头发丝的宽度物体的表面积和体积之比称为比表面积。大肠杆菌的比表面积是人的30万倍微生物特性

比表面积大，代谢速率非常快，一般细菌20min就能繁殖一代贺庆瑞7微生物特性

吸收多

转化快凡是动植物能利用的营养，微生物都能利用，大量的动植物不能利用的物质，甚至剧毒的物质，微生物照样可以视为美味佳肴大肠杆菌在合适条件下，每小时可以消耗相当于自身重量2000倍的糖，而人体则需要40年之久笑嘻嘻8适应强、易变异适应强

易变异多数细菌能耐0～－196℃的低温；在海洋深处的某些硫细菌可在250～300℃的高温条件下正常生长一些嗜盐细菌甚至能在饱和盐水中正常生活；产芽孢细菌和真菌孢子在干燥条件下能保藏几十年、几百年青霉素生产菌的发酵水平由每毫升20单位上升到近10万单位xxx9与药品生产相关的几类微生物

细菌xxx细菌XXX11细菌定义及分类细菌是一类细胞细而短、结构简单、以二等分裂方式繁殖的原核微生物，分布广泛。细菌有三种基本形态：球菌、杆菌、螺旋菌。球菌：单球菌双球菌

链球菌

四联球菌八叠球菌葡萄球菌等

分裂繁殖后，一般不会呈单个存在（CFU）XXX12细菌

细菌繁殖二分分裂繁殖是细菌最普遍、最主要的繁殖方式。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞。

XXX细菌

细菌繁殖

细菌细胞分裂的电镜超薄切片图

杆菌二分裂过程模式图XXX14细菌

G+、G-G+细菌

细胞壁厚，主要成分是肽聚糖，占细胞干重的50%~80%.革兰氏染色呈紫色细菌G-细菌

细胞壁薄，主要成分是LPS(脂多糖:脂质和多糖的复合物），有致热作用，是细菌内毒素有效成分。

革兰氏染色呈红色XXX脂质15细菌

G+、G-G+细胞壁显微结构G-细胞壁显微结构G+染色图G-染色图XXX16细菌

细菌内毒素

①水的污染：制备操作不当

水质不好细菌繁殖使灭活后存在细菌裂解物

②盛水容器

生产装置输送管道污染

③

原料含菌量过高

④灭菌工艺不合格造成灭菌不彻底

①耐热性：250℃加热30min，

②滤过性：1~5nm之间，故能通过滤器进入滤液中。

③具有水溶性及不挥发性

④能被强酸、强碱和氧化剂破坏①高温破坏法

②吸附法活性炭

③酸碱氧化法

④

离子交换法

⑤反渗透法

⑥

凝胶过滤法⑦

超滤法理化

特性污染

途径去除

方法XXX17细菌

细菌内毒素细菌内毒素（LPS）1,3-(β,D)-葡聚糖C因子被活化为活化C因子B因子被活化为活化B因子G因子被活化为活化G因子凝固酶原产生凝固酶凝固蛋白原产生凝固蛋白（凝胶）革兰氏阴性菌死亡真菌等代谢产生XXX18细菌

细菌内毒素G+和芽孢的关系、芽孢特性

耐热性强XXX19细菌

细菌内毒素G+和芽孢的关系、芽孢特性芽孢杆菌XXX20细菌

细菌的菌落单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落。

细菌的菌落特征因种而异。可作为鉴定细菌种的依据。细菌含有荚膜，形成的菌落湿润、光滑、具有光泽，黏液状，呈光滑性菌落。不含荚膜的细菌形成的菌落干燥。CFUCFU（Colony-FormingUnits)菌落形成单位，对应的是一种计数方法。例如

100CFU/ml,指的是美1ml这种液体中含的微生物可以形成100个菌落，但是并不是说明每1ml液体中含有100个菌。XXX21细菌

细菌的菌落

粘质沙雷氏菌

沙门氏菌铜绿假单孢菌

弗氏志贺氏粘质沙雷氏菌XXX22放线菌

链霉菌的一般形态和构造放线菌显微镜照片XXX23放线菌

放线菌的菌落特征A：诺尔斯氏链霉菌；B：皮疽诺卡氏菌；C：酒红指孢囊菌；D：游动放线菌；E：小单胞菌；F：皱双孢马杜拉放线菌产抗菌素的放线菌的菌落特征

A：卡特利链霉菌；B：弗氏链霉菌；C：吸水链霉菌金泪亚种；D：卡那霉素链霉菌；E：除虫链霉菌；F：生磺酸链霉菌XXX24酵母菌

酵母菌是一类单细胞、呈球形或卵圆形的真菌。自然界中分布较广，主要生长在含糖量比较丰富的偏酸性环境中。细胞壁25~70nm，重量约占细胞干重的25%，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质及几丁质。不同于细胞细胞壁，也不同于植物细胞壁。使用不同消毒剂XXX25霉菌

外层：甘露聚糖内层：葡聚糖

中间层：蛋白质

细胞壁电子显微镜下结构示意图XXX26霉菌青霉是种真菌，属于子囊菌。有的能产生青霉素

产生无性孢子。根霉（Rhizopus)是种真菌，属于接合菌。能产生无性孢子菌丝体的直径约12um黑的是孢子囊XXX27霉菌

各种曲霉的菌落XXX28几种控制菌本公司需要控制的集中控制菌XXX29大肠埃希菌XXX大肠

埃希菌广泛存在于环境中，如水中，人畜的肠道、粪便中，所以把大肠埃希菌作为药品有没有受到污染的一种指标菌几乎所有的原辅料都需要检测大肠埃希菌，若检测出大肠埃希菌，说明药品很有可能已经被污染。30金黄色葡萄球菌XXX金黄色

葡萄球菌金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。可引起局部化脓感染

局部用剂会控制金黄色葡萄球菌，例如吉百芙。用于生产吉百芙的原辅料均要检测金黄色葡萄球菌，纯化水也需要检查金黄色葡萄球菌。31铜绿假单胞菌XXX铜绿

假单胞菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。

经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等

吉百芙、吉百芙的原辅料、纯化水32沙门氏菌XXX沙门氏菌沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一

部分辅料要求检查沙门氏菌。例如USP中，硬脂酸镁就要求每10g样品中不得检出沙门氏菌。纯化水也要求检出沙门氏菌。33微生物污染药品的几种途径洁净区污染的途径空气水表面器具XXX人员人员人是药厂中最不清洁的成份，是最常见的、永不休止的污染源。人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种腔道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，存在着对人体无害的微生物群，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等，称为正常菌群。人体的皮肤、手、脸、毛孔、皱纹处及潮湿部位等常有金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、类白喉杆菌等；偶有革兰阴性菌；在皮肤上还有各种皮肤真菌。车间环境监测中出现的最多的两种菌是表皮葡萄球菌和微球菌属某些种，这两种菌被人员带入的可能性很大。XXX35人员头发皮肤嘴巴鼻子衣着化妆品手饰每分钟从人类皮肤中要散发出约10,000个微生物,一小粒糖大的头发中能装载4亿个微生物呼吸、咳嗽和喷嚏将产生出大量水滴，这种水滴既含有尘粒污染也含有微生物污染洁净室内当工作人员穿无菌服（经过过度灭菌处理）时，静止时的发菌量为10～300个/(min·人)，躯体一般活动时的发菌量为150～1000个(min·人)，快步行走时的发菌量为900～2500个(min·人)。发胶、气雾除臭剂、眼脸膏、香粉等，为微生物污染提供了极好的源泉。耳环、戒指、项链、手链等首饰，因为它们难于清洗，所以可能成为感染源或污染源XXX36空气XXX从空气中可分离到芽孢杆菌、梭菌、葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌等；还可分离到青霉、曲霉、毛霉、芽枝霉和酵母等。每立方米的空气中至少含有60万颗尘粒，同时还存在着大量的微生物，在这样的空气条件下进行生产，肯定会污染药品。使空气质量达到我们的要求。这就是要建立密闭厂房和空气净化系统的原因。使用的气体经过HEPA（高效过滤）后，再进入洁净区。洁净区使用的氮气等也是无菌的。洁净区内还会定期进行臭氧熏蒸消毒或者在外线辐射消毒，主要针对的也是气体。例如进入隧道烘箱的气体是经过过滤的，百级层流，保证粒子按单一方向运行，保护环境。37水水可以分为生水、标准饮用水、纯化水（通过蒸馏、离子交换、反渗透制得）、注射用水。各类水，不管怎样仔细地蒸溜或过滤，总会含有一定量的可溶性有机物和盐类。正是这些可溶性的物质可被微生物利用作为它们生长的养料源泉。

自来水中不应有已知的病原菌，除控制大肠杆菌群数外，仍含有其他微生物。去离子水中，污染微生物仍严重。蒸馏水中，污染的菌群通常是革兰阴性菌，也有发现绿脓杆菌的记载。水每天进行检测，保证微生物在合格范围内。

XXX38洁净区墙面、地面、设备表面由于空气中的湿度、所有表面都被包上了一层含水的薄膜、这层薄膜由于静电吸引而饱含尘埃，许多时候，表面还覆盖一层油状物，此油膜易受到尘粒污染。清洗：从表面除去泥土和其它微粒，从而阻止污染物聚积和生长的过程。消毒灭菌：消灭清洗后常常留在表面的致病菌的过程。人员接触洁净区表面也可能造成表面存在微生物，所以一般要求人员不能依靠在洁净区表面。XXX39器具生产用器具经过灭菌柜蒸汽灭菌或者烘箱干热灭菌处理后（均属于过度灭菌）再传入，风险较少。其他物料经过消毒剂擦拭消毒或紫外灯消毒后传入，有一定风险。XXX40原辅料综述原辅料经检测合格后使用，风险较少。

综上所述，控制洁净区环境的重点是人员和物料的传入部分。重点关注G-菌（可以产生内毒素），芽孢杆菌（产生耐受性强的芽孢），霉菌（产生大量孢子）。XXX41消毒与灭菌1灭菌——使达到无菌状态的方法。通常是指杀灭或除去全部活的微生物（包括繁殖体和芽孢）。2消毒——用物理或化学方法杀灭或清除传播媒介上的病原微生物，使其达到无害化。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。XXX42干热灭菌法干热灭菌法干热通过使蛋白质氧化、变性、炭化和电解质浓缩中毒而使微生物死亡，但对微生物的灭活能力远不及湿热。如车间的干热烘箱用来没胶塞桶、胶塞旋转盘等（除热源）。微生物实验室200℃，60min用来干热灭菌取样器具，250℃，60min用来除内毒素。XXX43湿热灭菌法湿热灭菌法通过热蒸汽或沸水使蛋白质变性而杀灭微生物的方法。湿热穿透力强，灭菌效果较干热好。其杀菌所需温度较低，对物品的穿透速度快，要求持续时间短，因此是目前最好的消毒与灭菌方法。

①煮沸或流通蒸汽灭菌：100℃，处理30~60min②低温间隙灭菌（巴斯德灭菌法）：先用60~80℃加热（或煮沸）1h，然后置20~25℃保存24h，使其中残存的芽孢萌发成繁殖体，再灭菌，反复三次。③高压蒸汽灭菌：通过加压提高蒸汽温度，灭菌效果最好。常用条件为：

121℃15过度灭菌115℃32minF0=8残存概率灭菌XXX44F0值、Z值、D值、SALD值Z值SAL指的是121℃蒸汽灭菌的时间。如F0=8,表示121℃蒸汽灭菌8min。如115℃，灭菌32min的F0=8，意思是说115℃，32min和121℃,8min灭菌效果相同。在一定的处理环境中和在一定的热力致死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数时所需要的时间使D值下降一个对数单位需要提高的温度无菌保障水平，一般要求污染概率不超过百万分之一，也就是SAL<10-6F0值XXXLOGO45

影响湿热灭菌的因素

细菌的种类和数量，药物性质与灭菌时间，蒸汽的性质（蒸汽饱和度），介质的性质（灭菌溶液的性质）

生物指示剂挑战实验D值SALXXX做生物指示剂挑战实验的目的，我认为是证明灭菌效果，也就是保证SAL<10-6，而不是为了证明F0>8。F0>8有物理测试保证。保证SAL<10-6需要的F0=D污（lgN污+6）

挑战实验反应出来的F0值

F0=DBI（lgNBI+1）

DBI是生物指示剂的D值，NBI是指示剂开始的孢子量，括号内加1的意思是：把孢子数灭菌到100（也就是剩余1个菌）之后，再下降一个对数单位，这样就是无菌生长。

D污是是平时污染菌中最耐热菌的D值，这个如果有数据积累的话，应该是知道的。现在没有数据积累。我们平时检测耐热菌，药液先经过100℃，30min处理，检测无菌性。到目前为止没有异常体现。如果按Z=10℃计算，100℃，30min处理，相当于121℃，0.3min。即污染菌中的D<0.3。

N污是污染菌的数量，我们控制的标准是102，如果这是警戒线，加上一个安全因子，行动限定为103。

假如现在有106个样品，每个样品中含有N污个菌。6代表的是把N污染降到100（也就是剩余1个菌）之后，继续灭菌，再次使这106个样品降低到只有一个样品里含有1个菌。也就是污染率不超过百万分之一。（SAL<10-6）

所以达到SAL<10-6,我们只需要的F0=D污（lgN污+6）=0.3(3+6)=2.7

我们选用的NBI在7.0×103左右，D在1.7左右，测得的F0在8.0左右。NBI数量变化，反应出来的F0有时候会小于8，但在8左右。但SAL<10-6是可以保证的。NBI数量我们很难控制到一个确切的数字，所以反应出来的F0会在8左右，但SAL可以保证。

我认为要求非过度灭菌工艺F0>8，是为了更有效的保证SAL<10-6，更有安全性。47化学灭菌法D值SALXXX常用化学消毒剂分为8类：①含氯消毒剂；②过氧化物类消毒剂；③醛类消毒剂；④杂环类气体消毒剂；⑤醇类消毒剂；⑥酚类消毒剂；⑦季铵盐类消毒剂；⑧其他类消毒剂（氯己定、碘、碘伏、高锰酸钾、高氧化还原电位酸性水等）。

消毒剂不是无菌的概念

FDA官员曾经在消毒剂中发现过耐受菌的存在，所以FDA的观点，消毒剂不是无菌的。因而在关键区域使用的消毒剂，若购买的不是无菌产品，需要经过0.22μm滤膜过滤后使用。市场上出售的消毒剂有的是经过0.22μm过滤的品种，或者射线辐射灭菌的无菌消毒剂。48滤过除菌法D值SALXXX利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理，除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。过滤法一般只能除菌，不能除去支原体和病毒。

过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。

滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为0.22μm。49辐射灭菌法D值SALXXX利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理，除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。过滤法一般只能除菌，不能除去支原体和病毒。

过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。

滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为0.22μm。50滤过除菌法D值SALXXX利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理，除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。过滤法一般只能除菌，不能除去支原体和病毒。

过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。

滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为0.22μm。51工艺验证、设备验证D值SALXXX1、模拟灌装、分装

模拟实际生产过程中最糟糕的状况，如人员最多、维修设备、灌装时间最长等等情况。

2、工艺验证模拟生产过程，时间过长，微生物和内毒素会不会滋生超过控制标准。

3、设备验证：

隧道烘箱、干热烘箱（除