薄层色谱板的制备和使用

西林街提供各种文档、视频资料、电子书和软件下载PAGEPAGE1实验一薄层色谱板的制备和使用目的要求：通过实验进一步理解薄层色谱技术理论，熟悉掌握薄层色谱板的制备和使用方法。一、薄层层析的基本原理把吸附剂（固定相）均匀地铺在一块玻璃板上，将待分离的样品溶液点加在一薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相）展开，由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同及溶剂对不同物质溶解分配系数不同，当溶剂流过时，各物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附，解吸附，再吸附，再解吸附。不易被吸附或易被溶剂溶解的物质相对移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质被彼此分开，最后形成相互分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，应用特定的试药或方法将斑点显色，从而达到定性和定量的目的。二、薄层板的制备1．玻璃板用一块玻璃板涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等，玻璃板要求薄厚一致，大小相同，表面光滑平整，一般玻璃只要合乎这些要求就可。如果找不到平整均一的，将旧光学照像底片截成同样大小也可以。用前先将玻璃用肥皂和水洗干净，必要时浸泡在清洗液中，然后水洗烤干，用纱布擦光。玻璃板大小有各种规格，一般有20×20、20×10、20×5厘米，也有更小的，可根据需要自行设计。宽度要求至少能点开两三个样品，每两点之间相隔至少1.5厘米，玻板长度一般要满足展开10厘米的距离。点样的起点应距底边至少1.5厘米的距离。2．吸附剂应用最广泛的为硅胶和氧化铝，市场上有专供薄层色谱用的吸附剂，规格分不含粘合剂的硅胶H，氧化铝H和含有粘合剂熟石膏的硅胶G，氧化铝G，如市售硅胶G含13％熟石膏，氧化铝分中性、酸性、碱性三种。吸附剂的粒度范围最好在180－200目之间，太小了流速慢，太大则影响分离效果。如不合要求，应过筛。3．薄层板的涂布最简单的涂布方法是用两条比玻璃板厚0．25毫米的玻璃条或有机玻璃条（或在同样厚度的玻璃条下粘一层胶布），将玻璃板夹住，把调好的吸附剂浆液平铺在薄层板上，然后用一有机玻璃条或直尺，迅速均匀地向前推进，就象推血片一样，只要推进的速度均匀一致，即可得到薄厚均匀的薄层板，如在一块玻璃板末端再接一块相同的玻璃板，把剩余的装液接过去，可使涂层边缘整齐，厚度一致，吸附剂浆液的加水量和搅拌时间是涂布成败的关键，像12×8平方厘米的玻璃板需要2~3克硅胶G，加4~6毫升水即可，只要技术熟练即能涂成厚薄一致，光滑平整的一块薄层板。不同性质不同批号的吸附剂，加水量和搅拌时间有时可有差异，应根据情况摸出规律。为了达到涂布的各板厚度均匀一致，最好采用涂布器进行薄层的涂布。为了增加薄层的牢固性及易于保存，可在涂布过程中加入某些粘合剂以增加薄层的硬度。一般采用添加剂羧甲基纤维素钠（CMC—Na），应用方法是取CMC-Na1克溶于100毫升水中，加热煮沸溶解，按比例与硅胶搅匀，铺板。涂成之后先把玻板放在平面上，室内干固，再对光检查，看是不是均匀，有无气泡，平整光洁度如何，合格的上烤箱110℃在进行实验时，应尽量可能采用同批号涂布活化的薄层板，以减少因活化不一致引起的Rf值发生差异，目前国内市场已有成品供应，如黄岩化学分析材料厂即有各种类型的薄层板出售。三、薄层板的使用1．点样将样品溶于适当的溶剂中（应尽量避免有水），取微量注射器或玻璃毛细管截齐后，吸取一定量的检样，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上，点的直径不要超过0.3厘米，一次不能点完，待干后再点，稍有过分就会损伤板面，影响展开后的斑点形状。每两个样点之间相距至少1.5厘米。点样的起点距薄板底边至少1.5厘米，以免样点浸入展开溶剂中，同块薄板上各样点应保持在与底边平行的一条直线上，为控制好点样距离，应用薄层点样尺架。2．展开根据薄层板大小，自行选用适当玻璃标本缸，长方形，如17×10×6厘米的标本缸可容纳下15×9厘米的玻璃板。采用较大的玻璃缸和玻璃板时，在缸内沿周围缸壁衬一层预先浸有溶剂的滤纸，以便缸内展开溶剂易达到饱和，防止边缘效应（即两边缘的点走得快）和同一物质Rf值不一致现象。一般将薄层板斜置展开容器内，密闭。先不使溶剂浸湿薄层板，饱和10~15分钟后再进行展开，展开溶剂沿着薄层板向上移动。对加粘合剂的涂板可以近于垂直的状态进行展开，而对未加粘合剂的薄层板则必须以倾斜状态（15度角）进行展开。为了防止产生“边缘效应”和展开溶剂不饱和现象。还可采用夹心式展开容器，其方法是将薄层板的左右两侧各刮去5~10毫米，垫上条状玻璃或塑料，盖一块与薄层板同样大小的玻璃，用夹子将两边夹好，插入展开溶剂中进行展开，并能取得良好效果。3．显色薄层展开后，凉干。如含粘合剂，即可直接喷显色剂，使之显色，有的还需经紫外线（254nm）照射后方能显色；对不含粘合剂的薄板，在喷显色剂时应尽量远离薄层板，否则会连吸附剂一起吹掉，应予以注意。四、检样的定性定量分析1．比移值（Rf）的测定当样品的薄板一端被展开，经过毛细管作用流向另一端，样品是按一定的比例分配在固定相与流动相之间。并沿着溶剂流动的方向移动，由于样品中各组分在两相中分配系数不同，各组分的移动速度也不同，经一定距离后使各组分彼此分离。样品各组分移动的速率，亦即分离后在薄层板上的位置与溶剂展开前沿的距离的比值为比移植。2．定性分析相同的物质Rf值应当是相同的，但因能影响Rf值的因素很多，要想得到与标准物质相同的Rf值，最好在鉴定时，将样品与标准物质点在同一张薄层板上一同展开，根据检样斑点的Rf值与标准样品的Rf值比较，即可确定二者是否相同，但要做到准确的定性，需要两种以上展开溶剂系统所得的Rf值比较判断。3．定量分析（1）目测比较法①用吸附剂（如硅胶G）涂布成厚0.25~0.5毫米，大小20×20厘米的薄层板，110℃②用微量注射器（10微升）在距板底1.5厘米处，将标准样品溶液按1、3、5、7微克自左向右点在起始线上，然后再吸取不同量的检材提取溶液（相同于1、3、5克检材的提取溶液）按次序点在同一板的右侧。③选择比移值适中的展开剂（Rf在0.45~0.75之间者）用夹心式展开法或连续薄层展开法。展开距离为10厘米，显色剂要求能使显色后的斑点明显清晰。这样得到的色斑比较集中，重现性好，便于比较。④显色后，观察其色斑大小，深浅与已知不同浓度的标准样品系列色斑相比较，粗略定出含量，然后算出检液总体中含量，根据所取检材量，求出百分含量。（2）洗脱测定法①在制备好的薄层板左端，先点一标准样品点，作为对照定位用，然后根据检材提取溶液的多少，在同一板的右端点成点状或线状。②置玻璃缸中展开（如有连续薄层展开仪更好），展开后晾干，再用玻璃板遮住右侧检材部分，仅使对照定位点显色。③显色后，根据斑点位置将未显色部分（相当于色斑所在部分）的吸附剂用刮刀刮下或用抽吸法收集起来。④将收集的吸附剂置于小层析柱管中，用极性大的溶剂甲醇或乙醇进行洗脱，收集洗脱液并加以浓缩。⑤用适当溶剂调整到一定体积，可用紫外分光光度计，在被检物最大吸收波长处进行测定。同时用薄层吸附剂洗脱液作空白吸收值测定。如有灵敏度高专属性好的比色反应，还可用比色计测定化合物的含量。上述洗脱液亦可作为气相色谱仪、液相色谱仪分析前的处理液。（3）薄层色谱扫描仪测量法以洗脱法处理层析色斑，不仅操作麻烦，而且有些待测成分不能定量地洗脱下来。或者在洗脱过程中发生分解，影响测定结果的准确性，最好是采用双波长薄层色谱扫描仪直接定量检测，经电子积分器积分推算出检样中待测物质的含量。其测定方法包括为：①斑点面积测量法；②斑点光密度测量法；③斑点荧光测量法。附：实验仪器1．薄层涂布器2．微量注射器3．薄层点样尺架4．薄层板展开缸5．吸引器6．喷瓶7．烘烤箱实验二氢氰酸及氰化物的检测目的要求：了解氰化物中毒的条件和毒性反应，掌握氰化物的化学性质，检材的采取及处理方法和常见的鉴定方法。一、检材采取和毒物的分离1．检材采取：最好的检材为中毒者剩余的食物、饮料、呕吐物及尸体胃和胃内容物，其次为血液，肺、肝、脑等。吸入中毒的应采取血液为宜。检材应盛于密闭容器内，并尽量少留空间，尽快进行检验，不能及时检验者应将检材低温冰冻保存。2．毒物分离：含氰化物中毒检材的分离采用水蒸气蒸馏法（1）分离原理：氰化物遇酸可形成易挥发的氢氰酸，氢氰酸具有较高的蒸气压，检材在酸性条件下当和水同时加热或通入热水蒸气时，能随水蒸汽在较低的温度沸腾蒸馏出来，在碱性环境下被冷却收集，达到分离的目的。（2）操作方法：取适当量检材（10～50克），剪碎或捣碎，放入250毫升圆底烧瓶中，加水2倍，再加10％的酒石酸酸化（PH5）。取1000毫升烧瓶作为水蒸气发生瓶，倒入热水，投入数小块沸石，上插安全管（长度60厘米的玻璃管）。按图所示：用连接管将两瓶相连，将检材瓶浸入水浴锅中接上冷凝管，收集液瓶中加入5毫升0.01N氢氧化钠溶液使接收管直接通到受液瓶中稀碱液液面下，以防馏出氰化物逸失，检查所有瓶塞及各接头处紧密不漏气后，将水蒸气发生瓶和水浴锅同时加热，收集馏液10分钟备检。〔注意事项〕（1）检材处理的愈碎愈好，检材溶液必须呈酸性。（2）蒸馏装置的各接头处必须严密不漏气。（3）蒸馏完毕后，应先将受液瓶取下，再将水蒸气发生瓶的瓶塞放松，或将水蒸气发生瓶与检材瓶之间的连接处拆开，然后再停止加热以防各瓶之间相互倒流。（4）对血液、面糊、稀粥等检材，可加入2～3毫升液体石蜡或适量的三氯醋酸溶液，以避免蒸馏时发生大量的泡沫溢入冷凝管。（5）蒸馏瓶中的内容物，不能超过瓶容积的1/3。二、氢氰酸及氰化物的鉴定方法（一）普鲁士蓝反应：1．原理：蒸馏出来的氢氰酸吸收在稀碱溶液中生成氰化钾，加硫酸亚铁后生成亚铁氰化钾（黄血盐），后者与溶液内亚铁氧化成高铁，在酸性条件下，化合为亚铁氰化铁，即普鲁士兰或柏林蓝。该反应是氰化物的专属反应，阳性结果可确证氰化物的存在，反应灵敏度为1：5000。2．操作方法：取蒸馏液3～5毫升，加新配的20％硫酸亚铁2滴，加热至恰沸，加稀硫酸使成酸性，如有氰根视含量多少，溶液有蓝绿色至深蓝色。量多即析出蓝色沉淀，量少时颜色和沉淀可能要隔24－48小时后才显出。（二）氰化物的快速检验法检材不经水蒸气蒸馏，可直接做普鲁士兰试验。1．原理：氢氰酸与硫酸亚铁－氢氧化钠试纸作用生成亚铁氰化物，在酸性条件下，再与由空气氧化产生的三价铁离子作用生成普鲁士兰。6HCN+Fe2++6OH-=Fe（CN）64-+6H2O4Fe3++3Fe（CN）4-6＝Fe4[Fe（CN）6]3（普鲁士兰）2．操作方法：取检材5～10克，置锥形瓶中，加适量水调成稀糊状，加10％的硫酸使之变成酸性，取滤纸一小方，滴加新配制的20％硫酸亚铁2滴及10％氢氧化钠2滴，将此滤纸覆盖于锥形瓶口，瓶底缓缓加热，待有蒸气上冒，取下滤纸，浸入6N盐酸内，如有氰根，滤纸即蓝色斑点，水洗，色斑更鲜艳。实验三血中一氧化碳的检测目的要求：熟悉一氧化碳中毒的特征和检材的采取要点，掌握碳氧血红蛋白分析鉴定方法及饱和碳氧血红蛋白的制备技术。一、检材的采取一氧化碳中毒检材以取血液为最好，对于尸体通常是采取心腔内血液进行检测。活体通常静脉采血并要加抗凝剂，密封。盛装检血的容器应将检血装满不要留有空间，以避免一氧化碳损失而影响检验结果。二、碳氧血红蛋白的鉴别试验1．煮沸法取血2－3毫升，置试管内，放水浴锅中加热，使发生凝固。如系一氧化碳血，呈砖红色凝固体，而正常血则呈褐色或黑褐色凝块。此法最简便，不需任何试剂，在勘验现场即可进行，但含量在40％才可测出。2．硫化铵法取水10毫升，加血5滴，加硫化铵5滴，较混合之，再加少量10％醋酸使微呈酸性，如系一氧化碳血，呈玫瑰色；而正常血为绿褐色。此法灵敏，含量在10％即可检出。3．碱液稀释法取血1－2滴，加水稀释至15毫升，再加5滴10％氢氧化钠，同时取一正常血样作对照，与碱液混合后立即记下时间，正常血由于碱性正铁血红素的形成，立即变为草绿色或绿褐色而含10％以上一氧化碳血液需要15秒钟后才变为草绿色或绿褐色；含50％者需要50秒钟后。4．钯镜试验（1）原理：碳氧血红蛋白与硫酸作用释放出一氧化碳，一氧化碳可使氯化钯还原成钯镜。(2)操作方法：取扩散皿(孔威氏盒)一个，内槽内放入0.5毫升0.1％氯化钯溶液，外槽内一侧放入0.5毫升检血，另一侧放入0.5毫升10％硫酸溶液（封盖前不要让它们接触)，然后盖上盒盖，轻轻摇晃使血液与硫酸充分接触。20分钟至2小时内观察试验结果，如有一氧化碳释出，可见内圈形成发亮的钯镜。以上各鉴别试验，一定要取正常血同时做对照试验，以作对比。三、碳氧血红蛋白的定量检验1．实验室中饱和碳氧血红蛋白的制备：实验装置图见下：1.硫酸2.甲酸3.血液4.20％NaOH一氧化碳发生装置先将浓硫酸加热，而后扭开分液漏斗活塞，让甲酸（H－COOH）一滴一滴与浓硫酸接触，即有一氧化碳气体冒出，经过洗气瓶，通入盛有正常血的瓶中，10毫升血（用0.05克枸椽酸钠作抗凝剂）通一氧化碳约15分钟，即可使血红蛋白的一氧化碳饱和度达l00％，避免通气过猛，以免血液内产生大量泡沫外溢。因每人Hb含量不同，最好取死者血通以一氧化碳使达饱和，可省去换算。2．吸收光谱法测定血中HbCO饱和度在各类测定方法中，研究和应用最多的是利用可见光吸收光谱的分光光度法来测定血中HbCO饱和度。（1）原理：双波长吸光度比值法：CO中毒的检血中同时含有HbO2、HbCO、MetHb和Hb的血，用连二亚硫酸钠使之还原后，血样中只含有HbCO和Hb两个组分，其吸收光谱是HbCO和Hb两者吸收光谱的加和。因555nm是Hb的最大吸收波长，538nm是HbCO的最大吸收波长之一，所以，随着血中HbCO饱和度的增高，555nm处的吸光度减小，而538nm处的吸光度增大，538nm处的吸光度与555nm处的吸光度之比值A538／A555也随着HbCO饱和度增高而增大，且其间也有近似直线的关系。故可用下式计算血中HbCO饱和度。用下式表示。(A(A538/A555)X－(A538/A555)0(A538/A555)100－(A538/A555)0HbCO(％)＝×100％上式中括号外的下角标，X表示未知HbCO饱和度的血样，0与100分别表示HbCO饱和度为0％和100％的血样。（2）操作方法：先将非吸烟者的血样用0.1％碳酸钠溶液稀释约200倍，加入少许连二亚硫酸钠（约0.1％）后，放置15min。使HbO2还原，在538nm和555nm处测定吸光度，计算得HbCO饱和度为0％的比值。再将此溶液通入一氧化碳气体使Hb全部转变为HbCO，在相同两波长处测定吸光度，并计算出HbCO饱和度为100％的比值。检血也按上述方法稀释并加入还原剂，同样波长处测定吸光度，得出比值。将所得三个比值代入上式即可求出未知血样的HbCO饱和度。此方法对HbCO饱和度较高的检血有较好的重现性，但不适合测定HbCO饱和度低的检血。方法对检血的稀释不要求很精确；HbCO饱和度为0％和100％的比值一次测定后，只要条件不改变，不必每次都测。通常(A538／A555)0的值为0.775，(A538／A555)100的值为1.233。实验四酒精的检测目的要求：熟悉对含酒精检材的采取保存方法，掌握酒精的常用鉴别试验。了解气相色谱理论和设备；初步熟悉应用气相色谱进行定性、定量分析的方法。一、检材的采取保存和分离1．乙醇中毒可取血、尿、唾液、胃内容物及呼出气为检材，其中血液为首选检材，此外还可采脑、肺、肝、肾等脏器为检材。采取血液以周围静脉血（股静脉）为宜。2．含酒精的检材应及时检测，如不能及时检测，应放置冰箱内保存。盛装检材的容器在保存检材时应装满不要留有空间，并进行密封以避免酒精挥发损失。3．对所有生物检材中含有的酒精可采用蒸馏法进行分离，对血、尿等液体性质检材亦可直接取样进行微量扩散和气相色谱分析，胃内容物可将其离心后取上清液直接做分析测定。二、酒精的颜色反应1．碘仿反应（1）原理：碘与碱作用生成次碘酸盐，能将乙醇氧化成乙醛，乙醛与碘作用生成三碘乙醛，再与碱作用，生成黄色碘仿。（2）操作方法：取溜液2—5毫升，放入试管内，加10％氢氧化钠溶液数滴混合。滴加碘化碘钾试剂至溶液呈浅黄色。在60℃【注】本反应并非乙醇所特有，乙醛、丙酮、甲基酮及能被次碘酸盐氧化为乙醛，或甲基酮的醇均能产生同样反应。2．微量扩散法――预试验（1）原理：重铬酸钾与乙醇或其他还原性物质（醛类和其它低级分子）作用时，被还原成Cr3＋，颜色由橙黄色转为兰绿色。（2）操作方法：在扩散皿的内槽中放置重铬酸钾－硫酸试剂1毫升，外槽一侧加饱和碳酸钠1毫升，另一侧加入检血1毫升，盖上盒盖后，倾斜旋转使检血和碳酸钠溶液接触混合，放置一小时，观察结果，如检材内含有乙醇，以其含量大小呈现黄绿至蓝色变化，见下表1血中乙醇不同含量的颜色变化；表2血液中乙醇浓度与酩酊度。表1血中乙醇不同含量的颜色变化含乙醇克数％重铬酸钾硫酸识别颜色结果0.00鲜黄色00.08黄－黄绿＋0.15黄绿－绿＋＋0.23绿－深绿＋＋＋0.30深绿－蓝色＋＋＋表2血液中乙醇浓度与酩酊度血中乙醇含量％0－0.050.05－0.150.15－0.300.25－0.400.35－0.500.50酩酊度初出现异常状态行动尚较正常，但已欣快多话正常行动较难，思考力减退行动已困难但意识仍较清楚昏睡致死三、气相色谱分析【色谱条件】色谱柱：4mm×2m不锈钢柱，内装10％PEG20M，ChromosorbW(60～80目)4mm×2m不锈钢柱，内装GDX－201W(60～80目)FID检测器和气化室温度：150℃；柱温：lOO℃。载气(N2)流速：45ml／min；H2【操作】在10ml左右的玻璃瓶(顶空瓶)中加入0.5ml检材(血或尿)，0.5ml内标液，约1g硫酸铵，加盖聚四氟乙烯薄膜和胶塞，用铝盖封好，摇匀，置于60℃水浴中加热15～20分钟，用事先预热好的注射器抽取200µ再取0．5m1正常血(或尿)加入顶空瓶中，加入0．5ml标准液(含乙醇和正丙醇各为0．5mg／m1)和约1g的硫酸铵，加盖聚四氟乙烯薄膜和胶塞，加铝盖密封，其余操作和检材相同，求出乙醇和正丙醇的峰面积比(K)，重复操作三次取平均值，检材中乙醇的含量按下式计算：检材中乙醇的含量(mg／m1)＝A乙醇/A正丙醇×1/K×C乙醇其中A乙醇：检材中乙醇所产生的色谱峰面积。A正丙醇：检材中正丙醇内标产生的色谱面积。附：试剂1．碘化碘钾试剂：2克碘化钾与1克碘溶于50毫升水中。2．重铬酸钾一硫酸试剂：重铬酸钾0.37克，溶于15毫升水中，然后缓慢加入2毫升浓硫酸，边滴加，边搅动，放冷后备用。实验五合成药物的检测巴比妥类药物的检测目的要求：熟悉巴比妥类药物的理化性质，掌握由检材中提取的分离原理和常规的分析方法，通过实验熟悉薄层色谱在毒物分析工作中的使用技术。一、检材的采取巴比妥类药物中毒以胃内容物、肠内容物、胃液以及血、尿或肝、脑等脏器为检材。二、检材的分离提取1．原理：巴比妥类安眠药属于弱酸性有机化合物，在酸性条件下形成巴比妥类衍生物能溶于大部分有机溶剂。在碱性条件下形成巴比妥盐类物质溶于水而不溶于有机溶剂。根据这一化学性质，在对检材的分离提取过程中，应首先酸化检材使形成盐的巴比妥类药物转化成巴比妥酸类衍生物，再用有机溶剂进行提取。2．分离提取取尿液50毫升，加10％硫酸酸化至PH5－6后，置分液漏斗内，用氯仿溶剂50毫升，30毫升，20毫升分别提取三次，合并提液，用10克3．尸体内脏的快速提取法：取尸体脏器及干性胃内容物50--100克三、颜色反应1．硝酸钴－氨液反应：原理：巴比妥类安眠药的分子结构中有环脲酰－C＝NH基团，在碱性条件下，可与钴盐发生显色反应，生产紫红色络合物。操作方法：将检材提得的残渣加入少量乙醚溶解后滴加在滤纸上，再加1％硝酸钴无水酒精液数滴，置于浓氨水瓶口熏以氨气，如呈现紫红色表示有巴比妥酸的存在。若滤纸于1－2分钟内呈黄色，边缘有时呈青绿色，则为阴性。本反应必须在无水条件下进行，所用一切容器要干燥，应同时作阴性及阳性对照。2．硫酸铜一吡啶反应OO(1)原理：巴比妥分子中含有一C—NH—C—NH基团，可与铜盐作用，发生类似缩二脲的反应，生成有色络合物，含氧巴比妥呈红色，含硫巴比妥呈绿色。(2)操作方法：将检材提取残渣加入少量吡啶氯仿液溶解，再加硫酸铜吡啶液2滴，如含巴比妥类安眠药即显红紫色，硫喷妥呈显绿色。注意：此反应也可于滤纸上进行，显色剂硫酸铜吡啶勿用过量，否则试剂本身颜色会掩盖反应结果。灵敏度100一200微克。，四、薄层色谱法1．薄层板硅胶G板或硅胶CMC板2．展开(1)苯：丙酮(8：2)展开剂(2)苯：二氧六环：二乙胺(7：2：1)展开剂(3)氯仿：丙酮(9：1)展开剂3．显色(1)硫酸汞－二苯卡巴腙试剂(2)硝酸银－二苯卡巴腙显色剂操作方法：当层析后取出薄层板晾干，喷硫酸汞液或硝酸银丙酮液，此时巴比妥类药物显白色斑点。再喷以0.2％二苯卡巴腙氯仿液薄层背景即呈蓝紫色并慢慢褪去，杂质是不规则的蓝色斑点，而巴比妥类药物则呈现紫色斑点。4．测量计算判断结果五、紫外分光光度法的定量检测(一)原理：一定浓度范围内(每毫升含药物2—30微克)的巴比妥类药物在PHl4和PHl0溶液中于紫外波长260nm处相互吸收差值成正比。根据检液在260nm处的吸收差值，同已知药物的标准曲线对照，得知检液浓度，从而计算出药物含量。(二)操作方法1．标准曲线(1)标准溶液的配制及紫外吸收测定取每毫升含1毫克速可眠等巴比妥类药物的甲醇液1.5毫升于50毫升烧杯中，置60℃另取十二个10毫升的试管，分成两组，依次分别加入上面配制的每毫升标准药物10、20、30、40、50、60微克的PHl4碱液各2.0毫升。再于第一组试管中各加0.45N氢氧化钠液2.0毫升，即配成每毫升含速可眠等巴比妥类药物5、10、15、20、25、30微克的PHl4碱液；再于第二组试管中各加入0.6N硼酸－氯化钾缓冲液2.0毫升，即配成每毫升含速可眠等巴比妥药物5、10、15、20、25、30微克的PHl0碱液。取已配好的速可眠等巴妥类一系列不同浓度的PHl4和PHI0碱液，以相同PH值的碱液为参比，在紫外分光光度计上于190—270nm间测吸收图谱，算出260nm处的吸收差值。(2)绘制标准曲线：以PHl4和PHI0碱液于260nm处的吸收差值或PHl4和PH2于305nm处的吸收差值△E为纵坐标，浓度(微克／毫升)为横坐标，在坐标纸上绘出直线，即得巴比妥类药物的标准曲线。巴比妥、戊巴比妥和速可眠的浓度在0--30微克／毫升之间成线性关系。(3)检材中药物含量的测定取0.45N氢氧化钠反提液，按下法分别配成PHl4和PHl0的溶液；取2毫升反提液，加2毫升0.45N氢氧化钠溶液，混匀后即为PHl4检液。取2毫升反提液，加2毫升0.6N的硼酸－氯化钾缓冲液，混匀后即为PHI0检液。PHl4检液，以0.45N氢氧化钠作参比。PHl0检液，以0.45N氢氧化钠和0.6硼酸－氯化钾缓冲液的混合液为参比。分别在紫外分光光度计上从190到270nm间吸收，算出在260nm处的吸收差值。再从该药物的标准曲线中查得所含药物的浓度，计算出检材中药物的含量。VVc×CmM检材含药量W＝W＝检材中的含药量（微克/克·毫升）Vc检材用0.45N氢氧化钠反提毫升数Cm=从标准曲线上检得的检液浓度（微克/毫升）M＝所取检材克数六、气相色谱法1．应用填充柱技术，衍生化法2．操作条件检测器：FID色谱柱：6英尺（或2米）2～4mmID玻璃柱固定液：3％SE－30，80－100mm载气：N2，45～50ml/min柱温：190－200进样/检测器温度：220内标物：正烷烃衍生化试剂：0.2M三甲基羟苯胺甲醇溶液[方法]内标溶液的配制：用乙酸乙酯溶解一定量的正烷烃，配成1mg/ml的巴比妥酸类药物标准溶液。[标准溶液的配制]准确称取一定量的巴比妥类药物（游离酸），用内标溶液来配制成1mg/ml的巴比妥酸类药物标准溶液。[样品溶液的配制]称取一定量备用内标溶液来配制。内标和样品中巴比妥酸类药物的浓度都应大致在1mg/ml的范围内。取1µl的标准溶液和1µl的衍生化试剂一并注入色谱柱中，利用在线的衍生化技术进行柱头衍生化，然后一起注入样品溶液和生化试剂，计算样品中巴比妥酸盐的浓度可利用下列式：Cr.std.CsamAx/Aint.std.in.sam.chrom.Cr.std.CsamAx/Aint.std.in.sam.chrom.Ar.std./Aint.std.in.chromCX%=××100其中：Cx％：样品中组分x的浓度(W／W％)Cr.std：标准溶液中组分x的浓度(W／V％)Csam：样品浓度(W／V％)Ax：在样品峰中组分x的峰面积Arstd：标准溶液色谱峰组分x的峰面积Aint．std．insam．chrom：样品峰中内标物的峰面积附：试剂配制1．配制磷酸钠溶液：5克磷酸二氢钠溶于100毫升水中。2．1％硝酸钴乙醇液：l克无水硝酸钴溶于100毫升无水乙醇中。3．吡啶氯仿液：1毫升吡啶加入9毫升氯仿混匀。4．硫酸铜吡啶法：1份1％硫酸铜溶液和等量吡啶氯仿液混和。5．硫酸汞试剂：5克氧化汞溶于20毫升浓硫酸中；然后将此缓慢加到水中，稀释至100毫升。6．硝酸银丙酮液：l克硝酸银，用加有l％水的丙酮溶解，取其上清液使用，避光保存。7．0.2％二苯卡巴腙试剂：0.2克二苯卡巴腙溶于100毫升氯仿。8．0.45N氢氧化钠液：溶解18g氢氧化钠于水，并稀释达l升，贮在聚乙烯瓶中。9．硼酸－氯化钾缓冲液：硼酸18.55克，氯化钾22.36克，加水溶解(需加热)至500毫升，过滤后使用。10．PHl0缓冲液：等量的硼酸－氯化钾缓冲液和0.45N氢氧化钠液混合，即得。临用时配制。吩噻嗪类药物的检测目的要求：熟悉吩噻嗪类药理化性质，掌握分离提取原理和常规定性定量分析方法。一、检材的采取应以剩余药物、胃内容物或洗胃液及尿、血等作检材较好，因吩噻嗪类药物易分解，应避光保存。二、检材的分离提取1．分离原理：吩噻嗪类药物属碱性有机化合物，在碱性条件下可溶于有机溶剂中，而在酸性条件下形成盐类易溶于水。在毒物分析工作中，对含有吩噻嗪类药物的检材应在碱性条件下用有机溶剂提取，由于吩噻嗪类药物进入体内，部分与蛋白质或葡萄糖醛酸结合，以结合形式存在，一般的碱化检材，难以完全被有机溶剂分离提取，各有机溶剂对吩噻嗪类药物的溶解度各不相同，特别是氯丙嗪不易被氯仿提取，而多采用乙醚或庚烷作溶剂提取。2．快速提取法取尿或胃内容物50毫升，加10％氢氧化钠碱化至PH11－12，取乙醚50、30、20毫升分别提取三次，合并提取液，用无水硫酸钠脱水，活性碳脱色后置水浴上挥干，剩残渣供检测用。3．盐酸水解法血、肝、脑、肾等内脏组织，取20－40克剪碎加入等量浓盐酸，置沸水浴中加热1小时，再经60％氢氧化钠碱化后用乙醚或庚烷50－100毫升分三次浸提，合并提取液经无水硫酸钠脱水，活性碳脱色后，水浴上挥干溶剂，残渣供检测用。4．乙醇冷浸提取法：对高度腐败或肉泥状，含吩噻嗪又极少的检材可用碱性乙醇冷浸提取，即取检材20—40克，加氢氧化钠溶液呈碱性，加无水乙醇浸泡检材，充分摇匀，放置过夜，滤出无水乙醇。检材再用无水乙醇浸洗两次，过滤。合并醇液于水浴上蒸发至干。加0.1N盐酸30毫升溶解残留物，酸液置冰箱中冷冻，将油脂冻成块状后立即过滤，滤液用氢氧化钠液调至PH为12，再用乙醚提取，浓缩乙醚至0.5毫升，供检验用。三、颜色反应1．三氯化铁－硫酸反应直接取尿液1毫升，加入5％三氯化铁溶液0.5毫升，产生桃红色到紫红色。再加0.5毫升50％硫酸，颜色不消退，表示含有吩噻嗪类药物。2．FPN试剂试验(1)原理：吩噻嗪类分子结构中的苯骈嗪环，易被氧化剂氧化为红色的醌式衍生物。(2)操作方法：取提取残渣少许，放在白瓷反应板中（或试管内）滴加FPN试剂1－2滴，如有氯丙嗪，异丙嗪及奋乃静则呈现洋红色，如有太尔登，三氟拉嗪出现橙红色。四、薄层色谱法1．薄层板硅胶G或硅胶CMC薄层板2．展开剂（1）苯：醋酸乙酯：二乙胺（9：3：1）（2）苯：环己烷：二乙胺（1.5：7.5：2）3．显色（1）50％硫酸－乙醇显色剂，显橙色至粉红色。（2）FPN试剂：呈粉红色50％硫酸－乙醇液作为显色剂，只有吩噻嗪类化合物与试剂产生反应，其还可以区别某种吩噻嗪类化舍物。如氯丙嗪与异丙嗪在此展开溶剂系统层析后色斑的Rf值较为接近，但它们的色斑与硫酸－乙醇液作用显色不同，可区别开来。吩噻嗪类不稳定，易分解，除出现原药斑点外，其代谢产物斑点也同时出现，故有时可同时出现两三个斑点，此时，可先将原点处的斑点加1：1硝酸1滴，以能盖住原点为度，使检品及标准样品全部氧化为亚砜。但一般亚砜显色较慢，可在紫外线下照射2－3分钟后即可显色，待红色斑点退色后，吹干水分，再用上述溶剂展开，显色。4．测量计算判断结果试剂配制1．0.1N盐酸溶液：8.33毫升浓盐酸用水稀释至100毫升。2．FPN试剂：5％三氯化铁1毫升，20％过氯酸9毫升，50％硝酸10毫升，混合即可。3．50％硫酸－乙醇液：50％硫酸40毫升，无水乙醇10毫升混合配制。苯骈二氮杂卓类药物的检测目的要求：了解苯二氮卓类药物的理化性质，掌握其分离提取原理和常规的检测方法。一、检材采取应以中毒者的剩余食物、饮料，初次洗胃液、血、尿为理想检材。二、检材的分离提取1．分离原理：苯二氮卓类药物包括安定、舒乐安定、三唑仑、阿普唑仑等，在酸性条件下成盐溶于水，一般在弱碱性环境下易被提取，由于安定、三唑仑、阿普唑仑等在乙醚中的溶解度极小，因此在提取时常选用氯仿等溶剂。2．快速提取：取尿或胃内容物50毫升，加浓氨水碱化至PH8－9，用氯仿50、30、20毫升分别提取三次，合并提取液于蒸发皿中，用无水硫酸钠脱水，活性炭脱色后置水浴上挥干，剩残渣供检测用；对尸体脏器检材，先将其捣碎，加氨水调PH8－9，加无水硫酸钠将检材研磨至粉渣状，再以如上方法提取净化。三、颜色反应1．原理：本类药物与碘化铋钾试剂反应产生橙红色沉淀，但许多物质都有此反应，因此专属性不强，只能作为预试验用。2．操作方法：用1毫升氯仿溶解上述残渣后，用毛细点样管吸收少部分，滴加在薄层板上，干后，滴加一滴碘化铋钾试剂，此时含苯二氮卓类药物的斑点显桔黄色。四、薄层色谱法1．薄层板硅胶G或CMC薄层板2．点样将提取残渣与标准品分别用毛细点样管点在薄层板上，然后放入层析缸展开剂中进行展开。3．展开剂(1)氧仿：丙酮(9：1)(2)甲苯：丙酮：无水乙醇：氨水(9：9：1.6：0.4)4．显色碘化铋钾——显桔黄色操作方法：当层析后取出薄层板晾干，用喷瓶均匀地喷上碘化铋钾试剂，此时苯二氮卓类药物显桔黄色斑点。将样品与标准品斑点进行对照，量出Rf值，判断结果。五、安定的含量测定一紫外分光光度法1．原理：安定在2—20微克／毫升浓度范围内，其242nm和263nm处的光密度差值与浓度成正比。2．试剂：3M磷酸盐溶液：41.4克NaH2PO4·H2O加水溶解至100毫升。氯仿(或乙醚)0．45N氢氧化钠溶液正已烷2N盐酸溶液安定标准溶液3．操作(1)取检材5克或5毫升，捣碎后，加3M磷酸盐溶液0.25毫升，用氯仿30－50毫升振摇提取，分出氯仿液。检材再用10－20毫升氯仿提取一次，合并氯仿液。(2)氯仿液用10毫升0.45N氢氧化钠溶液洗涤一次，弃去碱液，再用水洗一次。(3)氯仿液通过干燥的滤纸，滤入蒸发皿中，挥干（如用乙醚提取，需用无水硫酸钠脱水后挥干）；4)残留物用10毫升正已烷溶解，用4.0－10.0毫升（精确）2N盐酸反提，盐酸液于220nm－400nm范围内测其吸收光谱，记录其在242nm和263nm处的光密度。另取一份相应的空白检材，加100微克安定作标准对照，与检材同样操作，记录其在242nm和263nm处的光密度。E检E检E标mV标V检W安定％(mg／g或m1)=××××0.1E检一检材的光密度差值(242nm－263nm)E标－标准对照的光密度差值(242nm－263nm)M－标准对照用的安定微克数V标－标准对照2N盐酸反提液的毫升数V检－检材2N盐酸反提液的毫升数W－检材的克数或毫升数六、高效液相色谱分析由于苯二氮卓类的结构各不相同，所以无法用单一的高效液相色谱方法来完全分离它们，但是下面所推荐的方法则可达到对所有国际控制的苯拿?拳它们，但是下面所推荐的方法则可达到对所有国际控制的苯二氮卓类化合物定性及定量。常规分析所采用的色谱柱及流动相系统可根据所在国家经常出现的药物来选择。[反相色谱分析]色谱柱：250mm×5tumID填料：5um直径的HPLC级碳十八硅烷（ODS…Hypar或与之等价的填料）流动相：甲醇：水：磷酸缓冲液（O.1M）（55：25：20，v／v／v），pH7.25甲醇：水：磷酸缓冲液（O.1M）（70：lO：20，v／v／v），pH7.67磷酸缓冲液（0.1M）可通过溶解二水磷酸二氢钠(14.35g，0.092mol)和磷酸氢二钠（1.14g，0.008mol）于1000ml水中制成。流速：1.5ml/min检测：紫外240nm样品溶液：用含50％（V／V）水的甲醇液一定的量溶解前述提取残渣标准溶液：均用含50％（V／V）水的甲醇配成浓度为lmg／mvl。进样体积：20ul定量方法：用峰值面积外标法定量实验六农药的检测有机磷农药的检测目的要求：了解有机磷农药的理化性质和生物学特性，掌握分离提取方法，及常见有机磷农药的鉴别试验。一、检材的采取有机磷类农药中毒应取中毒者吃剩的饭菜、调料、饮料、喝剩的农药瓶、呕吐物、洗胃液、血、尿及肝、肾、肺等检材。二、有机磷农药的分离提取方法1．原理：有机磷品种很多，有的极性较弱，有的极性较强，在提取中要注意根据有机磷极性的强弱和检材中脂肪、蛋白、色素等杂质含量的高低，选择合适的溶剂。原则上，极性强的有机磷应用极性强的有机溶剂，极性弱的有机磷用极性弱的有机溶剂。敌百虫、敌敌畏、乐果、磷胺、久效磷等属强极性有机磷；3911、1240等属弱极性有机磷；1605、4049、1059等属中极性有机磷。但总的来说，有机磷农药的极性都比较强。中等极性和强极性的有机溶剂，如苯、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲醇等均能将各种有机磷从检材中提取出来。2．分离提取：根据有机磷易挥发和在碱性溶液中易水解的特点，一般均在中性或酸性条件下用沸点较低的有机溶剂提取。在挥发浓缩时，温度不易过高，一般在60根据检材的种类、性状不同，具体提取方法也不同。（1）固体检材：粮食、面粉等。取检材50～100克左右，加苯或氯仿适量，振摇提取半小时，过滤，滤液自然挥干或在60℃（2）半固体：呕吐物、胃内容物、剩余饭菜根据检材含水量多少，加适量无水硫酸钠脱水，再用苯或氯仿提取，如含水较多，可先用丙酮、甲醇等亲水性溶媒提取，过滤，滤液再用无水硫酸钠脱水，同时也降低了有机磷农药在水中的溶解度，然后再用石油醚等溶剂振摇提取一些极性较弱的有机磷；用氯仿提取一些极性较强的有机磷。（3）液体检材：饮料、水、尿等。可用等容的苯或氯仿提取三次，合并提取液，用无水硫酸钠脱水，过滤，滤液挥去有机溶媒，浓缩近干，供试。（4）内脏组织：先将检材捣碎，然后移入研钵中，少量多次地加入无水硫酸钠，研磨，直至呈干沙状，再转移入烧瓶中，用苯或氯仿提取，过滤，滤液在低于60℃（5）含脂肪较多的检材：食油、油脂食品①水蒸气蒸馏法：将检材用10％酒石酸酸化，收集最初10分钟内馏出的馏液，可直接作试验，或收集馏液50～100毫升，用氯仿振摇提取，提取液置蒸发皿中，低温挥发至1毫升，留作试验。本法对分离提取对硫磷、敌百虫、乐果效果不好，对其它有机磷毒物采取减压蒸馏可提高提取回收率。②乙腈――正已烷提取法：检材先用60～80％乙腈提取液后，分出乙腈提取液，用6倍体积的20％硫酸溶液稀释，再用正已烷、石油醚、氯仿提取三次，合并提取液，经无水硫酸钠脱水滤液自然挥去溶剂，残渣供试。乙腈毒性较大，可用丙酮或二甲基甲酰胺代替，正已烷可用石油醚代替。（6）纯化：如果尸体腐败，检材条件差，或检材内毒物的量极微，提取液内的杂质可妨碍鉴别试验的结果，需将提取液浓缩后，经层析柱净化去除杂质。1）层析柱净化法：取30×1．5厘米下端带活塞的玻璃管1支，在管底放一团脱脂棉，管内加入2厘米厚的无水硫酸钠，然后填入氧化铝混合吸附剂（活性碳1克、硅藻土5克，中性氧化铝15克混合面成），最上层再加2厘米厚的无水硫酸钠，使用前层析柱管内先加满氯仿，打开下面活塞，待氯仿流至下端无水硫酸钠水平时，将浓缩的提取液加入，然后用100毫升氯仿洗脱，洗脱出的氯仿在室温下挥发浓缩后留作试验。混合吸附剂事先需经过如下处理：①中性氧化铝置400②硅藻土5克加浓硫酸1毫升，发烟硝酸1毫升，在研钵内研至无白烟为止。③酸洗活性碳：30克活性碳加150毫升浓盐酸，煮沸30分钟，过滤，用蒸馏水洗至PH为6.5～7.0，经120℃2）薄层层析纯化薄层纯化多用二次展开法。将点有有机磷检材的薄板先用单一的正乙烷、庚烷或石油醚等溶媒展开一次，这时有机磷基本上留在原点不动，而油脂类杂质远离原点。可更改溶媒再展开一次，这样就可使油脂与有机磷分开。刮下含有机磷部位的吸附剂，用苯或氯仿等洗脱，然后挥去溶媒，供试。三、常见有机磷农药的颜色鉴别反应1.BTB试纸快速筛选法原理：胆碱酯酶可使乙酰胆碱分解，产生胆碱和乙酸，会使溴麝香草酚蓝试纸由蓝变黄。但有机磷农药存在时，便抑制了胆碱酯酶的活，则乙酰胆碱积存不再被分解，使之少产生或不产生乙酸，其降低程度由BTB试纸的颜色变化程度来表示。将试纸与标准色斑比较，便可测知酶的活力，以此来判断是否含有机磷农药。试剂：BTB试纸称取溴麝香草酚蓝0.14克，溴化乙酰胆碱0.23克，加20毫升无水乙醇溶解，以0.4N氢氧化钠调节PH7.4～7.6(呈灰褐色)。将滤纸浸入该液中，取出晾干(应变桔黄色)，贮于棕色瓶中。或剪成1×1.2厘米的纸片，用锡纸包好，再用塑料薄膜密封。操作：取BTB试纸两片分置于玻片两端，一端纸片中央加中毒者末梢血一滴，另一端加正常人末梢血一滴，标记后，立即加盖另一玻片，用橡皮筋扎紧，迅速放恒温箱中37[注解]（1）检液的酸碱度以近中性或弱碱性为好。应注意防止周围酸蒸气的干扰。（2）玻片要洁净而又干燥，防止酸碱污染，影响测定效果。（3）血液要滴在纸片中央，血滴不可过大或过小。血斑直径以0.6～0.8厘米为宜。（4）应作对照试验，以正常人血(空白)和已知有机磷农药分别作空白试验与已知对照试验。要注意试纸如变质失效就不可用了。酶活力判定表BTB试纸颜色酶活力中毒程度红色80～100％正常紫红色60％轻度中毒深紫色40％中度中毒蓝色20％严重中毒2．含硫代磷酸酯类有机磷的颜色鉴别反应（1）亚硝酰铁氰化钠反应：1059、3911、1240、4049、乐果等有机磷农药被碱水解后所生成的硫醇化合物，与亚硝酰铁氰化钠作用，在酸性溶液中，能产生红色，检出限度约0.1毫克／毫升。取经精制的乙醇试液，于低温下蒸去溶剂，酌情加少量蒸馏水（约1～2毫升），加2滴5％亚硝酰铁氰化钠（新鲜配制），5滴10％氢氧化钠，充分振荡，置30℃此反应欠灵敏，条件较为严格。水解时加碱不可过浓，时间不可过长，温度不可过高，根据实验证明，30℃（2）亚硝酸反应：1059、3911、1240、4049、乐果等有机磷农药被碱水解后所生成的硫醇化合物能与亚硝酸作用生成亚硝基化合物，该化合物在汞离子（Hg＋＋）存在下水解，又能释出亚硝酸，与Griess试剂作用，生成紫红色偶氮化合物。取经精制的乙醇试液1～2毫升，加0.4N氢氧化钠5毫升，在35～40℃水浴中放置10分钟进行水解，加亚硝酸溶液（临用前将1N硫酸和0.01N亚硝酸钠溶液按9：1混合）5毫升，加时应由管的中央直接加到溶液中。以免沾到管壁上，影响结果。放置10分钟，加25％尿素溶液1毫升，振摇10分钟，加氨基苯磺酸溶液1毫升，混合后加入饱和二氯化汞溶液0.2毫升混合，再加a－萘胺溶液1毫升，混匀，在37—38℃本反应较为灵敏，灵敏度为0.025毫克，还可用作定量试验。本法的关健在于加尿素去除过剩的亚硝酸，一定要彻底去除干净，否则极易出现假阳性。同时，每次必须作空白试验加以对照。（3）对硫磷（1605）偶氮染料反应：对硫磷的硝基用锌粉和盐酸还原成胺基后，用亚硝酸盐和盐酸进行重氮化。加氨基磺酸胺除去剩余的亚硝酸，最后与N-1-萘基乙二胺偶合，产生紫色，检出限度约5微克∕毫升，或与β-萘酚碱液偶合，产生橙黄色，灵敏度较差。取试液约2毫升，加等量蒸馏水，6N盐酸2滴，锌粉0.2克，然后置40℃如用l％碱性β-萘酚代替N-l萘基乙二胺，则呈橙黄色。在还原过程中，如加2％硫酸铜2—3滴，则可不加热，只静置10分钟。此反应非1605所专有：芳香族硝基和伯胺化合物，如硝基苯，苯胺及磺胺类药物均能产生阳性反应。3．不含硫代磷酸脂类有机磷的颜色反应（1）间苯二酚-氢氧化钠反应：敌敌畏、敌百虫取上述馏液1滴至滤纸上，加1％间苯二酚酒精液1滴及5％氢氧化钠醇液1滴，置小火加热片刻，如有敌敌畏则出现红色斑点，但敌百虫也出现红色斑点，须加鉴别。间苯二酚-氢氧化钠试剂可制成试纸备用：取间苯二酚l克，溶于50毫升酒精，另取氢氧化钠5克，溶于0．2％聚乙烯醇水溶液中，两液混合后，将滤纸浸入，浸透后取出。除去多余液体，温箱干燥，切成纸条备用。用时将纸条沾取胃液少许，略微加温，即显红色斑。(制成的试纸密封保存最多两个月)。（2）碘化铋钾试剂反应：取上述馏液l滴，置滤纸上，喷以碘化铋钾试剂，敌敌畏呈橙红色，而敌百虫无反应。（3）甲醛硫酸试剂反应：取上述馏液1滴，置反应板上，干后加1滴甲醛硫酸试剂（40％甲醛3滴，加入3毫升浓硫酸中），敌敌畏呈桔红色。而敌百虫呈黄褐色。四、有机磷农药的薄层色谱分析（一）薄层扳硅胶G板，或硅胶CMC板。（二）展开1．硫代磷酸酯类常用展开剂（表12—2）（1）石油醚：丙酮（4：1）（2）正已烷：乙醚（9：1）（3）氯仿：乙醚（9：1）（4）氯仿：环已烷（1：1）（5）苯：石油醚：丙酮（7：2：1）常见有机磷农药簿层色谱上Rf值（硅胶G）展开剂有机磷农药环已烷：丙酮（1：1）环已烷：氯仿（1：1）苯：环已烷（4：1）苯：石油醚：丙酮（7：2：1）石油醚：丙酮（4：1）敌敌畏敌百虫乐果对硫磷甲基对硫磷内吸磷三硫磷治螟磷乙硫磷甲拌磷亚胺硫磷马拉硫磷杀螟松双硫磷辛硫磷70.550.390.3，0.720.720.630.650.31，0.770.27，0.580.360.440.330.550.300.090.000.460.370.57，0.590.56，0.66，0.850.570.48，0.380.620.22，0.520.22，0.54，0.630.400.350.550.100.000.620.460.03，0.550.85，0.910.700.50，0.700.650.16，0.600.150.520.390.720.420.400.100.880.820.41，0.870.960.950.890.960.800.680.840.770.910.140.550.450.640.700.680.350.750.250.510.450.592．敌敌畏和敌百虫常用展开剂（1）庚烷：丙酮（6：4）（2）庚烷：丙酮（1：1）（3）石油醚：醋酸乙酯（1：1）敌敌畏和敌百虫常用展开剂展开剂农药庚烷：丙酮（6：4）庚烷：丙酮（1：1）石油醚：醋酸乙酯（1：1）敌敌畏敌百虫0.440.290.690.450.670.18(三)显色（1）试剂配制①酶溶液：任选下面一种A、新鲜人或动物血清，市售冻干马血清亦可，用前按1：4用水稀释。B、新鲜动物（如小白鼠）肝组织匀浆上清液，（将白鼠肝组织按l：9用水研磨成匀浆，离心，取上清液，贮于冰箱备用）。用前按1：4至l：9用水稀释。②酶作用液A、取10毫克β醋酸萘酯溶于8毫升乙醇中。B、取40毫克快蓝B(FastbluesaltB)溶于32毫升水中。用前：两液混合即可，但溶液必须澄清。（2）操作方法：将分离提取浓缩液点样，展开后的薄层板置溴气(5％溴-四氯化碳液)中处理30～60秒钟，取出，将溴挥掉后（对不含硫的有机磷农药的DDVP等可以不经过溴处理）喷酶溶液一层，使表面均匀湿润为度。置保温盒内，放37℃温箱30分钟，取出，再喷酶作用液，阳性处显色斑，若不明显可再置37酶抑制试验可作为有机磷农药的筛选方法，阴性结果可排除有机磷毒物的存在，而阳性结果不能肯定是有机磷类毒物，因为能抑制胆碱酯酶的物质很多，尚需进一步做确证试验。2．硫代磷酸酯类有机磷的显色方法（1）二氯醌氯亚胺-溴法将已展开后的薄层板稍晾干，立即喷0.5％二氯醌氯亚胺醇液，然后于溴蒸气中熏1分钟，1605、甲基1605显红色，1059显黄色，其它含硫有机磷显橙红色。（2）溴-刚果红法经展开后的薄层板稍干后，于溴气缸内熏1分钟，取出挥去多余溴（一定要挥尽，否则背景也为蓝色），再喷0.4％刚果红溶液，合硫有机磷显蓝色斑点，背景桃红色。（3）氯化钯法经展开后的薄层板稍干后，淡气熏蒸1分钟后，喷0.5％氧化钯液，有机磷显黄色斑点。3．敌敌畏和敌百虫的显色方法（1）间苯二酚氢氧化钠法将展开的薄层板晾干后，喷间苯二酚-氢氧化钠溶液（1％间苯二酚乙醇液和5％氢氧化钠溶液，二者临用前等量混合），敌敌畏、敌百虫显红色，如显色不明显可稍加热促进显色。（2）碘化铋钾法将展开晾干的薄层板喷碘化铋钾液，敌敌畏显橙红色，敌百虫不显色。五、气相色谱法应用气相色谱法进行有机磷农药的定量分析，方法简便而准确，一般采用分配气相色谱法，由于峰高或峰面积受柱温、载气流量、操作中误差的影响，所以多采用内标法，即在注入色谱柱前，加入内标物，经色谱分析后，在记录图上求得被测物与内标物的峰高或峰面积比，在事先做好的标准曲线上查出被分析农药的含量。〔器材〕1．气相色谱仪。2．微量注射器3．玻璃色谱柱（2米）〔分析条件〕1．火焰光度检测器，量少时可用氮磷检测器2．固定液：2.5％QF—l和5％DC一2003．担体：chromosorbWAWDMCS4．柱温：2005．检测器温度：220℃6．气化室温度：230℃7．载气：N22.4kg(78ml／分)8．燃烧气：H21.1kg(62ml／分)9．空气：0.36kg(150m1／分)〔操作〕将检材（胃内容物）2g置于蒸发皿中，向其中加入内标物，按前述方法进行同步提取净化(参照检材处理)，浓缩液取1μl注入气相色谱仪。配制一个系列浓度的标准液，向其中加入相同浓度的内标物，取1μl注入气相色谱仪，求出标准液峰面积与内标物峰面积之比值并与标准液浓度做一曲线求算出检材中有机磷农药的峰面积与内标物峰面积的比值，在上述曲线上即可查出相应的浓度。〔注解〕（1）在进行定量分析之前必须对色谱峰进行定性鉴别，方法是与各个标准品色谱的保留时问加以对照，必要时可在两根色谱柱上进行。（2）由于气相色谱法灵敏度高，应选用较高纯度的化学试剂。附：试剂配制1．氨基苯磺酸溶液：氨基苯磺酸0.1克，溶于25毫升l0％醋酸中，必要时略微加温。2．a一萘胺溶液；a一萘胺0.1克，溶于50毫升10％醋酸中，必要时加热，如有出现兰紫色沉淀，则去渣，留无色溶液备用。3．0.5％N—l萘基乙二胺溶液：N一1萘基乙二胺0.5克，溶于100毫升水中，加少许稀盐醋酸化。4．1％β-萘酚l克，溶于10％氢氧化钠溶液100毫升中(用前新配制)。5．5％氢氧化钠醇液：氢氧化钠5克，溶于100毫升95％乙醇中。6．1％间苯二酚乙醇液：间苯二酚l克，溶于100毫升95％乙醇中。7。0.5％二氯醌亚胺醇液：0.5克二氯醌氯酰胺溶于100毫升95％乙醇中。8．0.4％刚果红溶液：0.4克刚果红溶于100毫升50％乙醇溶液中再加2～3毫升5％氢氧化钠溶液混合。9．氯化钯试剂：取11毫克氯化钯溶于25毫升0.1N盐酸中。拟除虫菊酯类农药的检验目的要求：了解拟除虫菊酯类农药理化性质与毒性，掌握其分离提取原理和常规的检测方法。一、检材的采取对于此类毒物中毒者，可取其吃剩余的食物、呕吐物、初次洗胃液；中毒死亡者取其胃内容物，血液和脑、肝等检材为宜。二、检材的分离提取1．分离原理：此类农药对哺乳动物毒性较小，微溶或不溶于水，溶于乙醇、苯、丙酮、氯仿、二氯甲烷乙醚等大多数有机溶剂中，遇酸较稳定，在碱性介质中分解较快。拟除虫菊酯类农药大多极性较低，提取液常选用混合溶剂。2．快速提取：取检材剪碎，加无水硫酸钠于研钵内研至粉状，置三角烧瓶中，用氯仿：乙醚（1：1）混合液浸泡检材，置于振荡器上，振荡10分钟，如此反复浸提三次后，收集提取液，脱色、脱水、过滤、低温（60℃三、颜色反应1．普鲁士兰反应．①原理：氰戊菊酯所含的杂质带有氰基团，在酸性条件下与碱性硫酸亚铁作用，再经酸化处理可生成普鲁士兰。②操作方法：直接取检材置于三角瓶中，加蒸馏水至检材微浸没或使其呈稀糊状，加10％H2SO45ml，瓶口复盖一张滴有硫酸亚铁-氢氧化钠的滤纸，微火加热半小时，取下滤纸，用稀盐酸酸化，滤纸上产生普鲁士兰色。2．碘化铋钾试剂显色：本类农药大多数能与碘化铋钾试剂反应显橙红色。操作方法：将提取的残渣用少许氯仿溶解后，用毛细管吸取适量滴加在滤纸上，加一滴碘化铋钾试剂，即显橙红色或桔黄色斑点。四、薄层色谱分析法吸附剂用硅胶G或硅胶GF254。展开剂宜选用弱极性的正已烷为基础，用中等极性的有机溶剂调节极性。例如有五种展开剂对常见的几种拟除虫菊酯类杀虫药的展开比移值见表13－1拟除虫菊酯类杀虫药的分子中有发色团扣助色团，能吸收紫外光；于硅胶GF254板上点样展开后，在254nm的紫外灯下可见亮绿色的荧光背景上有暗色斑点。也可将展开后的薄层板挥去溶剂用以下方法显色：（1）薄层板上喷0.5％邻联甲苯胺乙醇液，含氯杀虫药显绿色，背景白色，灵敏度3～5μg。（2）显色剂用1g邻联甲苯胺溶于10ml冰乙酸中，4g碘化钾溶于10ml水中，将两液混合后加水稀释至1L。先在氯气发生器中用10g高锰酸钾加5ml浓盐酸使产生氯气，将薄层板放置其中熏30s后，取出再喷显色剂。拟除虫菊酯类杀虫药显蓝色，背景为白色。灵敏度1～5μg。卤代有机化合物有干扰。（3）喷上0.8％KMnO4水溶液，背景紫红色，斑点显浅黄色。将薄层板置于溴蒸气中熏约1min后，黄色斑点颜色加深。再喷0.4％刚果红乙醇液，背景棕红色，斑点显蓝色。灵敏度0.5～5μg。有还原性的物质都能被KMnO4。氧化而显色。拟除虫菊酯类显色灵敏度较低，经溴熏后，颜色加深。用刚果红试剂喷后，斑点颜色不易褪去，可存放多日。（4）薄层板上喷2：1磷酸水溶液，在110℃烤5～10min，再喷5％磷钼酸乙醇溶液，在110℃再烤2～5min，拟除虫菊酯杀虫药呈黑蓝色，背景为浅黄色。灵敏度3～5（5）喷0.5％硝酸银氨性溶液，再用紫外光照射5min，含卤素的拟除虫菊酯杀虫药呈灰至棕色斑点，背景白至浅灰色。灵敏度3～5μg。（6）碘化铋钾试剂显色：呈橙红色或桔黄色斑点。拟除虫菊酯杀虫药的薄层层析Rf值杀虫药已烷：苯（45：55）已烷：乙醚（50：10）已烷：丙酮：苯（9：1：1）已烷：乙醚：甲酸（70：30：1）已烷：乙酸乙酯（19：1）溴氰菊酯氯氰菊酯氰戊菊酯二氯苯醚菊酯0.720.130.260.640.860.680.760.860.460.360.460.540.410.510.690.540.410.470.530.420.670.770.830.740.810.870.990.670.590.680.660.250.780.710.410.560.640.760.630.860.730.740.93实验七杀鼠剂的检测（I）——磷化锌、敌鼠、的检验目的要求：熟悉磷化锌检材的分离提取特点，掌握分析鉴定方法。了解敌鼠、安妥的理化性质，检材处理和鉴定要点。一、磷化锌的检验1．检材的采取磷化锌比重较大，呈灰黑色粉末，一般沉淀于中毒者的胃底部，取材应注意最好取中毒者的剩余食物、胃内容物、肠内容物做毒物检验。了解因敌鼠钠中毒潜伏期，应取血尿或脏器等进行检验。磷化锌可分为检测磷化氢和检测锌离子两部分。检验磷化氢成分时，无需分离，可以用加酸后检查逸出的磷化氢气体，检验锌的成分时，则需先行有机质破坏，而后检验锌离子。2．磷化氢的检测：硝酸银试纸法或溴化汞试纸法利用顾特蔡氏测砷装置，瓶内装适量检材，加蒸馏水调成稀糊状，中间管亦装入醋酸铅棉花，上管插入硝酸试纸（以滤纸条浸10％硝酸银，于暗处晾干备用，瓶内加1：1硫酸5～10毫升，立即塞紧瓶塞，放暗处，如有磷化氢存在，半小时后即变黑褐色，如与溴化汞或氯化汞试纸作用则生成鲜黄色。此法灵敏，但硫化氢对本反应有干扰。3．锌的检测有机质破坏可用灰化法，取内脏检材5～15克，置坩锅中。先在电炉上炭化，再置高温电炉600℃(1)双硫腙法将部分灰化液用氢氧化钠碱化取2滴，置于一小试管内，加二苯硫代偕肼腙试剂2滴，振摇。四氧化碳层则由绿色变为紫红色。若有0.9微克锌离子存在即能检出，故十分灵敏。但许多金属也能引起此颜色反应，常必须在碱性溶液中进行方为锌特效反应。(2)亚铁氰化锌沉淀反应取部分灰化液加稀醋酸酸化，加5％亚铁氰化钾溶液，生成亚铁氰化锌白色沉淀，沉淀不溶于稀酸，可溶于碱液中。二、敌鼠的检验(一)检材的分离提取检材如是胃内容物，食物、呕吐物等，可经捣碎后先用乙醇温浸、提取，然后挥去乙醇，残渣再用无水乙醇溶解，滤去不溶物，醇液经浓缩后，过中性氧化铝纯化柱，用氯仿洗脱，收集氯仿液，挥去氯仿，残渣供试。如检材是液状体，可先加稀盐酸酸化，于分液漏斗中，用氯仿振摇提取，将提取液浓缩后通过中性氧化铝纯化柱，再用氧仿洗脱，收集洗脱液，挥干残渣供试。内脏组织(肝、肾等)，可先将捣碎然后放于具塞三角烧瓶中，用2N硫酸酸化后用40毫升乙醚振摇提取10分钟，静置分层分出醚液，再将检材用20毫升乙醚提取一次，合并两次乙醚提取液于分液漏斗中，用50毫升1％焦磷酸钠分两次反提醚液，合并焦磷酸钠提取液于另一分液漏斗内，弃去醚液，再用50毫升乙酸乙酯分两次提取焦磷酸钠溶液，弃去焦磷酸钠液，乙酸乙酯液用10毫升1％氢氧化钠液洗一次，再用10毫升蒸馏水洗一次，然后移入蒸发皿中，于水浴上蒸干残渣供试。(二)分析方法1．颜色反应三氯化铁试验：提取的残渣溶于乙醇，加1～2滴1％三氯化铁，溶液呈红色，加氯仿振摇，氯仿层显红色。也可直接将残渣液滴加在白磁反应板上，干后加l％三氯化铁试剂1～2滴，显砖红色。2．薄层色谱法(1)薄层板：硅胶G或硅胶CMC板。(2)展开剂：①氯仿：醋酸乙酯：乙醇(4：2：1)②四氯化碳：丙酮2：1③四氯化碳：乙醇=2：1(3)显色①1％三氯化铁乙醇液：敌鼠呈红色斑点。②甲酸能使敌鼠显红色，故用含甲酸的展开剂展开时，可见红色斑点上升，不必再用其它方法显色。杀鼠剂的检测（Ⅱ）——氟乙酰胺、毒鼠强的检验目的要求：掌握氟乙酰胺、毒鼠强中毒案例中检材的采取以及常用的分析鉴定方法。一、氟乙酰胺的检验1．检材的采取最好取剩余食物、胃内容物、初次洗胃液，呕吐物等体外检材最佳，其次是血液或脏器。氟乙酰胺是水溶性检材，通过肾脏随尿液排泄，所以尿是比较理想的检材。2．中毒原因由于氟乙酰胺、毒鼠强对人畜的毒性极大，因此多年前就被我国禁止生产和使用。但又因其杀鼠效果极佳，生产工艺简单，成本低，目前仍有不少地下工厂私自违法生产，作为杀鼠剂投放市场，造成许多中毒事件的随之发生。对于氟乙酰胺、毒鼠强的检材，目前报道的方法较多，现将公安部第二研究所对这两种杀鼠剂检测方法介绍如下：氟乙酰胺的检验程序1．所用试剂：甲醇，10％氢氧化钠溶液，50％硫酸锌溶液，50％氢氧化钠溶液，硫代水杨酸，5％铁氰化钾溶液。2．步骤：（1）浸泡过夜：送检呕吐物5～10克即可；送检胃内容物10～20克；送检胃，肝或肠取20～30克；猪、羊、狗或牛、马及其胃内容物或饲料应取40克以上；中毒者吃剩的食物应取30克左右；送检饮料器皿如酒瓶之类，应取整个食物，脏器均剪碎后用甲醇：水（7：3）通常以100毫升浸泡过夜为宜，具体视送检检材情况而定。最少浸泡6～8小时，通常过夜，特别是腐败检材，溶液浸泡宜长不宜短。（2）过滤挥干甲醇：空白添加FCH2CONH2500微克，将所浸泡的检材溶液过滤（用普通滤纸即可）后，用10％氢氧化钠调PH值为8～9之后，将滤液置水浴锅上挥干甲醇，水溶液温度以控制在80度以内（通常使滤液总体积在3～5毫升左右），挥干甲醇过程中，要常注意溶液的PH值变化。（注意：凡中毒者生前的饮料之类干净液体可以不经过上述两步，直接视检材情况而可以做后面的硫靛反应）。（3）50％ZnSO4沉淀蛋白：将上述挥干甲醇的检材滤液（一般3～5毫升）中加50％ZnSO4，量一般为4～5滴管，并一定要充分搅拌，使之沉淀蛋白完全！静置一分钟左右逐滴滴加50％NaOH（此时切忌搅拌！）待整个器皿中出现“豆腐脑”状沉淀物时（PH值约为7），亦证明沉淀完全之后再滴加50％NaOH（即过量碱），使原沉淀物又呈液状（PH值约为14）。（4）离心上述沉淀物，一遍即可。（5）硫靛反应：在上述检材离心液中加硫代水杨酸100毫克（视检材情况），充分搅拌，使之全溶。（6）高温反应：在电烘箱中（温度为140度）烘烤13～14小时，注意器皿应加盖以防爆沸。（7）铁氰化钾反应：取出烘箱中检材，用少量蒸馏水溶解后，加50％铁氰化钾，边加边搅拌，直至蒸发皿中呈现粉红色为宜。置试管中，加入1～2毫升氯仿，离心后可在试管底部呈现红色沉淀物。（8）薄层色谱反应：用氯仿或氯仿：苯（4：1）或苯：丙酮（4：1）作展开剂，此法不用显色剂！二、毒鼠强的检测（一）检材的提取和分离将含有毒鼠强的血液或脏器、食物残渣等检材，捣碎后加无水硫酸钠内研至干粉状，置三角烧瓶内，用苯浸泡检材，置振荡器上振荡10分钟，如此反复提取三次后，收集提取液，脱水、脱色、过滤，置低温水浴上挥发干溶剂，得残渣供检验用。如检材为液体，可直接用苯于分液漏斗中萃取（如需要可用中性柱层析法进一步净化）。(二)检验方法1．薄层色谱法（1）薄层板：高效硅胶GF254薄层板（2）展开剂：苯：乙酸乙酯（4：1）Rf＝0.79环己烷：二氧六环（1：1）Rf＝0.71苯：环己烷：乙酸乙酯（5：2：2）Rf＝0.58环己烷：乙酸乙酯：二氧六环（5：2：2）Rf＝0.76（3）显色1）UV254灯下观察检材斑点与标准品斑点进行对照。2）碘化铋钾试剂显色：毒鼠强遇碘化铋钾试剂后呈暗黄色斑点。2．气相色谱法GC/FID的色谱条件3％OV－17（2m×2mm）玻璃填充柱，氢气30Psi，空气40Psi，柱前压40Psi，进样口280℃，检测器的温度为300℃，柱温200℃实验八金属毒物的检测目的要求：通过实验进一步理解常见金属毒物的分离和检测原理，掌握常见金属毒物的筛选定性方法和砷化物的定量分析方法。一、检材的采取急性砷、汞中毒，可直接取中毒者的呕吐物，排泄物，剩余食物等检材直接进行铜片法实验进行筛选。对于毛发、指甲、骨骼以及血液，肝、肾等生物检材，则应首先进行有机质破坏后，再采用高灵敏度的原子吸收光谱进行检测。二、砷、汞化合物的常见定性定量分析方法1．铜片试验法(Reinschs法)〔原理〕在盐酸溶液中，砷、汞等金属能与金属铜作用而沉积在铜的表面，使其变色，表面沉积物的色泽因元素的不同而异，可初步对毒物予以识别。〔操作方法〕将剪碎或捣碎的检材10克左右置入锥形瓶中，加蒸馏水调稀至20毫升，加入浓盐酸5毫升，摇匀；放入2～3片剪成0．3×1cm的铜片，将烧瓶在小火上煮沸30分钟，并随时观察铜片表面是否变色。如铜片变黑色，表明可能会有砷；如为银灰色，则可能含有汞。注意事项（1）除砷、汞以外，锑、铋、硒、硫等化合物也可能在同样条件下与铜作用，使铜变色，尤其是硫化物普遍存在于腐败检材中，其也可能使铜片变成黑色，经常干扰反应。（2）试验中盐酸酸度必须保持溶液含2～8％盐酸，不应用氧化力较强的硝酸或硫酸，如酸度过高则砷、汞等易挥发损失，酸度过低则反应不能进行，易造成假阴性结果。（3）反应过程中如发现铜片明显变黑，可停止加热，取出铜片，防止长时间煮沸造成沉积物脱落。（4）所有试剂均不含砷（或汞），应同时做空白和已知样品的对照试验。2．升华试验〔原理〕砷经加热即氧化升华，遇冷凝集成三氧化二砷八面体或四面体结晶。汞加热升华，遇冷凝集成黑色不透明的圆球。〔操作方法〕将所得的变色铜片，用水和酒精轻轻洗去附着杂质，将铜片置于一小干燥试管(0.6×6cm)内，倾斜45度角。在酒精灯上小心加热试管底部．待铜片开始变色或有烟雾升起时，立即离开火焰，冷后倒出铜片，将小试管置显微镜下观察结晶体。〔注意〕锑、硒加热后生成的氧化物不易升华，铋和硫化物不能升华。3．砷化物定量分析砷化氢――溴化汞试纸法(Gutzeit氏改良法)〔原理〕砷的氧化物，经新生的氢气还原成砷化氢，随氢气逸出，与溴化汞试纸作用，生成黄色至棕色斑点，色斑颜色深浅及长度与砷的含量成正比，利用检材样品试纸条上生成的砷斑长度与标准砷斑长度比较即可算出检材中的砷含量。AsH3+3HgBr2→2HBr+AsH(HgBr)2(黄色)AsH3+3HgBr2→3HBr+As(HgBr)3(黄棕色)〔操作方法〕（1）取呕吐物、剩余食物等检材加水稀释至适当量(20～50毫升)，装入瓶中(图3—1)。加5毫升无砷浓盐酸，5毫升15％碘化钾，4滴40％氯化亚锡，放置15分钟，以还原5价砷成3价砷。中间管内松松地装入醋酸铅棉花(脱脂棉浸入10％醋酸铅溶液中，取出拧至半干)，用以吸收硫化氢，以避免颜色干扰。上管内插入溴化汞试纸条(120×2．5毫米大小之滤纸条浸入5％溴化汞酒精溶液中5分钟，取出凉干)。加3克锌粒于瓶中，迅速塞紧瓶塞，30分钟后，观察溴化汞试纸上有无棕黄色斑形成。注意定量测定时，各装置瓶内都必须保持最后相同的终体积。如图3—1所示。（2）标准砷溶液的制备在分析天平上称取三氧化二砷0．261克，加10毫升10％氢氧化钠溶液溶解，加适量水稀释，加10％HCL使之微变为酸性，再在容量瓶内加水稀释至1000毫升，即每1毫升含1毫克的砷