液相色谱柱的选择和方法开发

液相色谱柱的选择和方法开发

内容概要色谱根本概念回忆色谱柱类型、选择和方法开发制备液相混合固定相----优化复杂样品别离的一个新策略如何改善强水溶性化合物的保存和别离色谱根本概念回忆

色谱〔chromatography〕色谱原理色谱分类：气相/液相和高效液相〔HPLC〕；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相色谱功能：分析〔种类/定量〕，纯化液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器〔阀〕，色谱柱，柱温箱，检测器〔流通池〕幻灯片制作：WSY18别离度

Rs-ResolutionN–TheoreticalPlateNumberα–Selectivityk–RetentionFactor拖尾幻灯片制作：WSY181.SeparationofCompoundsAandB灵敏度ＬＯＤ：LimitofDetectionＬＯＱ：LimitofQuantification－柱效－峰形〔拖尾因子〕

重现性别离度〔Ｒ〕－保存时间〔Ｖ，Ｔ，Ｋ〕－选择性〔α〕－柱效〔Ｎ〕灵敏度

色谱柱类型、选择和方法开发色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响别离度?-选择性〈键合类型，基质外表特性；流动相、温度-柱效〈保存体积，粒径，柱长，基质外表特性；流动相，温度，上样量，流速峰对称性?基质外表特性，键合类型，流动相，温度保存体积?柱长，孔隙率，比外表积，基质外表特性，键合类型；流动相，温度灵敏度?粒径，基质外表特性，键合类型；流动相，温度稳定性和重现性?基质外表特性，键合类型；流动相，温度流动相?pH，缓冲盐种类，溶剂；影响色谱柱性能的主要因素1、色谱柱的构型色谱柱内径色谱柱长度2、固定相柱填料粒径比外表积孔径孔隙率基质外表特性：-外表活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量-耐碱性键合类型-官能团、是否封尾-键合相的保存行为、耐酸性色谱柱的构型对色谱柱性能的影响色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径色谱柱尺寸对色谱别离的影响：•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低

•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长•窄径柱(2.1mm)–满足检测器和样品量限制•宽径柱(3-7.8mm)-载样量高，抗污染，寿命

制备柱(内径>10mm)–用于纯化制备柱填料对色谱柱性能的影响柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径

硅胶粒径和类型对柱效的影响d硅胶粒径和类型对压力的影响柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II

目前市场主要可供选择的填料粒径1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪2.7μm－多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速别离(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常规分析颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高.柱填料对C18色谱柱性能的影响：比外表积

每克填料的外表积，与粒度，孔径有关比外表积大，保存增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)根据需要选择适宜的比外表积柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I

多孔材料的95%以上外表在孔内部样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部孔径至少是样品流体学直径的4倍300Ǻ孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II

由于小孔径填料比外表积大，小分子的保存值在小孔径填料通常更大条件： C8色谱柱，4.6×150mm， 3.5um，A溶剂，0.1%TFA水溶液；B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－

水中；20min梯度，10 30%B；60°C， 1.5ml/min柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I2.3-二羟基萘2.7-二羟基萘TF=1.31BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mm

BrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mm

VenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmBrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流动相：

甲醇：水=65：35流速：

1mL/min温度： 35℃检测波长： 230nm进样量： 20μL硅胶纯度－金属含量硅胶基质类型及开展史TypeA：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料来源：有机硅烷〔四乙氧基硅烷〕水解/烧结/酸洗杂化及外表杂化整体柱壳层柱柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II

硅胶纯度－金属含量d固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响剩余硅羟基的影响普通硅胶当流动相的pH值大于4.5-5.0时，外表的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。解决方法封尾双层外表修饰外表杂化固定相对色谱柱性能的影响：剩余硅羟基的影响封尾键合填料与小硅烷进行后续反响，如三甲基氯硅烷，反响掉局部剩余硅羟基，以增加外表覆盖率。缺点：不能完全反响〔仍有50%的硅羟基未被反响〕在pH<3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好TMS固定相对色谱柱性能的影响：剩余硅羟基的影响不同长度和体积的键合相对外表覆盖率的影响固定相对色谱柱性能的影响：剩余硅羟基的影响双层外表修饰降低外表硅羟基活性，硅胶外表更加均匀固定相对色谱柱性能的影响：剩余硅羟基的影响硅胶双层外表修饰后新增加外表层硅羟基活性更低－新硅羟基pH=5.2，普通硅羟基pH约为3.5更对称的峰型，提高柱效，提高灵敏度硅胶外表更均匀－硅胶微晶形成过程中的不光滑外表被覆盖重现性更好外表纯度更高－硅胶金属杂质被覆盖极性化合物保存和别离更好键性化合物峰形比照

Testconditions:Columndimension:4.6mmx150mmSample:doxepin,nortriptyline,trimipramineamitriptylineMobilephase:Acetonitrile/0.01Msodiumphosphate(pH=6)=70/30Temperature:30oCFlow:1mL/minDetection:UV254nmBrandAC18(non-endcapped,)C18(non-endcapped,twin-layerASBC18ZorbaxSBC18SaponinsExtract

4.6x150mmcolumn,1%formicacid/MeOH=80/20固定相对色谱柱性能的影响：剩余硅羟基的影响双层外表修饰代表产品：VenusilMPC18，VenusilASBC18，VenusilHILIC0.01ng/mLPseudoephedrineAgelaVenusilASBC18,2.1×50mm,5µmBrand

A

C182.1×50mm,5µmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5µm固定相对色谱柱性能的影响：键合类型A纵向交联：保存和选择不稳定B横向交联：宽pH适用，Durashell，GeminiC单体键合：重现性好，柱效高D单体〔空间保护〕：低pH稳定〔ZorbaxSB，VenusilASB〕Ｅ极性官能团嵌合反相固定相(ZorbaxBonusRP,VenusilHLP)固定相对色谱柱性能的影响：

基质外表特性+键合类型〉反相键合相的保存行为同一厂家相同硅胶基质的反相柱：保存值随含碳量的增加而增加比外表积越大，保存值越大键合碳链越长，保存越大C18C8>C3>C1，长链之间差异不大≈反相键合相的保存行为不同厂家色谱柱的保存值，选择性与峰型色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈－0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰T0〔尿嘧啶〕固定相对色谱柱性能的影响：

基质外表特性+键合类型〉键合相的稳定性键合相的稳定性

低pH值，键合相流失高pH值，硅胶溶解影响色谱柱寿命，方法不重现

键合类型对键合相稳定性影响低pH值，键合相流失键合类型对键合相稳定性影响〔II〕空间位阻保护，延缓键合相流失空间位阻键合代表产品：VenusilASBC18ZorbaxSBC18固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性高pH值，硅胶基质溶解pH9时，色谱柱的稳定性固定相对色谱柱性能的影响：

键合硅胶的稳定性碳杂化，延硅胶缓高pH值水解外表碳杂化AgelaDurashellRPPhenomenexGemini杂化颗粒：Waters

Xterra外表碳杂化示意图pH=12条件下的稳定性4amines,ACN/1%Ammoniaaqueous=25%:75%,40oC,4.6x150mm,5um

1h200h总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件了解目标化合物的性质：结构〔官能团〕、pKa、分子量、浓度范围、溶解度、极性了解色谱柱的性质粒径，孔径，比外表积>保存强度和柱效；抗污染性基质外表特性，键合类型>保存强度，选择性，柱效，对称性，灵敏度，稳定性和重现性选择相应的色谱条件色谱柱选择〔ＩＩ〕替代：粒径，比外表，基质外表特性，键合类型相似新方法开发：－粒径：2umvs3umvs5um〔分析时间，灵敏度，仪器，价格，寿命〕－内径／柱长：内径3mmvs4.6vs7.8〔对别离影响不大，本钱〕；柱长与粒径相关－比外表：２００－４００〔低比外表耐污染，高比外表利于别离〕－孔径：在满足比外表前提下大孔径较好－硅胶基质外表特性：１〕尽可能使用高纯硅胶；２〕尽可能使用低酸性硅胶；３〕当流动相ｐＨ>９尽可能使用外表杂化；４〕使用多硅羟基残留，可加强对于极性化合物保存或削弱对于非极性化合物保存－键合类型：取决于选择性和流动相要求；具有一定极性的Ｃ１８〔ＭＰ－Ｃ１８〕可以作为首选尝试；耐酸：选择ＡＳＢ；耐碱：Durashell－封尾与不封尾：封尾削弱硅羟基影响；不封尾：提高硅羟基影响，增强极性物质保存，降低柱流失。ＳＢ－Ｃ１８ＭＰ－Ｃ１８ＭＰ－Ｃ１８乙腈／水乙腈／水乙腈／水,KH2PO4pH=4.2混合固定相----优化复杂样品别离的一个新策略混合固定相的意义

系统化的改变选择性，便于优化别离度；使难以在同一固定相上分析的强极性和非极性化合物得以解决降低离子交换柱的保存强度，降低缓冲盐浓度，从而使离子交换柱可以与质谱检测器相匹配混合相比例与保存时间曲线abc色谱条件ACN:50mMKH2PO4=30:70;1.5ml/min;240nm;5um,300A;4.6×250;2ul;Roomtemp.;样品：PhenolandmelamineSCXFig.aSCX:ASBC18=4：6Fig.bASBC18Fig.cRt(Phenol)/min2.2323.0073.790Efficiency(Phenol)/Plate5908890311931Rt(Melamine)/min7.3824.7482.082Efficiency(melamine)/Plate13123100176312通过混合柱改善别离度SCXSCX:ASBC8=9:1(B0014)HPLCconditions：ACN:50mMKH2PO4=30:70;1.5ml/min;35℃;20uL;Melamine:2ppm;column:4.6×250mm;降低缓冲盐浓度〔５倍〕以用于ＬＣ－ＭＳSampleMelamine(100ppm)LCConditions1ACN:50mMKH2PO4=30:70;1.5ml/min;240nm;5ul;5um,300A,4.6×250mmLCConditions2ACN:10mMKH2PO4=80:20;1.5ml/min;240nm;5ul;5um,300A,4.6×250mmFig.awastestedunderconditions1Fig.bandcweretestedunderconditions2abcSCXFig.aSCXFig.bSCX:ASBC18Fig.cRt(Melamine)/min7.06526.9987.577SPEproceduresFig.aLCConditionColumn:VenusilAS-TC18(SCX/C18〕2.1×150mm;5um,300ÅMobilePhase：ACN:Buffer=50:50;Buffer:10mMNH4Ac,HAcadjustpHto3.0240nm,0.2ml/min,10ulMassConditionESI，5KV;CapillaryTemp300℃,CapillaryVoltage15V;N2Flow35arb;PositiveiondetectionScanmode:TIC(MS),TIC(MS/MS);Range(m/z)50~140Condition3mlMethanolEquilibration3mlWaterLoading10mlSampleWashing3mlWaterWashing3mlMethanolElution6ml5%NH4OH/MethanolConcentrationEvaporatebyN2.Dissolvewith1mlmobilephaseLC-MSa标准曲线

Precision:RSD=2.83%

(n=5)Reproducibility：RSD=4.45%

(n=5)LOD:0.002ug/mLLOQ:0.01ug/mLRecovery:89.7%

RSD=7.3%

(n=9)空白样品

如何改善强水溶性化合物

的保存和别离改进水溶性化合物的保存和别离2，-0-甲基-腺嘌呤核苷HPLC方法RT样品峰=18.902minRT主杂质峰=21.024min主峰与后杂峰〔RT=20.634min〕的别离度R=7.81,主峰后杂峰〔RT=20.634min〕与主要杂质的别离度R=1.70色谱柱：MPC185um100Å4.6*250mm;波长：260nm;柱温：30℃;流速：1.0mL/min流动相：流动相A：0.63g甲酸铵溶解于900ml水中，并用甲酸调PH=3.00，再加水使溶液为1L,过滤即得；流动相B：乙腈样品：流动相A溶解，待别离样品1mg/mL；进样：5ul梯度表：时间（min）A(%)B(%)01000209010359010351000451000阿奇霉素有关物质检测空白药典方法样品，100%水次黄嘌呤有关物质分析色谱柱：MPC185um100Å4.6*250mm流动相：0.1%磷酸氢二钠溶液〔磷酸调节pH值至7.50〕流速：1.0ml/min柱温：室温波长：254nm样品：样品2.0mg/ml〔水溶解〕，对照品0.2408mg/ml〔客户原液〕进样：5ul键合相，原理和目的正相条件下与氨基柱比较TestinTraditionalNormalPhaseModeColumns:5um,4.6x150mmMobilephase:Chloroethane/methanol/water=91.8:8:0.2Sample:Toluene,Nitrobenzene,4-Bromoanilineacetate,3-nitroaniline

UnisolAmidelesspolarVenusilNH2ＨＩＬＩＣ别离模式N-acetouracil

uracilColumn:VenusilSilica,5um,4.6x150mmMobilePhase:10mmolsodiumphosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV254nmＨＩＬＩＣ别离模式N-acetouracil

uracilColumn:VenusilHILIC,5um,4.6x150mmMobilePhase:10mmolsodiumphosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV254nmN-acetouracilGanciclovirGanciclovirColumn:VenusilHilic,5um,4.6x150mmMobilePhase:10mmolsodiumphosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV254nm水溶性维生素别离TimeSamples:VB1,VB6,VC,VB2HPLCConditionsColumn:VenusilHILIC4.6x150mm,5umMobilePhase：0.1%TFA:ACN

=90:10Det:280nm;Flow:1.0mL/min;Temp:30℃；Inj:

2μLＶｅｎｕｓｉｌＨＩＬＩＣColumn,5μm,4.6mm×150mmPartNo.:ＶＨ951505-0BrandP,NH2Column,5μm,4.6×150mmBrandWSilicaColumn,5μm,4.6×150mmMobilePhase:A:0.1%TFAinWater；B:0.1%TFAinAcetonitrile

A:B=90:10FlowRate: 1mL/minTemperature: 30℃Detection: UV@280nmSample: VB1+VB6+VC+VB2

选择性比较VB1+VB6+VC+VB2VC+VB6+VB1+VB2VB1+VB6+VB2+VC稳定性比较

(aging:pH=7,20mMphosphatebuffer/MeOH=40/60;100h)100hVenusilHILIC

silicaVB1VB2VB1VCVB2VB1VCVB6VB2VB1VB2VB6VB1VB2VB1VB235h100hNH2DecitabineandImpurityAnalysisVenusilHILIC4.6×150mm，5μm，ACN：H2O＝96∶4，1ml/min，UV@244nm，roomtemp.AnalysisofAcarboseandImpurityACN:KH2PO4(4.4mmol/L)-Na2HPO4(2.0mmol/L)=70:30;1.5ml/min;35℃;210nm;VenusilHILIC，5um，100Å，4.6×150mmSeparationofShikimicAcid(3,4,5,trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylicacid

VenusilHILIC4.6x250mm,5um;ACN/1%formicacid90-60%in20min,ambienttemperature,1mL/min,UV210nmComparison:ValidamycinAtlantis-C18(AQ),4.6x250mm,TFA1%VenusilHILIC,4.6x250mm,ACN/water85-40%in30min,UV210nm博纳艾杰尔科技及其产品介绍

汪群杰WhoisAmerica-gel-AsiaTechnologies?核心业务别离材料固相萃取色谱纯化GPCHPLC分析生物分离手性分离解决方案固相萃取和色谱别离纯化设备创新成就梦想!全球最大色谱柱研发团队之一：归国博士4名；硕士12名，本科11名开发色谱相关设备和材料5大类〔液相色谱柱、固相萃取柱、快速纯化柱、全自动制备色谱仪、固相萃取仪〕，近百个系列，上千个规格的商业化产品；申报专利11个〔其中2个已获授权〕2006年10月成功主标科技部十一五重大支撑工程<<科学仪器研制与开发>>工程中的课题四“高性能色谱填料和色谱柱的研制〞；成功参标科技部十一五重大工程?科研试剂?工程中“固相萃取材料的研制与开发〞入围天津市2021年15个自主创新重大专项基质厂家键合厂家填装厂家销售公司我们在这儿！不断完善的质量保证体系

全球一体化的研发、生产、销售和效劳客户评价－Merck“theASBC18columnoutperformedanyothercolumnIcouldgetmyhandsonandIwasabletohandlethehundredsofCOMTcompoundsIwaspresentedwith.

〞McClainRayT.,Ph.DMerck&Co.,IncFriday,March20,2021

客户评价－Covance“ItestedformycompoundandfoundabetterSensitivityforASBC18columnthanregularlunaC182.1×50mm,5um.〞XiaorongLiang,Ph.DStaffScientistCovanceLaboratoriesInc.Thu,Mar19,2021

从样品前处理到分析、制备的全线产品

中压制备系统及制备柱CHEETAHFS-12021年即将建成的研发生产基地主要色谱柱产品尺寸规格：快速分析柱、分析柱、制备柱固定相-反相-正相-HILIC系列-离子交换-混合固定相〔Optimix〕-体积排阻-高聚物与多层结构相关的新型固定相UnisolC18:VenusilASBC18,UnisolAmide:DurashellRPAgelaUnisolC18具有高度适用性的反相色谱柱极性化合物保持良好的对称峰形LC-MS极高的灵敏度显著增强的对极性化合物的保存和别离能力100%水流动相兼容对生物基质的耐受性宽pH范围(1.5-9.0)碱性化合物优良的对称峰形1.Uracil2.Pyridine3.Butylparaben4.Naphthalene5.Acenaphthene6.AmitriptylineColumn:UnisolC18,4.6x150mm,5uMobilephase：MeOH：NaH2PO4/Na2HPO4〔PH7.0〕=70：30Temp.：30℃Detection：254nmInjection：10μLTF=1.09Plate=12046对极性化合物显著增强的保存和别离能力FreshColumn;Plates:3224Aftercolumnwashingandre-equilibriumin100%water(0.1%formicacid);Plates:3045After500sampleinjections;Plates:2810Sample:uridineofcalfbloodplasm(dilute20timeswith0.1%formicacid)Injection:1uLColumn:UnisolC182.1×50mm,5μmFlow:0.3mL/minMobilephase:0.1%formicacidsolution(100%aqueousphase)Injectionfrequency：500/8min,