饮料生产企业微生物实验室操作规范

饮料生产企业微生物实验室操作规范4微生物室环境管理3职责2定义1目的、范围5微生物检测操作规范目录6微生物操作几点说明保证微生物实验操作的规范性，降低交叉污染的可能性，保障实验高效、准确、安全。目的本规范适用于***公司微生物实验操作规范管理。范围目的、范围是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常用化学的方法来达到消毒的作用。用于消毒的化学药物叫做消毒剂。消毒1是指把物体上所有的微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法，通常用物理方法来达到灭菌的目的。灭菌2定义采用干燥箱灭菌，160℃灭菌2h，180℃灭菌1h，适用于玻璃器皿，不锈钢器具等。干热灭菌3采用高压灭菌器，121℃灭菌20min，适用于玻璃器皿、移液器吸头、塑料瓶等，并按照GB15981的规定，评价高压灭菌器的杀菌效果。湿热灭菌4一次性用品和材料应不含抑制微生物生长的物质，并保持无菌状态，必要时应进行核查。一次性用品和材料可替代重复使用的器具和材料（如：玻璃器皿、培养皿、移液管、瓶子、试管、接种环、涂布棒等）。一次性用品和材料5一种采用石英玻璃或其他透紫玻璃的低气压汞蒸汽放电灯，放电产生以波长为253.7nm为主的紫外线辐射，其紫外辐射能灭杀细菌和病毒。杀菌原理：紫外线波长在240~280nm范围内最具杀破坏细菌病毒中的DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的分子结构，造成生长性细胞死亡和(或)再生性细胞死亡，达到杀菌消毒的效果。尤其在波长为253.7nm时紫外线的杀菌作用最强。紫外线杀菌灯6掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识检验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为污染样品对实验室设施及环境进行卫生清洁、点检、维护，发现异常及时呈报。检验人员1确保微生物实验室设施、环境，异常处理及缺失设施的增补。实验室管理人员2职责微生物室环境管理微生物室及缓冲间须保持良好的卫生状况，与微生物检测无关人员不得无故进出微生物操作室；微生物操作室在进行实验前及实验完成后都要依据要求对其进行杀菌；缓冲间的杀菌时间及频率同微生物操作室。微生物室布局要合理，操作室应有良好的通风条件，如安装空调设备及过滤设备，操作室内空气测试应基本达到无菌。微生物实验室主要工作区域的温度应为18℃-26℃，相对湿度应为45%RH-65%RH，特殊地区夏季实验室湿度超过70%RH以上时，加强除湿措施，将湿度控制在70%RH以下，同时应适当延长紫外线杀菌灯的照射时间。4.微生物检测室使用前必须打开微检室的紫外线灯辐照灭菌30分钟以上。操作人员进入时应提前30分钟关掉紫外灯。操作完毕，应及时清理微生物检测室，再用紫外线灯辐照灭菌30分钟。在开紫外灯杀菌前，应确认无菌室无人后方可开紫外灯杀菌，开紫外灯顺序为：先打开操作台紫外灯后立即离开无菌室缓冲间，再打开无菌室紫外灯。在紫外杀菌灯关闭半小时后方可进入缓冲无菌室。微生物室环境管理注意事项：在使用过程中，应保持紫外线灯表面的清洁，一般每两周用酒精棉球擦拭一次，发现灯管表面有灰尘、油污时，应随时擦拭。同时记录灯的使用情况和时间，并填写《紫外灯使用记录表》。工作人员进入微生物操作室前，必须用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换经紫外灯消毒后的专用工作服、鞋、帽子(注意帽子应完全盖住头发，耳朵)、口罩和手套（用75%的酒精再次擦拭双手），方可进入微生物检测室进行操作。微生物检测室专用的洁净服不得在微生物检测室以外区域穿着，要定期更换，清洗。在实验室内用过的工作衣应单独存放，不得和日常服装放在同一柜子内。微生物检测操作规范微生物检测室应保持清洁，微生物实验室内不得存放过多物品，严禁堆放杂物，以防止污染。微生物检测室应备有工作浓度的消毒液，如75%的酒精。酒精的作用是使细菌的蛋白质变性（凝固），使之死亡。高浓度酒精溶液会使细菌表面形成一层保护膜，会阻碍酒精分子进入细菌内部（原理是高浓度的酒精使细菌表面的蛋白质快速变性凝固形成保护膜）。微生物检测室应每周用84消毒液或其他有效消毒效果的消毒方式进行灭菌清洁，以保证室内的洁净度符合要求。每次实验时，都需要进行生物安全柜（或超净工作台）的空曝实验以检测生物安全柜（或超净工作台）内的灭菌效果。生物安全柜内只放入必需的实验物品和材料，避免污染物品放入生物安全柜（或超净工作台）。实验室工作区域表面、人员接触的表面和空气应定期监控微生物质量（监控频率基于之前的检测结果）；表面污染评估可直接使用含有抗消毒剂的适合中和剂（如：卵磷脂、硫代硫酸钠）的接触板；空气质量检查可以用非选择性培养基（如：平板计数琼脂PCA）或用于检测目标微生物（如：霉菌）的选择性培养基，制成平板，打开盖在空气中暴露15min后，培养、计数。也可使用其他有效的检测表面污染的方法。微生物检测操作规范微生物检测取样规范依据公司标准要求，确定取样数量。抽取的样品应对一批产品具有代表性，从取样至开始检测的全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。取样应遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。每取完一份样品，应更换新的取样用具或将用过的取样用具迅速消毒后，再取另一份样品，以免交叉污染。微生物实验操作规范需带入微生物检测室使用的仪器、器械、平皿等一切物品，均应ba包裹严密，并经过灭菌。打开包装未使用完的工器具，需要重新灭菌后再使用。器具的灭菌可采用湿热灭菌或干热灭菌。在某些情况下，也可使用适当的化学杀菌，但处理后的器具不得有影响微生物生长的残留物。高压灭菌是所有除菌程序中的首选方法。

在验证灭菌锅验证杀菌效果时，应每次使用化学指示卡进行验证灭菌效果，但化学指示卡只能测到它最高的温度，并不能说明灭菌器达到灭菌要求，所以应每个季度使用生物指示剂对灭菌器期间核查，验证灭菌器的灭菌效果。用于微生物检测的玻璃器皿和其他检测用所需物品应合理配置，正确使用，并保证其处于洁净和无菌状态直至使用，重复使用的器具在清洗后不得有影响微生物生长的残留物。培养基通常采用高压湿热灭菌法，121℃灭菌15min，部分培养基（如结晶紫中性红胆盐培琼脂）采用煮沸灭菌，即用型试剂不需灭菌，具体应参照相关国家标准或供应商使用说明进行使用。开始检测之前，确保开展检测所需的各项物品都已备齐，进入微生物检测室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过传递窗传递。微生物实验操作规范检测开始前，应使用75%乙醇擦拭消毒生物安全柜（或超净工作台）的工作台面和内壁。在检测前，应保持待检物品外包装完整，不得开启，以防污染。样品的全部制备、稀释等过程均应遵循无菌操作程序，样品容器开启前，先将容器表面擦干净，再用75%乙醇消毒开启部位及其周围。微生物检测期间，防止不必要的人员走动，严格禁止人员进出。进入实验室人员应严格执行安全操作规程，工作前后，用适当的消毒剂（如75%的乙醇）消毒工作台面；生物安全柜（或超净工作台）内应避免放置过多物品，操作过程中保持清洁。微生物实验操作规范微生物实验操作人员在配制培养基过程中注意佩戴隔热手套，边加热边搅拌，全部溶解后，进行高压灭菌或分装于锥形瓶中，盛放培养基体积不宜超过锥形瓶容量的80%（防止灭菌过程中喷出，污染或损害高压灭菌锅）。盛装培养基的锥形瓶或其他玻璃容器，应选择没有划痕和磨痕的。定期检查并更换实验室中使用时间较长、磨痕较多的玻璃容器。橡胶塞也要定期进行更换，不能使用不合适的胶塞，也要避免胶塞老旧导致气孔堵塞。微生物实验操作规范如果琼脂需要复溶时，首先将需要复溶的琼脂瓶放入50℃的水浴锅中，水浴锅中的水位应超过瓶内琼脂的体积的一半以上，当培养基完全与锥形瓶内壁分离且液化的培养基量已达1/2时，可取出放电陶炉上继续复溶，加热过程注意控制电陶炉的温度，并且边加热边摇动，防止糊底和琼脂喷射。培养基及配套试剂应按标准要求条件进行储存，不得使用过期的培养基，影响使用效果。如孟加拉红琼脂灭菌后，要避光保存备用，因为孟加拉红见光易分解，影响霉菌生长。微生物实验操作规范微生物实验操作人员在操作时应戴一次性口罩、手套，手及裸露手臂部分用消毒液清洗消毒，并避免触摸口、眼及面部，必要时佩戴安全眼镜、面罩（面具）或其它防护设施。无菌操作室禁止交谈，操作过程中不得用手触摸其它未消毒、灭菌的区域，检测期间防止不必要的人员走动。操作打开后的样品、培养基以及接种时，禁止说话、咳嗽等；进行实验操作时应使用恰当的操作手法尽量减少溅撒或者气溶胶的产生。打开包装未使用完的器皿，不能再继续使用。在取培养皿过程中，应竖着拿出培养皿，横着打开皿桶，培养皿有开盖污染的风险。微生物实验操作规范检测样品时，应按照“由带菌量少到带菌量多的检测顺序”检测，避免交叉污染。在安装滤杯时，双手不能接触滤杯上部、底部等，否则可能存在污染样品。在往培养基平板上贴过滤膜时，滤膜和培养基之间不得有气泡。抽滤完成后，要用无菌水进行清洗抽滤装置、管路，防止管路中有残存饮料，管路发霉，若产生倒吸，很可能引起过滤装置的污染。无菌室不能存放大量酒精、瓦斯气、物品等。微生物实验操作规范用浸泡过75％乙醇或其他适当消毒剂的纱布或其他适当材料迅速擦去任何溢物，在继续检测前重点清洁和消毒此工作台面，为达到消毒效果需要适当的接触时间，使用其他消毒剂时，应根据厂商说明书操作。实验结束后，应使用75%酒精擦拭生物安全柜（或超净工作台）的工作台面、内壁、玻璃悬窗内外侧、紫外灯和电源输出口，以及包括实验设备在内的生物安全柜内的所有物品。实验完毕，立即清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理。实验用过的废弃物要倒在固定的箱筒内，并及时处理。微生物实验操作规范实验完毕，用肥皂水洗净双手，然后用清水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压灭菌。废物处理：由于剩余的培养基可能会使微生物生长繁殖，因此，在实验结束时，包括仪器设备在内的生物安全柜（或超净工作台）里的所有物品都应清除表面污染，并移出生物安全柜（或超净工作台）；对于培养物及其污染的物品（如细菌培养平皿等）应使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂处理一定时间，或121℃高压灭菌至少30min，或其他有效处理措施。将处理物倒入特殊标识的垃圾袋内，直接送到指定地点。高压灭菌锅的使用，微生物实验操作人员必须正确使用高压灭菌锅灭菌。除直接监控高压灭菌锅的温度外，还可使用化学或生物指示剂指示每个灭菌循环的运转效果。微生物实验操作规范在有氧培养中，一般平板堆叠不能超过６个，平板之间、平板与培养箱壁间要距离至少25ｍｍ。如果空间不够，在空气流通的系统里，可以叠得更高些。这种情况，需要证实温度均匀性。严格控制培养箱温度以及培养时间，不得提前出具微生物结果。定期对微生物培养箱及高压灭菌锅维护保养，如每周使用75%酒精擦拭培养箱箱体内部，升温至100°C灭菌1h；高压灭菌锅每周换水等。实验设备应放置于适宜的环境条件下，便于操作、维护、清洁、消毒与校准，并保持整洁与良好的工作状态。使用前应核查设备是否符合指定要求，使用过程中应对其性能的有效性进行监控。微生物实验操作规范实验室应制定周期性检查程序以证实检测可变性（检测人员差异、设备差异、材料差异）处在控制下，该程序应覆盖实验室所有检测活动，该程序应包括但不限于以下方法：①使用添加已知水平的加标样品，包括目标和背景微生物；②使用不同基质的添加或自然污染的样品；③使用标准物质（包括能力验证样品）；④重复检测；⑤重复评估检测结果。微生物实验操作规范微生物操作几点说明新到货的培养基应依据《GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》进行验证，开盖后的培养基应注意在瓶身标识开盖日期，每次使用前查看培养基状态，同时为了便于追溯，应在记录中记录使用的培养基批号。关于霉酵培养基培养基说明：《GB4789.15-2016食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》中倾倒培养基的量由10版的15~20mL增加至20~25mL，不能为了节省培养基，而减少培养量，更不能为了节省培养基，将要求中使用90mm的无菌平皿变为60mm。关于霉酵培养的放置方