3.2.2基因工程的基本操作程序（PCR计算引物选择）高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章基因工程基因工程的基本操作程序（PCR计算+引物选择）P1.引物根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成。2.PCR反应体系的成分中能决定复制特定DNA片段的是（“模板”/“引物”）?3.PCR扩增时，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列。4.延伸的方向是子链的5’→3’导思（一）引物选择部分：8分钟1.探针两端分别连接一个荧光基团R和一个淬灭基团Q．2.机理:①探针结构完整时,R发射的荧光被Q吸收；②而PCR扩增时,结合在模板链上的探针被切断,使R和Q分离,R基团发射的荧光不被淬灭,这样通过对荧光强弱的监测可实现对产物的检测。3.完成议的内容议6分RT-PCR:(1)探针的水解，发生在PCR过程_延伸_阶段。步骤③的目的是使_引物和探针_与目的基因通过形成_氢键（化学键）特异性结合。（2）PCR过程中，不断消耗的是？原料、DNA聚合酶、模板、引物？

原料、引物

据此分析：“平台期”出现的原因是试剂盒中原料、引物和探针数量一定，超出一定循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。（3）Ct值指“每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数”,当样本中初始模板越多,Ct值就(大\小)

小。(4)现有两个待检样本,检测时都出现了右图曲线,但甲的a点比乙的a点明显左移。合理的解释是:_甲样本中的新冠病毒含量更高达到阈值所需的循环数更少。展8【拓】“荧光RT—PCR技术”试剂盒应该含:_模板×_逆转录酶__、_耐高温的DNA聚合酶_、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲液。拓应用:1.RT-PCR对基因表达[转录+翻译]的检测仅限于转录_水平，根据PCR产物的浓度又可以估算_起始模板RNA_的浓度，以此代表目的基因在特定组织中的表达量。

2.还可对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量，便于检测_。

展8议1.如果扩增序列为下图所示的两段序列之间的DNA片段，合适的引物是_甲和D__。5′→GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG­3′3′­CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC­5′引物Ⅰ引物Ⅱ甲5′­GACCTGTGGAAGCA5′­CATACGGGATTG乙5′­CTGGACACCTTCGB5′­GTATGCCCTAAC丙5′­CGAAGGTGTCCAGC5′­GTTAGGGCTTAC丁5′­GCTTCCACAGGTCD5′­CAATCCCGTATGT1（1）图1选取___BE__作为引物。展评9T1（2）图2选取___1,4_为引物。T2利用PCR扩增T-DNA片段，选择引物是AD

PCR扩增被插入的基因片段，选择引物是BC拓：①利用PCR扩增已知序列T-DNA：选用引物

②③②对两侧未知序列进行测序：做法是：用

DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④

PCR扩增后测序展评93.引物设计要求：①PCR中引物不能过长的原因__防止引物自身碱基互补配对造成自身环化___________②引物不能过短原因__引物与模板链结合的特异性差,容易扩增出非目的基因片段③每一种引物的内部以及两种引物之间不能发生过多的碱基互补配对，据图4分析，下列两组引物设计都不合理的原因：第一组引物:引物I和引物II局部发生碱基互补配对_第二组引物:引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效_。____________

T4.若已知一段目的基因的一个引物，能否据此写出另一个引物，说明原因？不能两种引物序列无相关性展评91.引物数=新形成的DNA分子链数

一个DNA扩增n次，引物数=2n×2-2=2n+1-22.数量：引物1=引物23.等长DNA片段=目的基因片段导4思（二）PCR计算部分

6分钟T5.结合图5（1）填写右表(2)至少循环

3

次才会出现等长的DNA片段,即

⑤

。经n轮循环后,①②各

1

个,③④各n-1个,⑤(目的基因)共有2n-2n

个。T6.扩增n轮后,含有引物1的DNA分子

有

2n-1

个,

只含引物1的DNA分子有

1

个，同时含引物1和引物2DNA分子有2n-2个。T7.已知引物数=新合成的子链数:(1)一个目的基因扩增n代,需消耗2（2n-1）

个引物,需要

2n-1

个引物1。①②③④①②③④⑤展评411.PCR循环n次，等长的目的基因数量是2n-2n。循环5次，目的基因有？25-2×5含有引物1和引物2的DNA有几个？25-2消耗引物多少个？（25-1）×22.新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA可采取RT-PCR法。这种方法需要的酶是逆转录酶耐高温的DNA聚合酶。3.提取新冠病毒的RNA，通过_逆转录获得cDNA。过程Ⅰ和过程Ⅱ利用的原料相同（填“相同”“不同”或“不完全相同”）4.右图拟对m个单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要__m×2n-1____个引物B。检5.退火温度过高会破坏引物与模板DNA链的碱基配对。长度相同但G、C碱基所占比率较高的引物需要设定更高的退火温度。6.引物A和B的长度越长、G和C比例越高，则PCR循环步骤中的复性（填“变性”“复性”或“延伸”）温度设定就越高。7.PCR中引物不能过长的原因__防止引物自身碱基互补配对造成自身环化___________②引物不能过短原因__引物特异性差,容易扩增出非目的基因片段2.判断：①判断：限制酶是一种酶错

一类酶②质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制错

P74质粒能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。③DNA连接酶对所连接的DNA两端的碱基序列有专一性要求错④限制酶能够识别新冠病毒特定的核苷酸序列并在特定位点切开磷酸二酯键错

不识别RNA⑤EcoRI识别序列和切割位点为G↓AATTC，则形成的黏性末端为AATTC-错

AATT⑥用F和G酶切割目的基因和质粒构建重组质粒，则应该用四环素的培养基筛选出含重组质粒的受体菌。错

不能直接就是四环素

应该是氨苄青霉素⑦限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的识别序列如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。图示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程。将重组质粒同时用以上2种限制酶切割则会再形成1种长度的DNA片段

对

重组之后不能被这两种酶识别⑧若DNA上的碱基随机排列，NotI限制酶切割位点出现频率低于其他三种限制酶对

⑨某环状DNA分子，用BamHⅠ完全切割该DNA分子后产生2个片段