DB37T 4725.2-2024 动物疫病诊断技术 第2部分：α疱疹病毒

37毒Diagnostictechniquesofanimaldisease—Part2:AlphaherpesvirusI本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定DB37/T4725《动物疫病诊断技术》是针对畜禽养殖场不同动物疫病的致病原，明确动物疫病病原DB37/T4725拟由以下部分构成。疱疹病毒（herpesviruses）是一类有包膜、基因组为双链DNA的病毒。主要分为α疱疹病毒、疹病毒、γ疱疹病毒3种亚型。其中α疱疹病毒对动物的危害程度最大。该病毒感染宿主广泛，包括猪、1动物疫病诊断技术第2部分：α疱疹病毒本文件适用于猪、鸡、牛、马、驴α疱疹病毒的流行病学调查、诊断GB/T6682分析实验室用水规格和NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4.1猪伪狂犬病由猪伪狂犬病毒（Porcinepseudorabiesvirus，P4.2鸡马立克氏病传播，另外，污染的饲料和饮水，以及饲养人员流动也可传播该病。2月龄～5月龄的鸡常4.3牛传染性鼻气管炎由牛疱疹病毒1型（Bovineherpesvirus1，Bo由马疱疹病毒1型、4型或8型（Equineherpesvirustype，2母猪分娩前或后1周出现食欲下降甚至废绝，且出现早产，流产，产死胎或弱胎；公猪出现睾阴囊肿大，精子活力低。哺乳仔猪感染以后出现高热潜伏期一般3周～4周，根据疱疹病毒侵害部位不同，分为四种类5.1.2.1神经型：患病鸡出现站立不稳，呈“劈叉”姿势，翅膀下垂，低头或斜颈等为典型症状。5.1.2.4皮肤型：病鸡常出现毛囊肿大或皮肤结节。5.1.3.2结膜角膜炎型：病牛出现结膜和角膜充血，眼睑肿大，流泪，角膜浑浊，有坏死性斑点。5.1.3.3生殖器型：病母牛体温升高，精神沉郁，食欲废绝，外阴肿胀有小脓疱；出现子宫炎导致流而死亡。孕马或孕驴出现流产，或驴驹死亡。以1岁～2岁马或驴多发，3岁后呈隐5.2.1.2聚合酶链式反应（PCR）检测与电泳分析3TTTGAATTCTTACGACACGGC鉴于PRV的检测需要区分野毒感染还是由疫苗免疫造成，以5.2.1.2纯化的DNA为模板，利用特异性引物分别进行PCR检测（引物序列见表2，gE引物用于鉴别野毒，gB引物用于常规检测），qACAAGTTCAAGGCCCACATC5.2.1.4野毒分离与检测分析核酸电泳结果，或qRT-PCR结果，选取判定为猪伪狂犬病毒阳性的脑，肺脏或淋巴结等病料借5.2.1.5数据处理分析5.2.2.1采集病料样品4具体操作步骤参照附录A。将PCR产物利用1.0%的核酸胶进行电泳分析以5.2.2.2纯化的DNA为模版，利用），MDV073-FATTTGATTCAGATTTTGTTTMDV073-R5.2.2.4野毒分离与检测成3%FBSDMEM，放置培养箱3天～5天，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。5.2.2.5数据处理分析5.2.2.5.3若DEF细胞出现CPE，即细胞出现变圆、聚集、拉5.2.3.1病料样品采集以5.2.3.2纯化的DNA为模板，利用），55.2.3.4野毒分离与检测细胞培养液，放置培养箱3天～5天，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。5.2.3.5数据处理分析5.2.4.1病料样品采集将待测病料样品借助试剂盒提取DNA作为模板，借助特异性引物（序列参见表5）进行PCR检测，具体操作步骤参照附录A。将PCR产物利用1.0%核酸胶进行电泳分析，目的片段大小为792bp，482bp或6以5.2.4.2纯化的DNA为模板，利用），5.2.4.4野毒分离与检测换成3%FBSMEM，放置培养箱3天～5天，每天借助倒置显微镜观察是否出现细胞病变（CPE）。5.2.4.5数据处理分析5.3综合判定若患病动物（猪，鸡，牛，马或驴）出现呼吸困难，流产和神经症状等，则可判定为疑似α疱疹病毒感染，需借助PCR，荧光定量PCR进行7聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)，又称为无细胞和适温延伸（72℃)等3个步骤反复的热循环构成。体系包含DNA聚合酶，引物，模板等，常设定为30A.3试剂或材料A.3.2对应靶基因的特异性引物。A.3.3实验室用水参考GB/T66A.3.6Agarose琼脂糖。A.3.7标准DNA分子量maker。A.4仪器设备A.4.2核酸电泳仪。A.5试验步骤用1.0%核酸胶进行分析，待电泳结束，借助凝胶成像系统观察11268qRT-PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PC11179TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGAGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGTCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGCTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGAGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTGCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGATTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCAAGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCTGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGAGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGATTTGATTCAGATTTTGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCATTCTCTGACTCCACGGATAGAATAGTACGGGTTGTACAAGAACCCGTTTTTTATTCAAATGCTCCCCCAATATATTTGGGTTTTGTCTTTCGGCCAGCATTAATGCGCGAACGGAACAACAGCGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTAATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTTACGACTCGTTCGCGCTCTCGACCGGGGACATTATCTACATGTCGCCCTTTTACGGGCTGCGCGAGGGCGCGCACCGCGACCAGCTACTCGCCGGAGCGCTTCCAGCAGATCGAGGGCTACTACAAGCGCGACATGGCCACGGGCCGGCGCCTCAAGGAGCCGGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCACGTGACGGTAGCCTGGGACTGGGTGCCCAAGCGCAAAAACGTGTGCTCGCTGGCCAAGTGGGGCGGACGAAATGCTGCGAGACGAGAGCCGCGGGAACTTCCGCTTCACGGCCCGCTCGCTCTCGGCGACCTTTGTGAGCGACAGCCCTTCGCGTTGCAGAATGTGCCGCTGAGCGACTGCGTGATCGAAGAGGCCGAGGCCGCGGTCGAGCGCGTCTACCGCGAGCGCTGGCACGCACGTGCTGTCGGGCAGCTTGGAGACGC.8牛疱疹病毒1型gB基因qRT-PCR参考序列(大小为97CTGGCACACGACGGACGATGTGTACACGGCGCTGGGCTCGGCGGGGCTCTACCGCACGGGCACCTCTGTGAACTGCATCGAACCTCAGCCAACCCAAGATGGTGTGCATAGAGAACAAATTCTACATCGCTTGCACAAACGAGCAGTGGAGGCAACGGCACCGATTCTTCCAACGTCACCGCCAAACAGCTGGAGCTCATCAAAACCACGTCGTCTATCGAGTTTGCCATGCTACAGTTTGCATCACATCCAATCCCACGTCAATGAAATGCTAAGTAGAATAGCAACTGCGTGGTGTACCCTCCAAAACAAAGAGCGGACCCTATGGAATGGTGAAGATTAACCCGAGCGCCATAGTCTCCGCAACCCTTGACGAGCGAGTTGCAGCGAGGGTCCTGGGGGACGTGATAGCTATAACGCACTGCGCCAAAATAGAGGGCAACGTGTACTTGCAAAACTCCATGCGCTCGATGGACAGTAACACGTGCTACTCCCGCCCCCACATTTACAATTACTAAGAATGCAAACAACAGAGGGTCGATAGAAGGCCAGCTGGGAGAGGAGAACGAGATTTTCACGGAGCGCAAGCTGATCGAGCCGTGCGCCCTCAATCAGAAGCGCTACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTACGTTTACTACGAGAACTACACGTTCGTCCGCTGCCCCCCACGGAAATCGAGGTTATCAGCACGTACGTTGAACTAAACTTGACCCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTCTGCCCCTGGTACACGCGGGCTGAGCTGGAGGACACCGGCCTGCTAGACTACAGCGAAATACAGCGCCGCAACCAGCTCCACGCTCTCAGGGCCATACGTCCCTGTCCGACAGATACAATGACAGGGTTCCGGTTTCGGTGGAGGAGATCTTCGGTCTCATCGACAGTAAGGATGTTCGTCAAAGGCCGAGTACCTCAGAGATAACATCATGCACCACGCGTACCACGACGACGAGGACGAGGTGGAGCTTGATTTGGTGCCGTCCAAGTTTGCAACTCCGGGGGCCAGAGCCTGGCAGACCACCAACGATACTACGTCTTACGTGGGGTGGATGCCATGGAGGCACGTCAACGTCTGTCAACTGCATCGTCGAGGAGGTGGAGGTTGCCGCAACTCGCTCGTCAAGAGTGGCGGAAACAATAGCGCTTGGGTTAACCTTTACCATCTCATTCCAGAGGGTCCGCTGTTTTGTAGTGTACACCACGCAGTTGCTATCCTACTTAGCATCTCATTAACGTGGGATTGGATGTGATCGTATGCAAACTGTAGCCAAACTCAATAGAGGACGTTGTTTTGATTAGCTCTAGTTGTTTGGCGGTGACGTTGGAAGAGTTTGTACTATTCGCAGCCTCCCGTTTGTGTAGGCGATGTAGTATTTGTTCTCTGTGGAGGCTCTCTTGGGTTGGAGTAGGTTCTGGTATTGATAGTAGCGACCTGTCGATTGGTATTATGGTTTGCGTTGGGGTTTAACAGATTTTTTAGGTCATAGG