PKCα-βⅡ-η-ζ在肾血管性高血压大鼠中表达

1/1PKCα-βⅡ-η-ζ在肾血管性高血压大鼠中表达1PKC\Ⅱ\\在肾血管性高血压大鼠中表达[摘要]目的:研究PKC、Ⅱ、、在肾血管性高血压大鼠心肌中的表达,探讨PKC亚型在高血压发病机制中的作用。

方法:肾血管性高血压大鼠模型制备成功后,提取部分心肌组织,采用WesternBlot测定PKC、Ⅱ、、的表达情况。

结果:PKC、Ⅱ、、表达在假手术组术前、术后无明显变化;手术组PKC、Ⅱ表达较术前无明显变化,PKC表达较术前减少,PKC术后无表达。

结论:PKC、Ⅱ可能未直接参与高血压的发病。

PKC术后表达下降考虑与高血压发病相关,然而其发病机制尚需进一步探讨,推测可能与其促进表皮细胞的增殖有关。

PKC作用于AngⅡ诱导的ERK途径的活化,ERK激活增加,从而导致血管平滑肌细胞增殖,血压升高。

PKC、在高血压的发生和发展过程中起重要作用。

[关键词]肾血管性高血压大鼠;蛋白激酶C(PKC);细胞外信号调节激酶[中图分类号]R-332[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2010)04(a)-027-03TheexpressionofproteinkinaseC,Ⅱ,,inratswithrenovascularhypertensionWANGHaixia,LIUShaokui,ZHANGDianlong2(TheAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)[Abstract]Objective:ToinvestigatetheexpressionofproteinkinaseC(PKC),Ⅱ,andinratswithrenovascularhypertension,andtheeffectofsubtypesofPKConhypertensionwasalsoinvestigated.Methods:Renovascularhypertensionmodelsofratswereestablished.PKC,Ⅱ,andweredetectedincardiacmusclebyWesternBlot.Results:TheexpressionofPKC,Ⅱ,andofsham-operationgrouphadnoobviouschangebeforeandafteroperation.TheexpressionofPKCandⅡofoperationgroupafteroperationwerethesameasthatbeforeoperation,theexpressionofPKCafteroperationwasdecreased.PKCshowednoexpressionafteroperation.Conclusion:PKCandⅡmaydonotdirectlyparticipateintheeffectofhypertension.TheexpressiondecreasingofPKCafteroperationwouldberelatedtotheeffectofhypertension,itspathogenesyshouldbefurtherinvestigated.Itmayberelatedtotheproliferationofepidermiccells.PKCcanleadtovascularsmoothmusclecellproliferationandrisingofbloodpressurethroughERKactivationpathwayand3upregulationofERK,PKCandplayimportantrolesintheprocessoftheoccurrenceanddevelopmentofhypertension.[Keywords]Renovascularhypertensionmodelsofrats;ProteinkinaseC(PKC);Extracellularlyresponsivekinase(ERK)随着生活水平的日益提高,高血压的发病率逐年上升,由此引起的心衰更成为危害人类健康并致死的主要危险因素之一。

目前有关高血压的研究很多,但其发病机制尚未完全阐明,有报道认为蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)各亚型在高血压、心肌肥厚的发生及发展中起重要作用[1]。

本文通过检测高血压大鼠模型心肌PKC、Ⅱ、、的表达情况,探讨PKC亚型在高血压发病机制中的作用。

1材料与方法1.1肾血管性高血压大鼠模型的制备实验选用42只正常血压Wistar大鼠,均为雄性,体重165～180g,在大连医科大学实验动物中心进行实验(辽:scxk2002-0002;辽:syxk2002-0005)。

大鼠随机分为正常对照组、手术组、假手术组。

模型制备:氯胺酮麻醉后备皮,取腹部正中切口开腹,分离后暴露一侧肾动脉,针灸银针紧贴在左肾动脉,用手术丝线将两者一起结扎后,抽去银针,逐层关腹,术后腹腔内注射青霉素预防感染。

假手术组除不结扎肾动4脉外,其他手术步骤相同。

术后10周肾血管性高血压大鼠模型成功建立[2],大鼠全部处死,取心肌组织,低温液氮下保存。

1.2PKC、Ⅱ、、的提取和活性测定取部分心肌组织提取蛋白并定量,用聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为40g总蛋白),将蛋白电转到硝酸纤维膜上,封闭后加一抗(1∶2000稀释)、辣根过氧化物酶标记二抗(1∶1000稀释),用化学发光试剂NCIP/BCIP显影,X线片压片曝光,凝胶成像分析系统分析结果,重复3次(全部一抗、二抗试剂来自SantaCruzBiotechnology)。

1.3统计学方法数据以SPSS10.0软件处理,组间进行t检验,P0.05)。

见图1、2。

2.2手术组PKC、Ⅱ、、的表达情况手术组术后PKC、Ⅱ表达较术前无明显变化(P0.05),PKC表达较术前减少(P(B.术前;A.术后)(B.术前;A.术后)图5手术组PKC的表达图6手术组PKC的表达(B.术前;A.术后)(B.术前;A.术后)53讨论目前尚不清楚心肌细胞感受血流压力变化的精确方式,以及由此引起的心肌相关信号通路活化及其在高血压心肌肥厚过程中调节心肌基因的确切机制。

众多生长因子的分离和分子克隆提示了不同亚型的生长因子和细胞因子在高血压发病中的作用。

PKC是细胞内一条重要的信号传导通路中的关键因子,它是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,具有多种生理功能,细胞外信号通过膜上受体可将PKC启动,进而将底物蛋白磷酸化,以调控细胞的增殖、分化、离子转运和基因表达等重要活动。

PKC至少有12种亚型或同工酶,这些亚型分布在不同组织中,可由不同的第一信使启动信息转录,各亚型的活化形式、活化程度、持续时间及细胞内定位各不相同,在不同的组织中亚型表达各不一样。

已有报道显示,PKC启动后能使肌钙蛋白I和T发生磷酸化,反射性抑制肌原纤维ATP酶活性,产生负性肌力作用,其次由于它能减少心肌细胞肌浆网Ca2+转运,从而减弱心肌收缩力,持续启动的PKC与心肌细胞之间的转导已被证实能够启动心房利尿肽及2肌球蛋白基因,引起心肌肥厚。

然而不同的同功酶在信号转导机制中起不同的作用,如PKC的启动可修饰Na+-K+-ATP酶,使其活性受抑制,且可以直接抑制细胞凋亡,与钙调磷酸酶相互作用,调节组织对心肌缺血损害6的耐受性。

大量研究表明,PKC依赖的细胞信号传导是心肌缺血预处理IPC中的重要环节。

目前认为,并非所有的PKC亚型都参与了预处理时的细胞信号传导。

已有研究用免疫荧光技术证实了PKC、、及在成年大鼠心肌细胞中存在及IPC时在心肌细胞的转位。

有学者研究发现,缺血预处理并没有改变PKC、、在胞质和胞膜中的比例;在冠状动脉阻断/再灌注(O/R)后PKC在胞膜中的比例与O/R重复次数呈正相关。

而PKC、、、在胞膜中的比例升高则不明显。

有目的地干扰PKC基因的表达,可使心肌缺血预适应梗死面积扩大,心肌局部缺血过程中生理浓度的酒精消耗可激活PKC而对心肌产生保护作用[3-4]。

Anita等[5]报道,PKC、Ⅱ通过ERK依赖的信号途径参与VEGF的生成过程,由于VEGFmRNA及其蛋白表达上调,从而导致伴随PKC、Ⅱ和ERK活性增加。

本研究发现,PKC、Ⅱ的表达在手术组手术前后无明显变化,推测PKC、Ⅱ可能未直接参与高血压的发病。

PKC为新型PKC,激活需要Ca2+参与,不被PKC的激活剂佛波酯激活,有关PKC的报道不多,高玖鸣等[6]发现PKC的转基因过度表达未引起心脏负荷的加重。

本研究中PKC在手术组术后表达反而降低,考虑与高血压发病相关,然而其发病机制尚需进一步探讨。

笔者推测可能与其促进表皮细胞的增殖有关。

7PKC是非典型PKC家族成员,作为PKC家族的新成员,由于它的一级结构缺乏C2区,且在其调节区只拥有一个锌指结构,因此,PKC显示出与其他PKC明显不同的特性,且广泛参与细胞功能的调节[7]。

作为信息分子,PKC在多种细胞外刺激因素诱导的胞内信号转导通路中发挥重要作用,如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)通路、核转录因子-B(nucleartranscriptionalfactor-B,NF-B)的活化和核糖体S6蛋白激酶通路等。

许多研究表明,PKC的激活机制具有组织细胞特异性[8]。

AngⅡ刺激使Ras与Raf结合增加,但PKC抑制剂并不影响Raf与Ras的结合,PKC通过Raf非依赖性途径活化血管平滑肌细胞ERK1/2[9]。

本研究中,PKC在手术组术后无表达也支持这一点,提示PKC在高血压的发生和发展过程中起重要作用,其表达下降可能是因ERK激活增加,从而导致血管平滑肌细胞增殖、血压升高。

丁波等[10]报道,PKC能够介导AngⅡ,激活Ca2+-钙调节蛋白依赖性蛋白激酶,促进心肌成纤维细胞的增殖。

同时PKC的减少也对血管内皮起到一定的保护作用,PKC通过VEGF参与了肾血管性高血压大鼠的发病,在Ras和PI3激酶突变、缺失的情况下,活化的PKC明显减少,Sp1与VEGF表达部分下调。

PKC在G蛋白耦联受体的信号转导中的作用较清楚。

PKC的一种突变体能激活ERK和SAPK途径,它的一种显性负相(dominant8negative)突变体则抑制ERK的活化。

值得注意的是,很可能这两种具有相反作用的突变体都参与了发病,PKC在功能上作为一种MEK激酶并应答于AngⅡ诱导的ERK途径的活化[11]。

PKC同工酶种类较多,其同工酶的组织分布、结构、功能、活性以及基因表达的调节机制不同,并且与体内多种病理生理过程的调节有关。

因此,开发PKC同工酶特异性拮抗剂,将会对多种疾病,尤其是在心脑血管疾病的治疗中发挥重要作用[12]。

[参考文献][1]HofmannJ.Thepotentialforisoenzyme-selectivemodulationofproteinkinaseC[J].FASEB,1997,11:649-669.[2]王海霞,王丽萍,王靖宇.肾血管性高血压大鼠模型中ET1和CGRP的变化[J].中国比较医学杂志,2007,17(12):737-739.[3]陈隽鹏,洪丰,郑顺利.蛋白激酶C信号传导在心肌缺血预处理中的作用研究进展[J].广东医学,2006,27(12):1914-1916.[4]何晓琴.蛋白激酶C及亚型与心肌缺血预处理及后处理[J].中国分子心脏病学杂志,2007,7(6):369-373.[5]AnitaJM,HeidiRR,ShaliniST,etal.Roleforprotein9kinaseC-inkeratinocytegrowtharrest[J].JournalofInvestigativeDermatology,2009,129:2365-2375.[6]高玖鸣,吴信,孔