高中生物同步备课系列【备学案】3.2.2 基因工程的基本操作程序 导学案（教师版）-人教2019版选择性必修3

第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序（第2课时）导学案【科学思维】针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。【科学探究】尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。【教学重点】DNA片段的扩增及电泳鉴定。【教学难点】DNA片段的扩增及电泳鉴定。四、目的基因的检测与鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。1.分子水平的检测（1）通过检测与鉴定等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。（2）抗原—抗体杂交技术：检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。2.个体生物学水平的检测【到社会中去】1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因（如CrylAa和CrylAc基因）同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度（如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作），这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全生产评价等。【探究·实践·DNA片段的扩增及电泳鉴定】（一）实验原理1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。2.DNA片段电泳鉴定的原理：（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。（二）方法步骤1.DNA片段的扩增移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分→离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）→反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min//30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min预变性：使DNA充分变性，以利于_____更好地和模板结合。2.DNA片段的电泳鉴定配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀→制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜→加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物→电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳→观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。（三）注意1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。【结果分析与评价】1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。【课堂作业】1.下列属于PCR技术所需条件的是（B） ①单链的核苷酸序列引物②目的基因所在的DNA片段③脱氧核苷酸④核糖核苷酸⑤DNA连接酶⑥DNA聚合酶⑦限制酶A.①②③⑤ B.①②③⑥C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦2.质粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是（C）A.使目的基因在受体细胞内易于表达B.使受体细胞具有抗药性C.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测D.促进目的基因与导入的外源基因相连接，提高转基因操作的成功率3.科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是（B）①该技术将导致定向变异；②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来；③将目的基因导入受体细胞时采用显微注射技术；④受精卵是理想的受体。A.①②④B.①③④C.②③④D.①②③④4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（B）①将毒素蛋白注射到棉受精卵中；②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养；④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。A.①②B.③④C.②③D.①④5.利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法不正确的是（C）A.cDNA文库的构建需要用到逆转录酶B.图中的菌落是