各类高效液相色谱法

高效液相色谱法

HighPerformanceLiquidChromatography

分析化学教研室严拯宇高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6小结习题及解答一、概述高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。简称：HPLC；HRLC；HSLC；UPLC

超高效液相色谱（UltraPerformanceLiquidChromatography）与经典LC相比——高效

高效填料：3～5μm

高压泵输液

高灵敏度的检测器:在线检测一、概述分析对象流动相差别GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%惰性气体HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，占有机物的80%液体，种类较多，选择余地广HPLC与GC区别一、概述HPLC仪器示意图一、概述HPLC仪器图SHIMAZUAGILENTWATERS一、概述特点

适用范围广

高效

高速

高灵敏度（主要用UV5×10-10g/ml）

流动相选择范围宽

柱可以反复使用（可用1-2年）

流动组分易收集

安全高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6二、基本原理范氏方程（vanDeemterequation)：

GC：填充柱

H=A+B/μ+Cμ

HPLC：

H=A+Cμ

原因：T↓；η↑；μ↑→

忽略B/μ二、基本原理GC和HPLC的H-u图1B/μ2Cμ3A4HPLC的μopt

5GC的μopt二、基本原理HPLC： H=A+Cμ

A=2λdρ C=Cm+Csm影响因素：λ↓

选球形固定相，高压、匀浆装柱法dρ↓

选粒径小的化学键合相C↓ 选粘度小、低流速的流动相范氏方程（vanDeemterequation)二、分离度及影响因素：又可：

讨论如何由n、α、k来改变R1、

k↑，R↑，k最适宜范围1<k<52、改变α—变峰间距

α↑，↑R↑在GC主要通过改变固定相（∵载量一定），而在HPLC中，主要通过改变流动相。3、改变n、

a、减小颗粒直径dρ↓b、提高装柱技术（均匀）

c、流动相η↓（∵低粘度流动相可以增大Dm）

d、线速度μ↓（减小传质阻抗引起H）

e、增加柱长L（但太长，柱压大，寿命短）高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法（LSC）

1液液分配色谱法（LLC）2化学键合相色谱法（BPC）3三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活性中心影响k的因素：

与硅胶亲和力大的溶质k大，tR大

控制溶剂的极性，可调整tR(常用多元体系流动相)溶剂的极性愈大，洗脱力愈强，k↓.tR↓)三、各类高效液相色谱法液液分配色谱法分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异分类:反相色谱RPLC固定液极性<流动相极性正相色谱NPLC固定液极性>流动相极性三、各类高效液相色谱法液液分配色谱法固定相：载体可用Ｌ－Ｓ色谱中的吸附剂；

Ｇ－Ｌ色谱中的固定液都可采用（常用的有角鲨烷、ＰＥＧ、十八烷等）流动相：反相色谱RPLC流动相极性增大，ｋ增大，tR大极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱正相色谱NPLC流动相极性增大，ｋ减少，tR小极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱三、各类高效液相色谱法化学键合相色谱法(chemicalbondedphasechromatography,BPC)通过化学反应将固定液有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂。反相键合相离子抑制正相键合相离子对三、各类高效液相色谱法反相键合相色谱法(RBPC)固定相：非极性的键合相 如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱)固定相的最佳使用ｐＨ：２～８流动相：极性大的流动相 如:甲醇-水或乙腈-水流动相极性与k的关系:

极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑

极性大的组分先出柱应用：非极性--中等极性组分，应用范围最广。三、各类高效液相色谱法2.

正相键合相色谱法(NBPC)固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：极性小的底剂（烷烃）+极性调节剂

流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓

结构相近组分，极性大的组分后出柱三、各类高效液相色谱法3.

离子对色谱法(IPC,PIC)分离机制：把离子对试剂加入极性流动相中，被分析的离子在流动相中与离子对试剂（反离子）生成不带电荷的中性离子时，从而增加在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增大，而改变分离效果。

流动相 固定相

B+H+BH+

+RSO3Na

RSO-3+Na+

[BH+.RSO-3][BH+.RSO-3]

中性离子对 ↗增加了在非极性固定相中溶解度。机理：三、各类高效液相色谱法常用离子对试剂：

分析对象离子对试剂例如碱烷基磺酸钠C5、C6、C7、C8磺酸钠,SDS酸四丁基季胺盐四丁基胺磷酸盐（TBA）三、各类高效液相色谱法4.

离子抑制色谱法(ISC)分离机制：通过调节流动相的pH，抑制组分离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，弱碱的目的适用范围：3.0≤pKa≤7.0的弱酸

7.0≤pKa≤8.0的弱碱抑制剂:

弱酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液三、各类高效液相色谱法4.

离子抑制色谱法(ISC)影响ｋ的因素：

与凡在反相色谱中的影响因素，此处同样影响。

pH的影响弱酸：pH<pKa时，k↗,tR增大（以分子形式，固定相中多）

pH>pKa时，k↘,tR减少

(以离子形式，流动相中多)弱碱与上恰相反。pH<pKbtR↘ pH>pKbtR↗ 总之，pH应在2～8，超出将会腐蚀仪器，流路系统。HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6四、固定相液-固色谱固定相硅胶

特点

表面多孔硅胶(YBK)

易装柱，柱效不高，柱容量小

无定形全多孔硅胶（YWG）柱效高，柱容量大，价廉，但硅胶要匀浆）

球形全多孔硅胶（YQG）具YWG的优，具涡流扩散小，渗透性好

堆积硅珠 传质阻抗小，柱容量大

四、固定相液-固色谱固定相高分子多孔小球：YSG（柱效低η103）

又称有机胶：苯乙烯与二乙烯苯交联而成。用途：分离芳烃、杂环、甾体、生物碱……四、固定相化学键合相特点：不易流失;热稳定性好;化学性能稳定载样量大;适于梯度洗脱分类:非极性键合相：ODS中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氰基键合相HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6五、流动相要求：与固定液不反应;对样品有良好溶解度粘度小;与检测器匹配溶剂不同，与分子间作用力不同，有可能使组分的R不同，改变溶剂的极性，对组分的洗脱能力改变，tR改变，实验时可适当配比，以至得到较适宜的R。五、流动相洗脱方式:等度洗脱(isocraticelution)恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱(gradientelution)在一个分析周期内不断改变流动相的比例优点：简便，柱易再生；缺点：不能用于复杂组分的分离

优点：缩短分析周期；提高分离能力；改善峰形；增加灵敏度缺点：基线漂移五、流动相HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站高效液相色谱仪HPLC六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站泵： 恒压泵 恒流泵:柱塞往复泵六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站六通阀：优势：进样量准确，重现性好，可带压进样。六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成分析柱 φ2-4.6mm L10-25cm

常量柱

φ1-1.5mm L10-20cm

常微量柱制备柱 φ20-50mm L3-25cm

六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站检测器:紫外检测器荧光检测器蒸发光散射检测器其它检测器六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站检测器:紫外检测器优点：灵敏度高，精密度、线性范围好，可用于梯度洗脱。缺点：样品组分应吸收紫外光；要考虑溶剂的极限波长。六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站六、高效液相色谱仪T/min波长(nm)色谱－光谱图六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站检测器:2.荧光检测器优点：灵敏度比紫外更高。检测限1×10-10g/ml缺点：只能用于产生荧光或其衍生物能发荧光的物质六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站2489UVD2414RID2424ELSD2465ECDWATERSWATERS第七节定性、定量分析一、定性分析：

1、tR:γ12——

相对保留值=

2、化学鉴定：对HPLC流出组分收集，用专属性化学反应对收集的分离物质组分进行定性。

3、联机技术：HPLC—MS、HPLC—FTIR

质谱富利叶转换红外光谱第七节定性、定量分析

1、外标法：以试样的标准品作对照物质，相对比较求含量。（1）工作曲线法：用待测组分的标准品配制一系列浓度不同的标准溶液(Ci)s，准确进样，测量峰面积(Ai)s或峰高(hi)s，与(Ci)s绘制工作曲线，利用此曲线或它的回归方程，计算样品溶液的含量。（2）外标一点法：（与气相同）二、定量分析：与气相色谱同。2、内标法：内标选择同气相。

（1）工作曲线法：在待标准溶液系列中，同体积加入相同量的内标物、进样，分别测出标准物与内标物的A或h，以Ai/As~(Ci)s作图。（2）内标一点法：在药物分析中，校正因子常常不知，则先配已知浓度标准品，加入一定内标，再将内标按同量加入同体积样品中，分别进样。（Ci%）样品=3、校正因子法：第一步：精称被测组分的标准品mig，加一定精称L内标Msg配液进样。由二者峰面