c1型尼曼-匹克氏病对神经元发生

1/1c1型尼曼-匹克氏病对神经元发生新乡医学院大学生科研创新计划课题申报书所属学科：

发育神经生物学课题名称：

C1型尼曼-匹克氏病对神经元发生发育影响的初步研究申报者：

丁登峰所在院系、年级：

生命科学技术学院2014级起止时间：

2015.01-2016.06申报时间：

2014.11.11共青团新乡医学院委员会制课题名称C1型尼曼-匹克氏病对神经元发生发育影响的初步研究所属学科发育神经生物学起止时间2015.01-2016.06申请金额2000申报人姓名丁登峰性别男出生年月1995.5.24所在院系、专业生命科学技术学院，生物工程课题组成员情况姓名性别出生年月所在院系年级任职情况丁登峰男1995.05生命科学技术学院，2014级董宏天女1995.10生命科学技术学院，2014级顾巧美女1995.02生命科学技术学院，2014级课题组总人数3指导教师1乔梁性别男出生年月1985.9技术职称讲师最后学历研究生学位博士所在院系生命科学技术学院推荐意见：

签名：

年月日指导教师2闫欣性别男出生年月1980.1技术职称副教授最后学历研究生学位博士所在院系生命科学技术学院推荐意见：

签名：

年月日一、本课题研究概况及趋势，研究本课题的实际意义和理论意义1.国内外研究概况及趋势C1型尼曼-匹克氏病（Niemann-PickdiseasetypeC1,NPC1）是一种由于NPC1基因突变而引起脂类代谢异常的遗传性疾病，常见临床表现为进行性神经系统受损的症状和体征，如发育迟缓、共济失调、步态不稳、肌张力降低、震颤、癫痫发作、痴呆等，具有高致残率和致死率的特点。

根据发病年龄可将病人分为4类，分别为新生儿、幼儿、青少年和成年病人，其中婴幼儿时期发病率较高，多在10多岁前死亡[1]。

迄今为止，临床上还没有有效的治疗方法，仅能通过对症治疗、低脂饮食和加强营养的方法来延缓病情的发展，不仅给家庭和社会造成了沉重的负担，也给患者本身带来难以想象的痛苦。

NPC1是一种由1278个氨基酸残基组成的细胞膜蛋白分子，分子量约为142kD，具有13个跨膜区，5个固醇敏感区（sterolsensingdomainSSD，图1），它可以直接结合胆固醇，将其从次级溶酶体转运到质膜和高尔基网状系统，从而调节细胞脂质代谢平衡。

而对NPC1病人的基因分析显示，大部分的突变位点位于NPC1蛋白中富含半胱氨酸的第8和第9跨膜区之间的内环，这种突变可能导致该蛋白丧失脂质转运功能，从而使胆固醇、葡萄糖酰鞘氨醇、鞘糖脂GM2和GM3等脂类分子在细胞中沉积。

而胞体内大量脂质沉积，会阻碍不同神经细胞的生长发育和它们之间的脂质循环，影响神经元胞膜、髓鞘和胶质细胞的正常结构和功能，最终导致神经细胞变性坏死[2]。

图1NPC1分子的拓扑结构图目前，NPC1发病的病理机制、治疗药物筛选和开发是国际上生物学和医学领域的研究的前沿和热点。

早期研究认为神经元胞浆脂质沉积可能是导致NPC1神经元功能障碍和死亡的主要因素，但在用多种方法降低或消除神经细胞内脂质后仍不能阻止或延缓神经元变性和死亡。

因此，近年来的研究主要是从不同的视角来探讨NPC1的发病机制。

首先，NPC1发病过程中神经元细胞蛋白发生病变是导致神经系统变性的重要原因。

WalterM,etal发现NPC1小鼠中Vimentin发生过度磷酸化，致使晚期胞内体功能失活[3]。

而ChuaCC,etal认为NPC1病变引起的载脂蛋白E（ApoE）异常糖基化跟神经毒素A-beta片段的产生和聚集有关[4]。

BuB,etal发现NPC1基因突变引起神经元的蛋白激酶Cdk5（celldivisionkinase5）活性明显上调，导致Tau、神经细丝以及MAP-2等细胞骨架蛋白高度磷酸化而引发神经元纤维集结、变性或死亡[5]。

其次，NPC1在发病过程中神经胶质细胞异常活跃，引发系统发生过度的炎症反应，直接导致胶质细胞的激活和神经元受损之间发生恶性循环。

PresseySN,etal证实在NPC1突变小鼠发育后期的大脑中，星形胶质细胞和小胶质细胞数量显著增加，胞体增生肥大，突起多、短、粗[6]，这些胶质细会大量分泌性的神经毒性片段A[7]，引起神经元变性。

在NPC1疾病的药物筛选和开发方面，美国和欧洲开始的比较早，并且在这方面投入了大量的人力和物力。

美国康乃尔大学医学院的PipaliaNH博士、NIH的XuM博士、德国罗斯托克大学医学院的HovakimyanM博士等研究团队均已发现一些药物（如曲古抑素、帕比司他、-生育酚、四氢孕酮等)，在降低胆固醇和其他脂质体的堆积方面，有一定的效果[8-10]。

另外，美国华盛顿大学医学院的GelsthorpeME,etal通过分子伴侣修饰NPC1蛋白的突变结构，使其恢复活性，在该病的治疗方面也具有积极的意义[11]。

目前国内对NPC1疾病的研究起步较晚，在研究深度和支持力度等方面同国外相比还存在一些差距，主要是在华中科技大学、北京大学以及浙江大学等重点大学进行[12,13]。

但是，随着我国政府对这类疾病的逐渐重视和对基础研究资金投入的不断增多，以及在该领域中日益加强的国际交流合作，将会使我们在有关NPC1疾病的分子病理机制和药物开发等方面不断有新的突破，在研究的内容和水平上与国际上趋于同步。

综上所述，目前对NPC1分子机制的研究主要集中在疾病发展后期与神经系统变性相关的代谢机制以及治疗药物筛选等方面，但没有涉及或阐明NPC1对早期胚胎神经系统发育，特别是神经元发育分化的影响。

通过我们的初步研究将为进一步研究NPC1的病理机制提供基础性资料，为分析NPC1基因和疾病之间的关系奠定实验和理论基础，也可为临床诊断和治疗提供相关指导。

2.研究的实际意义和理论意义目前对于NPC1基因突变影响神经系统发育和病变的具体机制和发病机理并不清楚，以至于到现在为止还找不到有效的、具有针对性的临床治疗手段。

多年以来的研究结果认为NPC1基因突变所导致的神经细胞内胆固醇等脂类转运障碍是引起该病发生的主要原因，但对于围绕NPC1蛋白的细胞信号调控网络和其所涉及的细胞发育过程知之甚少。

同时，神经系统发育本身就是一个非常复杂的过程，各种信号通路的有序调控构成了这个系统的正常运转，任何的差异和病变都会对其产生连续的、致命的影响。

因此，如果能从NPC1病的神经发育基础研究入手，研究NPC1基因突变对于神经细胞发育及其网络信号调控过程的影响，不仅有助于我们正确了解NPC1的发病原因，而且能够为NPC1针对性治疗方案的设计开辟新的思路和理论依据。

参考文献：

1.MaulikM,ThinakaranG,KarS.(2013)Alterationsingeneexpressioninmutantamyloidprecursorproteintransgenicmicelackingniemann-picktypec1protein.PLoSOne,8,e54605.2.VanierMT.(2010)Niemann-PickdiseasetypeC.OrphanetJRareDis,5,16.3.WalterM,ChenFW,TamariF,WangR,IoannouYA.(2009)EndosomallipidaccumulationinNPC1leadstoinhibitionofPKC,hypophosphorylationofvimentinandRab9entrapment.BiolCell,101,141-152.4.ChuaCC,LimML,WongBS.(2010)AlteredapolipoproteinEglycosylationisassociatedwithAbeta(42)accumulationinananimalmodelofNiemann-PickTypeCdisease.JNeurochem,112,1619-1626.5.BuB,LiJ,DaviesP,VincentI.(2002)Deregulationofcdk5,hyperphosphorylation,andcytoskeletalpathologyintheNiemann-PicktypeCmurinemodel.JNeurosci,22,6515-6525.6.PresseySN,SmithDA,WongAM,PlattFM,CooperJD.(2012)Earlyglialactivation,synapticchangesandaxonalpathologyinthethalamocorticalsystemofNiemann-PicktypeC1mice.NeurobiolDis,45,1086-1100.7.KodamA,MaulikM,PeakeK,AmritrajA,VetrivelKS,ThinakaranG,VanceJE,KarS.(2010)AlteredlevelsanddistributionofamyloidprecursorproteinanditsprocessingenzymesinNiemann-PicktypeC1-deficientmousebrains.Glia,58,1267-1281.8.PipaliaNH,CosnerCC,HuangA,ChatterjeeA,BourbonP,FarleyN,HelquistP,WiestO,MaxfieldFR.(2011)HistonedeacetylaseinhibitortreatmentdramaticallyreducescholesterolaccumulationinNiemann-PicktypeC1mutanthumanfibroblasts.ProcNatlAcadSciUSA,108,5620-5625.9.XuM,LiuK,SwaroopM,PorterFD,SidhuR,FinkesS,OryDS,MaruganJJ,XiaoJ,SouthallN,PavanWJ,DavidsonC,WalkleySU,RemaleyAT,BaxaU,SunW,McKewJC,AustinCP,ZhengW.(2012)-TocopherolreduceslipidaccumulationinNiemann-PicktypeC1andWolmancholesterolstoragedisorders.JBiolChem,287,39349-39360.10.HovakimyanM,PetersenJ,MaassF,ReichardM,WittM,LukasJ,StachsO,GuthoffR,RolfsA,WreeA.(2011)Cornealalterationsduringcombinedtherapywithcyclodextrin/allopregnanoloneandmiglustatinaknock-outmousemodelofNPC1disease.PLoSOne,6,e28418.11.GelsthorpeME,BaumannN,MillardE,GaleSE,LangmadeSJ,SchafferJE,OryDS.(2008)Niemann-PicktypeC1I1061Tmutantencodesafunctionalproteinthatisselectedforendoplasmicreticulum-associateddegradationduetoproteinmisfolding.JBiolChem,283,8229-8236.12.FuR,YanjaninNM,ElrickMJ,WareC,LiebermanAP,PorterFD.(2012)ApolipoproteinEgenotypeandneurologicaldiseaseonsetinNiemann-Pickdisease,typeC1.AmJMedGenetA,158A,2775-2780.13.ZhouSY,XuSJ,YanYG,YuHM,LingSC,LuoJH.(2011)DecreasedpurinergicinhibitionofsynapticactivityinamousemodelofNiemann-PickdiseasetypeC.Hippocampus,21,212-219.二、本课题的基本内容，预计突破那些难题1.研究的基本内容本课题将利用NPC1基因敲除小鼠（BALB/cNctr-Npc1m1N/J，浙江大学提供）作为该研究的模式生物，应用分子生物学、组织免疫学和细胞生物学等技术，初步研究NPC1疾病对于神经元前体细胞的自我更新、增殖、迁移和分化等过程的影响。

根据神经元分化时期，可将这部分研究分为3个内容：

（1）NPC1疾病对于神经元前体细胞发生增殖的影响，主要对比研究与神经祖细胞增殖相关因子的表达和分布情况。

（2）NPC1疾病对于神经元迁移定位能力的影响，主要对比分析与细胞迁移相关蛋白标志物的表达情况。

（3）NPC1疾病对于神经元发育分化能力的影响，主要研究神经元分化不同阶段分子标志的表达水平和分布情况。

2.突破难题（1）NPC1基因敲除小鼠的饲养、繁育和鉴定。

（2）NPC1胎鼠和幼鼠大脑的震荡切片（3）原位杂交和WesternBlot方法的掌握三、课题的研究思路和方法，研究工作方案（包括已进行的研究工作情况）和进度计划、中期成果1.研究思路和方法本课题将围绕神经元发育分化的问题，揭示NPC1病变对于神经细胞发育过程的影响，为神经系统发育疾病的早期预防和治疗提供理论依据。

2.研究工作方案（1）根据不同实验的要求，将不同时期NPC1的胎鼠（E13、E15、E17）和出生后（P1、P5）的幼鼠处死后，收集胎鼠和幼鼠的大脑，进行固定，包埋，震荡或冷冻切片用于免疫组化研究；或者用裂解液进行匀浆、超声破碎、抽提用于Westernblot和PCR实验等，对照为野生型小鼠。

（2）大脑的普通形态学对比分析a.对比分析P1和P5时期NPC1突变型和野生型幼鼠的大脑的结构、质量、大小；b.常规免疫组化对比分析P1和P5时期NPC1敲除型和野生型幼鼠的大脑皮层结构和厚度。

（3）神经元前体细胞增殖情况分析收集胎鼠和幼鼠大脑幼鼠的大脑结构、质量和尺寸对比分析HE、Nissl染色分析幼鼠的大脑皮层结构荧光免疫组化、实时荧光定量PCR和Westernblot神经细胞增值情况神经元迁移情况显示不同标志性分子如pH3、Ki67、Pax6等神经元分化情况显示不同标志性分子如Reelin、DCX等显示不同标志性分子如NeuroD、Tbr1、MAP2等免疫荧光组化、原位杂交以及WesternBlot等方法研究大脑皮层神经前体细胞增殖情况；具体方法：

取E13、E15和E17天的胎鼠，研究细胞增殖期标志物（如pH3、Ki67）和不同大脑皮层神经前体细胞标志物（如Pax6、Sox2、Hes5）的表达变化，分析不同时期胎鼠大脑皮层细胞的增殖情况。

（4）神经元迁移定位能力的分析免疫荧光组化、原位杂交以及WesternBlot等方法研究与细胞迁移的相关因子如Reelin、mDAB、p35、DCX等的表达变化，综合分析E15-P1时期大脑皮层神经元迁移情况。

（5）神经元发育分化能力的分析a.免疫荧光组化、实时荧光定量PCR以及WesternBlot等方法研究大脑皮层不同层面、不同时期的一些神经元形成标志物（如NeuN、NeuroD、Tbr1、ER81、MAP2等）的表达水平和分布情况，综合分析E15-P1时期神经元分化情况；b.免疫荧光双染色以及WesternBlot分析神经元突触的形态发育情况；c.高尔基染色法（Golgistaining）分析神经元轴突和树突形态结构。

3.进度计划2015.01-2015.04NPC1小鼠饲养、繁育和鉴定2015.05-2015.07大脑的普通形态学对比分析2015.08-2016.10神经元前体细胞增殖情况分析2015.11-2016.01神经元迁移定位能力的分析2016.02-2016.04神经元发育分化能力的分析2016.05-2016.06撰写总结报告，结题4.中期成果1.从多方面提供证据确定NPC1病变对于神经元发生、分化和迁移等过程的影响。

2.争取发表科研论文1篇。

四、研究工作的资料准备情况1.指导教师闫欣和乔梁主要从事发育神经生物学方面的研究，在NPC1病的发病机理方面积累了丰富的研究经验，同时，他们已熟练掌握免疫荧光组化、实时荧光定量PCR