药物分析抗生素类药物

关于药物分析抗生素类药物第一节概述

抗生素:在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称

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来源：

化学合成

半合成

生物合成（发酵）

第2页,共87页，星期六，2024年，5月一、抗生素类药物的特点1.化学纯度低——同系物、异构体、降解物；2.活性组分易发生变异——菌株、发酵条件；3.稳定性差——活泼基团。第3页,共87页，星期六，2024年，5月二、抗生素药物的质量分析抗生素药物的质量控制方法与一般化学药品一样，通过鉴别、检查、含量（效价）测定三个主要方面来判断其质量的优劣。采用生物学法与物理化学法.第4页,共87页，星期六，2024年，5月一）鉴别试验：

1．官能团的显色反应2．光谱法3．色谱法4．生物学法（抑菌能力），已少用。青霉素钠鉴别取本品与已知含量的青霉素适量，分别加水制成每1ml中约含50μg的溶液，各取1ml，加入不少于200单位的青霉素酶溶液1ml,在37℃灭活1小时后，取灭菌滤纸片，分别用上述溶液浸湿后，用滤纸吸去多余的液体，置摊布金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的培养基上，在37℃培养约16小时后均无抑菌作用，而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用。

第5页,共87页，星期六，2024年，5月

（二）杂质检查

1．影响产品稳定性的指标（酸碱度、水分）2．控制有机和无机杂质的指标（澄清度、残留溶剂）3．与临床安全性密切相关的指标（异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等）4．其他指标（如β–内酰胺类“聚合物”的检查）

第6页,共87页，星期六，2024年，5月（三）含量测定或效价测定

1．微生物检定法

─以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生素效价（potency）的一种方法。

其测定方法有管碟法、浊度法。对分子结构复杂、多组分的抗生素，仍为首选方法。第7页,共87页，星期六，2024年，5月优点1、与临床应用一致2、灵敏度高3、适应范围广缺点1、操作繁琐2、培养时间长3、测定误差大第8页,共87页，星期六，2024年，5月2．理化方法

─根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行的。优点1、准确度高2、简单、快速1、不一定代表生物效价缺点2、易受杂质干扰对所选理化方法的要求：正确、专属、省时、用样少、试剂易得、操作简单、结果与生物效价吻合，如HPLC法。第9页,共87页，星期六，2024年，5月3、抗生素活性表示方法

抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。用单位（u）表示或微克（µg）表示。如1mg青霉素钠为1670单位，1mg青霉素钾为：1×M青霉素钠/M青霉素钾×1670=1598单位第10页,共87页，星期六，2024年，5月三、抗生素分类

β–内酰胺类氨基糖苷类四环素类氯霉素类大环内酯类其他类第11页,共87页，星期六，2024年，5月第二节β-内酰胺类抗生素

包括青霉素族和头孢菌素族化学结构：青霉素类头孢菌素类6-APA7-ACA1432435126第12页,共87页，星期六，2024年，5月青霉素（青霉素G、苄青霉素）氨苄西林

（氨苄青霉素）第13页,共87页，星期六，2024年，5月阿莫西林（羟氨苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH普鲁卡因青霉素第14页,共87页，星期六，2024年，5月头孢羟氨苄头孢氨苄第15页,共87页，星期六，2024年，5月一、结构特点：1)青霉素和头孢菌素分子中都有一个游离羧基和酰胺侧链。2)氢化噻唑环或氢化噻嗪环与β-内酰胺并合的杂环，分别构成二者的母体：6-APA、7-ACA。3)青霉素分子中含有三个手性碳原子(C3、C5、C6)，头孢菌素分子中含有两个手性碳原子(C6、C7)。第16页,共87页，星期六，2024年，5月性质1：酸性与溶解度分子中游离羧基具有相当强的酸性，能与无机碱或某些有机碱形成盐。其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂。第17页,共87页，星期六，2024年，5月性质2：旋光性青霉素族分子中含有三个手性碳原子，头孢菌素族含有两个手性碳原子，故都具有旋光性。根据此性质，可用于定性和定量分析。﹡﹡﹡﹡﹡第18页,共87页，星期六，2024年，5月

性质3：紫外吸收特性2、头孢菌素类

母核有共轭体系

1、青霉素类母核无明显UV

多数有苯环取代基

第19页,共87页，星期六，2024年，5月

性质4：β-内酰胺环不稳定性

干燥条件下青霉素盐稳定。青霉素水溶液在pH6-6.8时较稳定。β-内酰胺环是该类抗生素结构最不稳定的部分。四元环张力大

酰胺键易水解不稳定性因素（某些金属离子）（温度）某些氧化剂、羟胺第20页,共87页，星期六，2024年，5月例青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2例第21页,共87页，星期六，2024年，5月1．羟肟酸铁反应青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。

二、鉴别试验：(一)呈色反应+第22页,共87页，星期六，2024年，5月例：ChP(2005)头孢哌酮[鉴别]

取本品10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液[取34.8%盐酸羟胺溶液1份，醋酸钠-氢氧化钠溶液1份，乙醇4份]3ml，振摇溶解后，放置5min，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。第23页,共87页，星期六，2024年，5月2．类似肽键的反应（1）某些具有α-氨基的本类药物，如氨苄西林，遇茚三酮即显蓝紫色。

△第24页,共87页，星期六，2024年，5月α-氨基、伯胺某些羟基胺类酮式烯醇式茚三酮茚三酮缩合蓝紫色第25页,共87页，星期六，2024年，5月（2）双缩脲反应β-内酰胺类似肽键（开环分解）紫红色-内酰胺类碱性铜溶液¾¾¾¾¾®b第26页,共87页，星期六，2024年，5月（1）与重氮苯磺酸呈色反应

（偶合）3．其他显色反应第27页,共87页，星期六，2024年，5月（偶合）头孢哌酮第28页,共87页，星期六，2024年，5月（2）硫酸-硝酸呈色反应

头孢菌素能与硫酸-硝酸反应后呈色。此显色反应可区别某些头孢菌素族抗生素，因此被一些国家药典采用供鉴别。如中国药典(1995年版)收载的头孢噻吩钠呈红棕色；头孢氨苄呈黄色；头孢噻肟钠呈亮黄色。第29页,共87页，星期六，2024年，5月（3）变色酸-硫酸呈色反应

中国药典(1995年版)采用本法鉴别。如阿莫西林林加变色酸-硫酸试剂混合后，于150℃加热2-3min，因分解出甲醛与变色酸缩合而呈深褐色。第30页,共87页，星期六，2024年，5月（二）沉淀反应溶于过量HCl或有机溶剂第31页,共87页，星期六，2024年，5月例青霉素钠青霉素钾Ch.P（2000）

【鉴别】（2）取本品约0.1g，加水5ml溶解后，加稀盐酸2滴，即生成白色沉淀；此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或过量的盐酸中溶解.第32页,共87页，星期六，2024年，5月2.重氮化-偶合反应芳香第一胺类反应普鲁卡因青霉素重氮化红色↓碱性β-萘酚（偶合）第33页,共87页，星期六，2024年，5月例普鲁卡因青霉素Ch.P（2000）

【鉴别】（3）本品显芳香第一胺类的鉴别反应（附录Ⅲ）。第34页,共87页，星期六，2024年，5月K+火焰→紫色+0.1%四苯硼钠+HAc→↓白（三）钾、钠离子的焰色反应Na+火焰→鲜黄色+醋酸氧铀锌→↓第35页,共87页，星期六，2024年，5月例青霉素钠Ch.P（2005）

【鉴别】（4）本品显钠盐的火焰反应（附录Ⅲ）。例青霉素钾Ch.P（2005）

【鉴别】（3）本品显钾盐的火焰反应（附录Ⅲ）。第36页,共87页，星期六，2024年，5月

头孢氨苄

λmax=262nm青霉素V钠

A280nm/A264nm

=1.30～1.50A,Emin,max,,%cm11λ光谱图λ2、紫外分光光度法(UV)（四）光谱法1、红外吸收光谱法第37页,共87页，星期六，2024年，5月（五）色谱法1、TLC法对照品对照法2、HPLC法和斑点颜色比较供试品对照品相同条件fR¾¾¾®¾Rt比较供试品对照品相同条件¾¾¾®¾第38页,共87页，星期六，2024年，5月三、特殊杂质的检查

本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物、有关物质、异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。第39页,共87页，星期六，2024年，5月四、含量测定（一）电位配位滴定法——汞量法*β－内酰胺类不直接与汞盐反应*β－内酰胺类水解产物可与汞盐发生定量反应1.原理第40页,共87页，星期六，2024年，5月水解水解青霉胺络汞Ch.P（2000）青霉素钾青霉素钠苯唑西林钠普鲁卡因青霉素氯唑西林钠第41页,共87页，星期六，2024年，5月NaOHpH4.6脱羧Hg(NO3)2pH4.62:1突跃11:1突跃2Hg(NO3)2pH4.6青霉胺络汞第42页,共87页，星期六，2024年，5月青霉胺与硝酸汞发生络合反应。先按2分子青霉胺与1分子汞离子的比例络合，发生第一次滴定突跃，但突跃范围很小，变化比较平缓，不宜用于做终点，继续用硝酸汞滴定时，青霉胺分子与汞离子按1:1的比例络合，生成稳定的络合物——青霉胺络汞，发生第二次滴定突跃。其突跃范围较大，变化较急剧，宜于确定终点。第43页,共87页，星期六，2024年，5月2.方法醋酸盐缓冲液滴定水解pH4.6pH4.6滴定第44页,共87页，星期六，2024年，5月3.讨论（1）电位法指示终点，以第二次滴定突跃为终点反应摩尔比1:1

（2）空白试验

用未降解样品测定（3）优点

不需标准品第45页,共87页，星期六，2024年，5月例青霉素钠Ch.P（2000）

【含量测定】取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀,放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液（pH4.6）20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法（附录ⅦA）,用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在35~40℃，用硝酸汞滴定液（0.02mol/L）缓慢滴定，（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。第46页,共87页，星期六，2024年，5月每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的总青霉素（按C16H17N2NaO4S计算）。另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下,立即用硝酸汞滴定液（0.02mol/L）滴定，滴定终点判断方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S计算）。每1mg的C16H17N2NaO4S相当于1670青霉素单位。第47页,共87页，星期六，2024年，5月（二）RP-HPLC法特点快速高效灵敏度高专属性强重现性好一法多用(鉴别、检查、含测)Ch.P第48页,共87页，星期六，2024年，5月第三节氨基糖苷类抗生素链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素第49页,共87页，星期六，2024年，5月链霉素链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元链霉双糖胺链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺链霉胍第50页,共87页，星期六，2024年，5月庆大霉素

糖

苷元绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺

糖

绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺第51页,共87页，星期六，2024年，5月庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3

庆大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

庆大霉素C1aR、R1、R2=H

庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H

庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3第52页,共87页，星期六，2024年，5月一、结构与性质多与硫酸成盐链霉素3个庆大霉素5个碱性中心（一）碱性水溶性（二）溶解性（四）

UV（三）苷的水解与稳定性链霉素pH5～7.5庆大霉素pH2～12

稳定链霉素在230nm处有吸收，庆大霉素、奈替米星无吸收第53页,共87页，星期六，2024年，5月坂口反应N-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应第54页,共87页，星期六，2024年，5月二、

鉴别试验

茚三酮反应（一）△羟基胺结构硫酸庆大霉素鉴别取本品约5mg，加水1ml溶解后，加0.1％茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即显紫蓝色。

第55页,共87页，星期六，2024年，5月链霉胍特有反应（或α-萘酚）8-羟基喹啉坂口反应（二）α-萘酚第56页,共87页，星期六，2024年，5月

麦芽酚反应（三）

链霉糖特征反应H+分子重排扩环第57页,共87页，星期六，2024年，5月紫红麦芽酚第58页,共87页，星期六，2024年，5月N-甲基葡萄糖胺反应（四）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色（Elson-Morgan反应）H+第59页,共87页，星期六，2024年，5月（五）反应H+光谱法（七）庆大霉素无UV吸收色谱法（六）第60页,共87页，星期六，2024年，5月三、

杂质检查链霉素杂质链霉素B（甘露糖链霉素）方法TLC中的对照品法（BP）1.来源反应中间体第61页,共87页，星期六，2024年，5月四、

含量测定链霉素、庆大霉素微生物检定法

本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。第62页,共87页，星期六，2024年，5月离子交换色谱法离子对色谱法RP-HPLC法HPLC法第63页,共87页，星期六，2024年，5月第四节四环素类抗生素123456789101112第64页,共87页，星期六，2024年，5月四环素（TC）tetracycline金霉素

(CTC)

chlortetracycline第65页,共87页，星期六，2024年，5月土霉素

(OTC)

oxytetracycline氧四环素多西环素

(DOTC)doxycycline脱氧土霉素第66页,共87页，星期六，2024年，5月第67页,共87页，星期六，2024年，5月一、结构与性质两性（一）酚羟基、烯醇型羟基

弱酸性二甲胺基

弱碱性1.与酸、碱均能成盐，临床多用盐酸盐2.强酸或强碱中溶解度↑

第68页,共87页，星期六，2024年，5月吸湿性（二）多含结晶水生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+旋光性、UV、荧光（三）与金属离子络合（四）pH3~7.5荧光

第69页,共87页，星期六，2024年，5月第70页,共87页，星期六，2024年，5月不稳定性（五）（1）差向异构化淡黄→黑蓝色荧光第71页,共87页，星期六，2024年，5月（土霉素、多西环素不易发生差向异构化）第72页,共87页，星期六，2024年，5月（2）降解反应（1）酸性下降解λmax=445nmλmax=435nm橙黄色第73页,共87页，星期六，2024年，5月脱水四环素第74页,共87页，星期六，2024年，5月～～TCETCATCEATC＜＜第75页,共87页，星期六，2024年，5月（3）碱性下降解（荧光）第76页,共87页，星期六，2024年，5月二、鉴别试验

浓H2SO