药物的含量测定

关于药物的含量测定第一节概述药物的含量测定评价药物质量的主要指标。运用化学、物理或生物化学的方法和技术，测定药物中主要有效成分的含量。定义第2页,共73页，星期六，2024年，5月药物的含量测定化学、物理学、生物学方法方法利用某些生物学特性或特殊反应来定性、定量化学反应如光吸收特性、浊度第3页,共73页，星期六，2024年，5月药物的含量测定基于化学或物理学原理的含量测定。分两类基于生物学原理的效价测定。基础生物检定法，微生物检定法，酶法。目标含量测定。第4页,共73页，星期六，2024年，5月含量方法要求化学原料药（API)：根据药物的化学结构、理化性质等特点综合考虑适宜的含量测定法。选用的含量测定法应能准确测试有效成分的含量，其准确度和精密度均高。制剂：可能时应选用与原料药相同的测定方法，共存药物、辅料、附加剂有干扰时，可考虑增加预处理或改进方法,但专属性要强。第5页,共73页，星期六，2024年，5月含量表示方法（一）原料药含量的表示法原料药一般以百分含量表示，指样品中被测成分（一般为活性物质）的百分含量。一般按干燥品计算。药典凡例规定：“按干燥品（或无水物，或无溶剂）计算”时，除另有规定外，应取未经干燥（或未去水，或未去溶剂）的供试品进行试验，并将计算中的取用量按检查项下测得的干燥失重（或水分，或溶剂）扣除。因此：含量%（干燥品计）=直接测得量÷（1-干燥失重）第6页,共73页，星期六，2024年，5月（二）药物制剂含量的表示法一般以相当于标示量的百分数表示，指一个制剂单位中平均含有的药物成分为制剂标准的“规格”项规定量的百分数。如：对乙酰氨基酚片，规格0.5g，经含量测定测得平均每片含对乙酰氨基酚0.45g，则标示量为90%。第7页,共73页，星期六，2024年，5月固体制剂含量测定结果的计算

%100%´=标示量每片实测含量含量100％´´平均片重==标示量供试品重测得量标示量平均片重供试品重测得量100％´第8页,共73页，星期六，2024年，5月原料药制剂第9页,共73页，星期六，2024年，5月物质的量

效价生物学法（基于生物学原理）

药物含量测定方法化学法（基于化学原理）容量分析法、重量分析仪器分析法（基于物理学原理）光谱法、色谱法第10页,共73页，星期六，2024年，5月具体方法容量分析法：包括重量分析法、滴定法（直接、间接滴定法）光谱分析法：UV、IR、色谱分析法：HPLC、GC第11页,共73页，星期六，2024年，5月第二节、容量分析法

为经典方法，原料药分析常采用。常产生滴定误差，如指示剂和仪器容量

特点：1、快速,准确（RSD<0.2％）,灵敏度高；2、适合于中、高含量组分分析（1%）；3、仪器简单，操作方便，适用范围广；第12页,共73页，星期六，2024年，5月按滴定方式分：

直接滴定法间接滴定法滴定法生成物滴定法（置换滴定）剩余量滴定法容量分析法分类滴定度（T）：每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量(mg)第13页,共73页，星期六，2024年，5月酸碱滴定：在水溶液中以酸碱中和反应来测定物质含量的方法配位（络合）滴定法：以形成稳定配合物的配位反应为基础的滴定分析法。用于金属离子的测定采用金属指示剂（如铬黑T），如EDTA（乙二胺四醋酸二钠）氧化还原滴定法：碘量法：如碘滴定液、硫代硫酸钠滴定液、淀粉指示剂溴量法：Na2S2O3滴定液、Br2滴定液按反应类型分：第14页,共73页，星期六，2024年，5月沉淀滴定法：以沉淀反应为基础，多以硝酸银为滴定液，也称银量法。按所用指示剂的不同分为铬酸钾指示剂法铁铵矾指示剂法吸附指示剂法非水滴定法：在非水溶剂（有机溶剂与不含水的无机溶剂）中进行滴定分析的方法。

非水碱量法：是以冰醋酸为溶剂，高氯酸为滴定液，甲紫微指示剂，测定弱碱性药物及其盐类非水酸量法：是在碱性溶液中，以甲醇钠为滴定液，麝香草酚蓝为指示剂，二甲基甲酰胺等为溶剂，滴定弱酸性药物第15页,共73页，星期六，2024年，5月滴定法的计算滴定度(T)的计算在容量分析中，被测药物(B)与滴定液(A)之间都按一定的摩尔比进行反应的，滴定反应可表示为：aA(待测物）＋bB（滴定液）→cC＋dD滴定液反应的质量被测药物反应的质量被测药物的摩尔质量滴定液的摩尔质量第16页,共73页，星期六，2024年，5月m→滴定液浓度(mol/L)M→被测物质分子量a/b

→为反应式配平后滴定液与被测物的摩尔比

T=（a/b）×m×M第17页,共73页，星期六，2024年，5月示例一计算Vc的滴定度T碘量法测定Vc含量[M(C6H6O6)=176.13]，C(I2)=0.05mol/LMb=0.05mol/L11MA=176.13第18页,共73页，星期六，2024年，5月示例二异烟肼的滴定度溴酸钾法测定异烟肼含量[M(C6H7N3O)=137.14]，C溴酸钾=0.01667mol/Lab第19页,共73页，星期六，2024年，5月直接滴定法计算公式在实际工作中，滴定液的浓度可能与药典规定的浓度并不一致，所以应该进行校正滴定时，供试品消耗滴定液的体积，ml浓度校正因子试品的质量，g第20页,共73页，星期六，2024年，5月先计算T再计算含量正确求a和b第21页,共73页，星期六，2024年，5月剩余滴定法计算公式也叫回滴定法，本法常需空白试验，含量测定结果的计算：

第22页,共73页，星期六，2024年，5月例题：非那西丁含量测定：精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小时后，放冷，用亚硝酸钠液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N。计算非那西丁的含量为？第23页,共73页，星期六，2024年，5月例：精密称取青霉素钾供试品0.4021g，按药典规定用剩余碱量法测定含量。先加入氢氧化钠液(0.1mol/L)25.00ml，回滴时消耗0.1015mol/l的盐酸液14.20ml，空白试验消耗0.1015mol/l的盐酸液24.68ml。求供试品的含量，每1ml氢氧化钠液(0.1mol/L)相当于37.25mg的青霉素钾。

第24页,共73页，星期六，2024年，5月例．非那西丁含量测定：精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小时后，放冷，用亚硝酸钠液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N。计算非那西丁的含量为（）A.95.55%B.96.55%C.97.55%D.98.55%E.99.72%第25页,共73页，星期六，2024年，5月光谱分析法药典收载紫外可见分光度法原子吸收分光光度法红外分光度法荧光分析法火焰光度法第26页,共73页，星期六，2024年，5月第三节分光光度法分光光度法:

是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。光是电磁波,常用的波长范围为：(1)200～400nm----紫外光区；(2)400～760nm----可见光区；(3)760～2500nm（12800cm-1～4000cm-1）----近红外光区(4)2.5～25μm（按波数计为4000cm-1～400cm-1）----红外光区。第27页,共73页，星期六，2024年，5月紫外可见分光度法方法特点与适用范围1、简便易行：本法使用的仪器价格比较低廉，操作简单，易于普及2、灵敏度高：本法灵敏度可达10-7~10-4g/ml，适用于低浓度试样分析3、准确度较高：本法误差在2%~5%之间，适用于对测定结果的准确度要求较高的样品4、专属性较差：本法通常不受一般杂质的干扰，但对结构相近的有关物质缺乏选择性。本法比较少应用于原料药的含量测定，可用于制剂的含量测定，更多的应用于生物制剂的定量检查本法紫外区须选用石英比色皿，比色皿一般为1cm，吸光度在0.3~0.7之间为宜，选用最大吸收光波长。第28页,共73页，星期六，2024年，5月紫外-可见分光光度法物质吸收紫外和可见光区的电磁波产生的吸收光谱进行定性和定量分析的方法1.基本原理：朗伯─比耳定律

A为吸收度；T为透光率；L为液层厚度，单位为cm；E为吸收系数，常用的是百分吸收系数和摩尔吸收系数表示；C为100ml溶液中所含被测物质的量g第29页,共73页，星期六，2024年，5月吸收系数%1110cmEM·=e摩尔吸收系数(ε)溶液浓度液层厚度百分吸收系数溶液浓度液层厚度第30页,共73页，星期六，2024年，5月2.仪器的基本结构钨灯（6～12V），产生320～3200nm的连续光谱，其适宜的波长是360～1000nm。氢灯发射150～400nm波长的光，适用于200～400nm波长。光源单色器吸收池检测器数据记录处理第31页,共73页，星期六，2024年，5月（2）吸收度的准确度吸收度的准确性用基准重铬酸钾硫酸溶液检定60mgk2Cr2O7,释稀1000ml，在规定波长处测定吸收度，计算吸收系数E，相对误差度在±1%以内。（3）分辨率测定波长(nm)235(min)257(max)235(min)235(max)吸收系数-E124.5144.048.6106.6（1）波长的准确度

3.仪器的校正和检定第32页,共73页，星期六，2024年，5月《中国药典》2010版对吸光度的测定做了以下要求：（1）溶剂：要求：能溶解样品，挥发性小，对光波吸收少。

溶剂吸收度（以空气为空白）在220-240nmA＜0.4在241-250nmA＜0.20在251-300nmA＜0.1300nm以上A＜0.054.吸光度的测定

第33页,共73页，星期六，2024年，5月（2）空白试验校正：采用空白对照，将溶剂装入吸收池，放入光路调节，仪器使吸收度为0（或透光率100%），然后再测样品。

（3）测定波长的核对：为了提高测定灵敏度，减少测定误差，吸收度一般应在测定，测定样品的与文献记载对照，应在规定波长±2nm以内。

（4）供试品溶液的浓度：为了减少误差，应考虑使吸光度在0.3～0.7范围内第34页,共73页，星期六，2024年，5月（１）对照品比较法：（２）吸收系数法：（３）标准曲线法：5.含量测定：第35页,共73页，星期六，2024年，5月(1)对照法供试品溶液的吸光度对照品溶液的吸光度供试品溶液的浓度对照品溶液的浓度第36页,共73页，星期六，2024年，5月(2)吸收系数法计算第37页,共73页，星期六，2024年，5月(3)标准曲线法配制系列浓度的对照品溶液，在λmax处测吸收度A，做吸光度—浓度曲线，测试样品时，根据A在标准工作曲线上查C。第38页,共73页，星期六，2024年，5月（1）空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。（2）测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。（3）在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池3～4次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损），放入样品室每次方向应一致。（4）取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。若吸收池内外壁沾污，用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻擦试，再用纯化水冲净。（5）仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，并应经常校准波长精度。6.注意事项第39页,共73页，星期六，2024年，5月特点：灵敏度高，可达10-10～10-12g/ml

要求低浓度下测定须做空白测定荧光弱的药物可衍生化后测定二、荧光分析法第40页,共73页，星期六，2024年，5月第四节色谱分析法色谱法：是一种物理或物理化学分离分析方法。分离机制：分配、吸附、离子交换、分子排阻及亲合色谱法优点：高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快、应用范围广。应用：各国药典中广泛用作纯度检查、含量测定。分类：流动相：气体→气相色谱法液体→液相色谱法固定相：固体或液体气－固色谱法；气－液色谱法；液－固色谱法；液－液色谱法操作形式：柱色谱法、平板色谱法、电泳法第41页,共73页，星期六，2024年，5月一、HPLC色谱法及定量方法（一）主要参数：1.基线：没有样品进入检测器时，噪音随时间的变化。2.保留时间tR：从进样到组分色谱峰顶点的时间进样tRh0.5hWh/2Wt第42页,共73页，星期六，2024年，5月3.峰高h/峰面积：从最高点到基线的距离（峰与基线围成的面积）。4.峰宽W：拐点作切线在基线上的载距。W越窄柱效高。5.半峰宽Wh/2点：峰高一半处的峰宽。6.理论塔板数：

n=5.54(tR/wh/2)2

，一般n>103

，n越大柱效高进样tRh0.5hWh/2Wt第43页,共73页，星期六，2024年，5月7.分离度

R＝2（tR2－tR1）/（W1＋W2）R≥1.5认为分离完全W1W2TR2-tR1第44页,共73页，星期六，2024年，5月（二）基本原理

待分离物质在两相间进行分配时，在固定相中溶解度较小的组分，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定相中溶解度较大的组分，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。依固定相与流动相极性的不同，分为正相色谱和反相色谱1.正相色谱法

流动相极性小于固定相一般用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相，主要用于分离极性化合物，极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。2.反相色谱法

流动相极性大于固定相一般用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相，主要用于分离非极性或弱极性化合物，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。第45页,共73页，星期六，2024年，5月（三）固定相和流动相1.固定相

常用化学键合相，分极性和非极性键合相，如十八烷基硅烷键合硅胶（C18或ODS）和辛基硅烷键合硅胶（C8）为最常用的非极性键合相，用于反相色谱法；氨基和氰基硅烷键合相为常用的极性键合相，用于正相色谱法。2.流动相

有机溶剂+水混合一般为色谱纯试剂，经0.45um的微孔滤膜过滤，需脱气处理

第46页,共73页，星期六，2024年，5月（四）仪器的基本结构第47页,共73页，星期六，2024年，5月1.色谱柱柱管-不锈钢，填充硅胶和化学键合固定相内径4.6mm长15cm、20cm和25cm的三种，如安捷伦色谱柱、Waters色谱柱、迪马色谱柱等。第48页,共73页，星期六，2024年，5月2.检测器常用紫外检测器其次有二极管阵列检测器(DAD)荧光检测器示差折光检测器蒸发光散射检侧器电化学检测器和质谱检测器等

第49页,共73页，星期六，2024年，5月（五）系统适用性试验定义：指用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。包括柱温、柱长、固定相、流动相；理论板数：说明分离过程，色谱柱的塔板数越多，柱效越高；分离度：应大于1.5；重复性：相对标准偏差应不大于2.0%；等；第50页,共73页，星期六，2024年，5月（六）在杂质检查和含量测定中的应用

1.内标法（加校正因子）方法：内标物+对照品→对照溶液，进样，测定，计算校正因子。RRssCACAf=校正因子CR对照品浓度As内标物峰面积CS内标物浓度AR对照品峰面积供试品+内标→供试品溶液，进样，测定供试品和内标物质的峰面积或峰高，计算含量f=————A’S/C’SAx/CxCx=f·————

AxA’S/C’SCx样品浓度Ax样品峰面积第51页,共73页，星期六，2024年，5月例.HPLC法测定盐酸阿夫唑嗪片（规格：5mg）的含量：取盐酸特拉唑嗪约20mg，称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得内标溶液。取盐酸阿夫唑嗪对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液，精密取该储备液1ml，置100ml量瓶中，精密加内标溶液5ml，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液；另取本品20片，精密称定，研细，精密称细粉适量（约相当于阿夫唑嗪10mg），置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，置100ml量瓶中，精密加内标溶液5ml，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得样品溶液。分别精密取对照品溶液和样品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算含量。第52页,共73页，星期六，2024年，5月操作：对照品取样为10.1mg，20片重为1.6020g，取样细粉称重158.2mg，测得对照品溶液中盐酸阿夫唑嗪和内标的峰面积分别为5470124和6126012，样品溶液中阿夫唑嗪和内标的峰面积分别为5219986和61198978，计算本品的含量。第53页,共73页，星期六，2024年，5月解：对照品浓度：0.0101mg/ml,内标浓度：0.01mg/mgf=(AS/CS)/(AR/CR)=(6126012/0.01)/(5470124/0.0101)=1.13CX=f×AX/(AS/CS)=1.13×5219986/(6119898/0.0100)=0.009735mg/ml=[（0.009735×100×10/158.2)×（1.6020/20）/5]×100%=98.58%100％××平均片重==标示量供试品重测得量含量％标示量平均片重供试品重测得量100％×第54页,共73页，星期六，2024年，5月第55页,共73页，星期六，2024年，5月例.HPLC法测定单硝酸异山梨酯注射液（规格：5ml:20mg）的含量：取间三甲氧基苯约20mg，称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得内标溶液。取单硝酸异山梨酯对照品约8mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加内标溶液5ml，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品2ml，同法测定，按内标法以峰面积计算含量。已知：对照品取样为8.1mg，测得对照品溶液中单硝酸异山梨酯和内标的峰面积分别为5467824和6125843，样品溶液中单硝酸异山梨酯和内标的峰面积分别为5221345和6122845，计算本品的含量。第56页,共73页，星期六，2024年，5月解：f=(AS/CS)/(AR/CR)=(6125843/0.01)/(5467824/0.081)=9.07

CX=f×AX/(AS/CS)=9.07×5221345/(6122845/0.01)=0.07735mg/ml

100％××装量==标示量取样量测得量含量％标示量装量取样量测得量100％×=[(0.7735×100/5)×2/20]×100%=96.68%第57页,共73页，星期六，2024年，5月2.外标法对照液（R）：ARCR

供试液（X）：AXCXCXCRAXAR——＝——CX＝————CR·AXAR要求：进样量准确、操作条件稳定第58页,共73页，星期六，2024年，5月A总=∑Ai=A1+A2+…+Anⅰ(%)=Ai/A总×100%

例题7用气相色谱法检查大豆油的脂肪酸组成，相应于棕榈酸、硬酯酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的峰面积分别为129758、43286、296522、654868、92570，按峰面积归一化法，计算上述脂肪酸的百分含量。3、面积归一化法第59页,共73页，星期六，2024年，5月二、气相色谱法1.分离原理注入进样口的样品经加热气化后，被载气带入色谱柱，由于其分配系数的不同进行分离，各组分先后进入检测器，信号记录仪、积分仪和数据处理系统记录色谱信号。分配系数小的组分先流出，分配系数大的组分后流出。第60页,共73页，星期六，2024年，5月2.色谱仪的基本结构由载气源、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成第61页,共73页，星期六，2024年，5月３.载气（流动相）：

如氦、氮和氢等

４.进样器：直接进样或顶空进样

微量注射器第62页,共73页，星期六，2024年，5月５.固定相和载体色谱柱为填充柱或毛细管柱

常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛细管柱填充柱第63页,共73页，星期六，2024年，5月６.检测器火焰离子化检测器（FID)、热导检测器(TCD)、氮磷检测器（NPD)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)、质谱检测器(MS)７.色谱系统适用性和含量测定中的应用同高效液相色谱法第64页,共73页，星期六，2024年，5月第五节药品含量测定方法验证1专属性

2线性及其范围

3精密度

4准确度

5检测限6定量限

7耐用性第65页,共73页，星期六，2024年，5月一、专属性(Specificity)指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰的一种方法。A-对照品B-样品C-阴性第66页,共73页，星期六，2024