分子生物学重点考点总结详细

分子生物学总结蛋白质分子病(MolecularDiseases)结构异常，分子减少或缺失所引起的疾病。例子：镰刀状细胞贫血(Sicklecellanemia)(anemia)——HbSHbSß223.HBSb亚基第6位谷变成疏水的缬，导致其溶解性降低而析出，镰刀状，溶血.蚕豆病：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏家族型高胆固醇血症：LDL受体缺乏痛风病：磷酸核糖焦磷酸合成酶缺乏白化病：酪氨酸酶缺乏糖尿病：胰岛素缺乏构象病：蛋白质折叠错误导致功能改变如帕金森氏病，AlzheimerAlzheimer’’s病,Madcowdiseases。各种氨基酸残基在不同的二级结构中出现的频率不同a.形成αα螺旋能力强的氨基酸有：Glu、Met、Ala、Leub.形成ββ折叠能力强的氨基酸有：Val、Ile、Tyrc.形成ββ转角能力强的氨基酸有：Pro、Gly、Asn、Asp、Ser一级结构：指多肽链中氨基酸的排列顺序，稳定因素：肽键二级结构：多肽链中某一段肽链中，邻近的氨基酸残基之间，通过氢键形成有规律重复的（α-螺旋和β折叠），部分有规律的（β转角和环）或无序的一种局部构象。超二级结构：由几个二级结构相互作用形成的有规律的组合体。又叫基序或motif。包括αα、ββ、βαβ等。结构域：超二级结构进一步组合折叠成半独立紧密的球状。相对独立并与该妃子功能特性相关的机构单位。基本类型包括：平行α/β型：(1）单绕平行ββ(2)双绕平行ββ片层；反平行β-型：(1)希腊花边ββ(2)升降ββ-筒；全α型：（1）升降螺旋束（2）希腊花边螺旋束；小不规则结构。三级结构：在二级结构，超二级结构及结构域基础上，一级结构相隔较远的aa残基以次级键相连，盘旋折叠成特定空间排布．稳定因素：侧链RR基团之间相互作用形成的各种非共价键，包括疏水键、氢键、离子键和范德华力等。四级结构：某些蛋白由两条或者两条以上的多肽链组成，每条多肽链为一个亚基。各个亚基之间的相对空间排布和相互作用形成四级结构。稳定因素为次级键。变性：物理化学因素使理化性质变化而引起生物学功能降低或改变的现象。实质是破坏维系蛋白质空间构象的次级键，但不涉及一级结构的改变。复性：在较弱的变性因素下，当出去变性因素后蛋白质可恢复其生物活性的现象。蛋白质前体激活的意义：（胰蛋白酶原的激活：防止自身的消化，同时产生级联反应，放大信号。）别构效应（allostericeffect）：指蛋白质与配基结合后能改变蛋白质的构象，而改变蛋白质的生物活性的现象。正协同效应：当第一个亚基与配体结合后，可促进下一个亚基与配体的结合。（以血红蛋白α1α2β1β2为例）导致AS的因素：环境因素：高脂膳食、缺乏运动、吸烟等遗传因素：肥胖、糖尿病低、LDL/VLDL升高、LP(a)升高、HDL低等等。血浆脂蛋白的结构：具极性及非极性基团的载脂蛋白、磷脂、游离胆固醇，以单分子层借其非极性疏水基团与内部疏水链相联系，极性基团朝外。疏水性较强的TG及胆固醇酯位于内核。四种主要脂蛋白的分离方法：超速离心法，即是根据脂蛋白在一定密度的介质中进行超速离心时漂浮速率不同而进行分离的方法。关键步骤是形成密度梯度。五种脂蛋白的组成：CM：含TG最多，蛋白质含量最少，主要为apoB48。VLDL：含TG也多，但蛋白质含量高于CM，主要为apoB100，CI，CII，CIII0~2LDL：含胆固醇及其酯最多，几乎只含apoB100HDL：及蛋白质含量最多，主要为apoAI和apoAII。Lp(a)：脂质成分类似于LDL,但多含一分子apo(a)，TG多于LDL，Ch少于LDL。乳糜微粒(CM,Chylomicron）：主要含有外源性甘油三酯，是运输外源性甘油三酯及胆固醇的主要形式。正常人血浆中的乳糜微粒空腹12小时后就被完全清除，不是动脉粥样硬化的主要危险因素，但容易诱发胰腺炎。极低密度脂蛋白(VLDL,VeryLowDensityLipoprotein)：是运输内源性甘油三酯的主要形式。正常人极低密度脂蛋白大部分代谢变成低密度脂蛋白。这类脂蛋白由于携带胆固醇数量相对较少，且它们的颗粒相对较大，不易透过血管内膜，因此，正常的极低密度脂蛋白没有致动脉硬化作用，像乳糜微粒一样也不是冠心病的主要危险因素，极低密度脂蛋白代谢产生的中密度脂蛋白具有致动脉硬化作用。VLDL大小为30-80nm，含有甘油三酯、胆固醇、胆固醇酯和磷脂，TG占50％左右，蛋白质部分为ApoAⅠ、AⅣ、B100、C、E等。VLDL在肝脏合成，利用来自脂库的脂肪酸作为合成材料，其中胆固醇来自CM残粒及肝自身合成的部分。低密度脂蛋白(LDL,LowDensityLipoprotein)：LDL是富含胆固醇的脂蛋白，其胆固醇主要来自从CE运的高密度脂蛋白中的胆固醇。目前认为血浆LDL来源有两条途径：①主要途径是由VLDL异化代谢转变而来；②次要途径是肝合成后直接分泌到血液中。LDL的降解是经LDL受体途径进行代谢。当低密度脂蛋白过量时，它携带的胆固醇便积存在动脉壁上，久了容易引起动脉硬化。因此低密度脂蛋白被称为“坏的胆固醇”。甘油三酯及胆固醇酯构成内核,载脂蛋白、磷脂及胆固醇等兼性分子以单分子层借助其非极性的疏水基团与内核相连，而极性的亲水基团位于表面。高密度脂蛋白(HDL,HighDensityLipoprotein)：比较富含磷脂质，在血清中的含量约为300mg/dl。其蛋白质部分,AⅠ约为75％，AⅡ约为2020％。由于可输胆固醇促进胆固醇的代谢，所以作为动脉硬化预防因子而受到重视。HDL主要由肝和小肠合成。肝合成的新生HDL磷脂ApoAⅠ为主。在LCAT作用下，游离胆固醇变成胆固醇酯，脂蛋白则变成成熟球形HDL3,再经LPL作用转变成HDL2。HDL可将蓄积于末梢组织的游离胆固醇与血液循环中脂蛋白或与某些大分子结合而运送到各组织细胞，主要是肝脏。实际上是胆固醇逆转（RCR），RCT促进组织细胞内胆固醇的清除，维持细胞内胆固醇量的相对衡定，从而限制动脉粥样硬化的发生发展，起到抗动脉粥样硬化作用。Lipoproteins功能：CM:转运外源性甘油三酯及胆固醇酯；VLDL:转运内源性甘油三酯；LDL:将肝合成的内源性胆固醇转运至肝外组织；HDL:参与胆固醇的逆向转运。脂蛋白受体：脂蛋白受体是一类位于细胞膜上的糖蛋白，它们能以高亲和性的方式和其相应的脂蛋白配体相互作用，介导细胞对脂蛋白的摄取和代谢，从而进一步调节血浆脂蛋白和血脂的水平。a.参与脂蛋白代谢b.参与视黄酸和类固醇的内吞性摄取。如Megalin。c.参与体内细胞信号的传递，如LRP，VLDL-R及apoE--R2。LDL受体途径：LDL受体在细胞膜上以单体形式存在，当其与血浆中的LDL结合后，受体聚集成簇，并随被覆陷窝内陷，形成被覆小泡，被覆小泡脱去衣被后与内小体融合。LDL在内小体的酸性环境中与LDL受体分离。1.含受体部分的小泡成再循环小泡，又回到细胞表面—LDL受体的再循环途径。2.LDL被运送到溶酶体，并被溶酶体内的酶类分解，载脂蛋白（主要为apoB100）降解成氨基酸，胆固醇酯则被酸性酯酶水解为游离胆固醇。LDL受体的功能：1.结合LDL或其它含apoB100或apoE的脂蛋白，内吞入细胞以获得脂类，主要为胆固醇。2.50%LDL在肝脏经LDL受体途径降解。3.影响LDL的生成速率以及VLDL代谢，并能在CM代谢中发挥作用。LDL受体的结构：由839个氨基酸组成的单链多肽。包括蛋白质部分（93kD）；18个O-连接糖链，2个N-连接糖链。总分子量115kD。包括五个结构域：1，配体结合域：2，EDF前体同源域（与LDL受体的再循环途径有密切关系）；3，O-连接糖链的结构域，对LDL受体起支撑作用。4，跨膜域；5，胞浆域，序列Asn-Pro-X-Tyr是受体定位于被覆陷窝所必需。LDL受体基因突变（家族性高胆固醇血症）：1.用抗体或其他方法无法检得LDL受体；2.LDL受体不能或迟缓地转移到细胞表面；3.LDL受体不能结合LDL；4.受体结合LDL后不能内移。LDL受体家族：一类位于细胞膜表面，结构与LDL受体像是的内吞性受体所组成的。包括LDL受体，VLDL受体，LDL受体相关蛋白，apo-E受体-2等。LDL非受体代谢途径：血浆中的LDL还可被修饰，修饰的LDL如氧化修饰LDL(ox-LDL)可被清除细胞。即单核吞噬细胞系统中的巨噬细胞及血管内皮细胞清除。这两类细胞膜表面具有清道夫受体(scavengerreceptor,SR)，摄取清除血浆中的修饰LDL。Lp（a）：其中脂质组分和LDL相似，TG含量高于LDL，Ch少于LDL。apoB100于apo(a)以二硫键相连。结构：疏水性脂质为核心，外周包绕蛋白质和磷脂复合物。其含有Kringle结构域（由80个氨基酸残基组成，富含Cys并含有3个内部二硫键，形成一种形状颇似丹麦蛋糕结构。这个结构域和纤溶酶(plasminogen,PG)的分子结构。Lp(a)与动脉粥样硬化：1.Lp(a)是动脉粥样硬化的独立危险因素之一。Lp(a在血液中的含量分布差别极大(0~100mg/dL)。当a)＞30mg/dL时，表明As危险性增高。Lp(a)致As的机制：Lp(a)与纤溶酶原结构同源Lp(a)与纤溶酶原竞争底物的结合部位:Lp(a)中的apo(a)与纤溶酶原竞争同一底物纤维蛋白或纤维蛋白原，但由于apo(a)不具备酶的活性，导致其不能溶解或分解与其结合的纤维蛋白，相反它还促进纤维蛋白沉着于血管壁，参与血栓形成，继而启动As的发生和发展。Lp(a)竞争性抑制纤溶酶原与细胞纤溶酶原受体的结合。纤溶酶原受体的主要作用是加速纤溶酶原的活化，促进血栓的溶解，保护纤溶酶不被抑制。但由于Lp(a)的分子结构与纤溶酶原极为相似，因此它能与纤溶酶原竞争纤溶酶原受体，从而抑制血栓的溶解，促进血栓的形成。细胞信号转导受体：指细胞识别和结合化学信息分子（激动剂或抑制剂）并能激发靶细胞产生特异生物效应的细胞膜或者细胞核内的特殊蛋白质分子。受体的分类：质膜受体。a，离子通道性受体，又称为配体门控离子通道，受神经递质调控。主要在神经冲动传递中发挥作用；b，催化性受体，这类受体在其胞质面具有酪氨酸蛋白激酶的结构域，配体受体结合后，可激活酶使得受体具有催化活性。c，G蛋白偶联受体，这类受体接受的信息要G蛋白的转换才能传递到靶细胞中。胞内受体。核内受体。脂溶性因子透过细胞膜进入胞质后，与胞质或核内受体特异结合，调节某一特异基因的转录表达，从而调节靶细胞的代谢。受体作用的特点：1.受体与配体的结合具有高度特异性。2.受体与配体结合时高亲和力的。3.受体与配体结合具有可饱和性。4.受体与配体通过非共价键结合，因而具有可逆性。5.受体的数目和亲和力大小可以被调节。6.于配体相似的化合物，可发生竞争性抑制。7.具有协同和放大效应。G蛋白：G蛋白又称鸟苷酸结合蛋白，是一类能与鸟苷酸可逆结合的膜蛋白，广泛存在于多种细胞，结构相似，功能有别，共同构成G蛋白家族。G蛋白的结构：G蛋白种类多，单结构相似。都有α、β和γ亚基组成的杂三聚体。不同G蛋白有不同的α亚基，其具有特异性。但是都具有GTP和GDP结合位点。杂三聚体时没有活性，当α亚基与GTP结合时和其他两个亚基分离，具有GTP酶活性，并具有调节效应蛋白的活性。α亚基根据其功能和氨基酸序列不同，可分为Gs，Gi，Gq和G124类。β和γ亚基分别发现了8和12种，其主要功能是形成三聚体时抑制GTP酶活性。G蛋白跨膜传递信息的机制：含有7次跨膜的α螺旋，C端在胞内，胞外近N端胞有糖基修饰。C端丝氨酸或苏氨酸磷酸化可阻止受体于G蛋白的作用。未结合时G蛋白杂三聚体存在并结合GDP，当激素与受体结合后，活化受体与α亚基结合，分离GDP并结合GTP。从而使三聚体解聚。α亚基-GTP作用于效应器E（酶），或者βγ亚基作用于另一效应器。α亚基可使GTP水解为GDP，在于GDP结合而失活后，在重新形成杂三聚体。G蛋白在信息传递中的作用：调节腺苷酸环化酶的活性。β肾上腺素激活受体后，受体激活Gs，再激活腺苷酸环化酶，使得cAMP上升；α肾上腺素激活受体后，激活Gi，结果相反。调节视网膜cGMP磷酸二酯酶的活性。转导素Gt于视紫红质偶联激活。调节磷脂酶C的活性。G蛋白介导IP3和DG的生成。磷脂酶C可促进1，4，5三磷酸肌醇和甘油二酯的生产。调节离子通道的功能。小G蛋白：一条肽链，与G蛋白α亚基高度同源，也能与GTP和GDP结合，同时具有GTP酶活性。小G蛋白家族和21kD的Ras蛋白同源。其中Ras亚族调节细胞的增值，分化和凋亡。在胰腺癌，肺癌和结肠直肠癌肿的突变率为90，30，50.Ras蛋白基因突变或调节失常于人类肿瘤有关。G蛋白与疾病：肿瘤：ras癌基因产物P21于G蛋白有相同特性，能结合GTP。Ras可激活磷脂酶C，产生IP3和DG激活蛋白酶C，促进细胞增值。突变后，ras结合GTP后无法水解，持续激活。内分泌：典型假性甲状旁腺功能减退症对甲状腺激素反应降低，同时对多种能引起cAMP上升的反应降低，推测可能是Gs缺乏。药物成瘾和耐受：吗啡成瘾后，Gs活性减小而造成腺苷酸环化酶活性降低，产生戒断症状。霍乱毒素可屏蔽Gs的GTP活性，使得其持续激活，促使水分排出。可以用霍乱毒素使得戒断症状消失。cAMP信号传递途径：配体（多为激素：生在激素，促肾上腺皮质激素，促甲状腺激素等）与受体结合后激活受体→→G蛋白→→腺苷酸环化酶→→cAMP上升→→通过变构效应与蛋白激酶A的R亚基结合，激活C亚基→→磷酸化底物蛋白质的丝氨酸和苏氨酸(组蛋白H1，H2a，H2b，核糖体蛋白，膜蛋白，微观蛋白肌钙蛋白等）→→产生生物学效应，调节细胞代谢（磷酸化磷酸化酶b激酶，使得磷酸化酶b变为有活性的磷酸化酶a，使肝糖原降解，血糖升高）和基因表达（CRE，CREB和CBP）。OIP3，DG信号传递途径：也叫Ca2+-PLC依赖的蛋白激酶C信号途径。配体于受体结合并激活受体→→激活G蛋白（Gq）→→激活磷脂酶C（PI-PLC）β→→是PIP2分解为IP3和DG→→IP3和受体结合，释放内质网和肌质网中的Ca到胞浆中，Ca和DG一同激活蛋白激酶C（PKC）→→磷酸化底物蛋白（细胞因子受体，EGF受体，胰岛素受体）→→调节细胞代谢（糖原合酶，磷酸化Ca泵，是Ca内流）和基因表达（磷酸化c-fos，c-jun等原癌基因的反式作用因子，产生表达。这些立早基因的表达课激活晚期反应基因，使得细胞增值）。染色质与基因表达调控顺式作用元件：具有调节转录活性的特异DNA片段。反式作用因子：与顺式作用元件直接或间接相互作用，并能调节基因转录活性的蛋白质（或酶）。染色质(chromatin)：是细胞间期遗传物质的存在形式，是细胞间期核内伸展开的DNA蛋白质纤维。染色体(chromosome)：是细胞分裂中期遗传物质的存在形式，是高度螺旋化的DNA蛋白质纤维，是间期染色质结构紧密盘绕折叠的结果。常染色质(euchromatin):碱性染料着色浅而均一，DNA复制较早，对核酸酶敏感，富含基因、转录调节蛋白和乙酰组蛋白，核小体阵列不规则，压缩程度低。异染色质（heterochromatin):碱性染料着色深而不均一，DNA复制较晚而慢，对核酸酶不敏感，所含基因和转录调节蛋白少，富含高度重复序列、低乙酰组蛋白和异染色质相关蛋白，核小体阵列规则，高度压缩。遗传印记：无论从染色体水平还是等位基因水平，遗传物质的表现取决于它的亲代来源，父源和母源的遗传物质表达不同。这种由双亲性别决定的基因功能上的差异被称之为遗传印记(geneticimprinting)或亲代印记(parentalimprinting,PI)表观遗传学：某些个体表型改变不涉及到原有基因组DNA序列的变异和/或不遵循孟德尔遗传定律的遗传，而渊源于染色体另外层次的变化如CpG序列甲基化/去甲基化修饰，致使某些基因不表达/异常表达。启动子：位于基因编码区上游并为RNA聚合酶识别、结合和启动转录的DNA序列。TATA盒：启动子序列在真核细胞中，普遍存在两个保守序列或称为一致序列。Prinbnow盒，在真核中在-25到-30区，称为Goldberg-Hogness盒。核心启动子：TATA盒与转录起始位点式维持RNAP基础转录水平所需，具有独立和协调转录的功能。上游启动元件（UAS）：在原核基因转录起点-35外保守序列，在真核中位于-70左右，很多基因有CAAT盒（GCCAAT）和CG盒（GGGGCGG），称为UAS。增强子：能加强其上游或者上游基因转录的DNA序列。终止子：基因编码区下游能促进RNAP识别和终止RNA合成的DNA序列。沉默子：和增强子相反，能抑制上游或下游基因转录的DNA序列。隔离子：在真核基因组中建立独立转录活性结构域的调节元件。插入调节元件和启动子间，是其作用仅限于适宜的靶启动子，阻断增强子/启动子联络不当，防止阻遏态染色质扩展。又分为抗增强子和抗沉默子。基序或motif：HTH、亮氨酸拉链、锌指和ETS单顺反子：一个基因编码一条多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件。重复序列：指多拷贝的相同或相似的DNA片段。可分为高度重复和中度重复。卫星DNA：主要分布在染色体着丝点，一般不转录，可能与配对，重排和物种形成有关。卫星DNA通常是串联重复序列。卫星DNAI家族由42bp的单元组成微卫星：简单串联重复序列，一般重复单位为2~4个核苷酸。小卫星DNA：可变串连重复序列右又叫小卫星DNA，小卫星DNA的核心序列长10-70bp，主要分布于基因组的非编码区。基因组上存在着多位点的可变串连重复序列。不同个体基因组上同一可变串连重复序列的核心序列相同，但重复次数相差悬殊，因而长度变化较大，呈现多态性。可以用来鉴别个体或确认指正罪犯。端粒：人染色体端粒含有（TTAGGG）n的序列，短串联重复或长串联重复不等。反转座子：在基因组中移动或易位的DNA片段为转座元件。其中需要经过RNA中间体的反转录复制和易位的散在重复元件为反转座子。长散在重复元件（LINEs）每个单倍体基因组中至少105拷贝长度≧5kb的重复序列。短散在重复元件（SINEs）人基因组内由500000~1000000个拷贝长度在100~500bp。分布在内含子，非翻译区和各个基因间的间隔区。核小体：低离子强度溶液，使得间期细胞核肿胀、破裂并释放染色质，在电子显微镜下呈串珠状纤维，附着这的颗粒称为核小体。核小体是真核染色质的基本结构单位。组蛋白密码：核小体核心组蛋白N-端尾区，具细胞信息潜在的存储功能，是提供表型遗传信息的丰富来源，此信息可传递至子代；尾区位点修饰及其组合，构成一整套限定染色质局部转录状态的密码；这套由位点特异修饰酶所配置的密码，需相应（对位点修饰敏感并与此位点结合）的非组蛋白解读，以实现去全部信息潜在效应；这不仅需解读修饰组合的组蛋白，还需要维持这些非组蛋白解读位点适当的调控机制。重塑复合物：proteinmachinesthatusetheenergyofATPhydrolysistochangethestructureofnucleosomestemporarilysothatDNAbecomeslesstightlyboundtothehistonecore.多种蛋白质的复合物，依赖ATP的供能课暂时性的改变核小体的结构，是DNA链从核心组蛋白上松弛下来。产生三种效应，滑动，转移和重构。染色质的修饰于基因表达：一共6种修饰方式：DNA1种，组蛋白5种染色质DNA的甲基化/去甲基化；染色质组蛋白的甲基/去甲基化；染色质组蛋白的乙酰化/去乙酰化；组蛋白（以及转录因子）的磷酸化/去磷酸化；染色质组蛋白的泛素化/去泛素化；组蛋白（尾部）ADP-核糖基化。(重点是甲基化/去甲基化和乙酰化/去乙酰化）。DNA的甲基化/去甲基化多发生在副很CpG的短序列上。异染色质甲基化程度高。甲基化酶可使得基因组不稳定，胚胎死亡；肿瘤中一般涉及到多种癌基因低甲基化和多种抑癌基因的高甲基化失活。DNA甲基化对转录的抑制取决去其位点和程度的分布。DNMT1维持甲基化，NDMT3重头甲基化。胚胎血细胞中的球蛋白基因启动子的甲基化使其激活。组蛋白甲基化/去甲基化多发生在H3.H4赖氨酸残基的（K）ε氨基上；其次是精氨酸残基的（R）亚氨基和氨基上。由组蛋白甲基化酶或组蛋白甲基转移酶催化，并通常具有位点特异性。组蛋白的甲基化通常变现为基因的沉默，而去甲基化为基因表达开启。（精氨酸的甲基化可能涉及到基因激活）组蛋白乙酰化/去乙酰化发生在组蛋白赖氨酸的（K）ε氨基上，为组蛋白乙酰基转移酶或称乙酰化酶/组蛋白乙酰基转移酶或称去乙酰化酶催化的可逆反应。乙酰化（HAT）是氨基被乙酰基取代，正电荷减少和八聚体/DNA亲和力下降，加速核小体解聚；同时核小体间相互作用减弱，染色质压缩减小；DNA链松散后，多种转录因子和RNA聚合酶可进入核小体与模板接触，促进基因的表达。去乙酰化（HDAC）作用相反，使核小体聚集和阻遏态染色质稳定。磷酸化主要发生在丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸羟基上。组蛋白磷酸化与细胞凋亡有关。转录因子的磷酸化和去磷酸化可产生激活和失活效应，而转录因子不同而异。P53磷酸化后激活，促进形成四聚体，促进Mad2和其解离。维持P53的稳定。泛素为小分子酸性蛋白。泛素化涉及到ATP-依赖性蛋白质的解体。可参与基因正确有序表达，参与阻遏复合物和染色质重塑复合物的装配和调节，是信号调节途径中的调节因素，还涉及到DNA修复（泛素化某些因子，如增值细胞核抗原PCNA可加速DNA修复）。ADP-核糖基化，端粒的核糖基化后有利于端粒末端重复的延长和维持。PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）也与DNA的修复，凋亡，染色质激活和发育分化有关。基因突变基因突变：基因组DNA分子中发生碱基的增添、缺失或改变而引起的基因结构的改变，进而引起遗传表型的改变。碱基改变突变分类：点突变：DNA被化学修饰或复制时发生错配，使一个碱基变成另一个碱基。碱基插入突变：DNA链中插入1个或多个碱基（转座子Tn），突变后可引起DNA序列阅读框架改变。碱基缺失突变：DNA链中1个或多个碱基发生丢失，突变后可引起DNA序列阅读框架改变。基因突变的密码效应：同义突变：碱基被替代后没有密码子改变，其产物AA序列也无变化。错义突变：碱基序列的改变引起AA序列改变。无义突变：某个碱基改变使某个AA的密码子成为蛋白质合成的终止密码子。复等位基因(multipleallele)：位于同一基因位点上的多种各个等位基因。突变诱因：自发性突变：DNA复制过程中偶然碱基配对出现错误(10-9~10-10)。诱变剂的作用诱变剂（mutagen）外源诱发突变的因素，种类繁多，突变频率高。主要有以下几种：（1）物理因素：紫外线、电离辐射等。（2）生物因素：病毒、真菌、细菌等（3）化学因素：①烷化剂②碱基类似物:如5-BrU③其他化学诱变剂:羟胺、亚硝酸盐等。基因突变的一般特征：、突变的重演性和可逆性(二)、突变的多方向性与复等位基因(三)、随机性—生物个体发育的任何时期；体细胞突变—不遗传给后代；生殖细胞突变——遗传给后代(四)广泛性和有害性（多数）。定点突变：为了了解基因突变与其产物对个体表型的关系，有目的地在离体条件下制造位点特异突变。定点突变技术广泛应用与基因表达调控，遗传和蛋白质工程研究。定点突变技术包括各种核酸酶和突变剂制造突变技术；寡核苷酸介导的定点突变；PCR定点突变。（掌握其中一种）。寡核苷酸介导的定点突变：利用人工合成的寡核苷酸课制造任何部位的定点突变包括电突变、插入和缺失突变。原理：利用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段为引物，启动单链（环状）DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一部分，而新链具有突变。为了达到这个目的，所设计的引物序列除了突变碱基外，其余序列要和吧基因编码链的特定区域完全互补。程序：1，含有待突变基因的M13单链DNA合成（正链），待突变基因克隆到M13噬菌体上。2，突变寡核苷酸引物合成，应用化学方法。3，异源双链DNA分子的制备，突变引物的5'末端磷酸化后，于M13单链退火合成含有突变的异源dsDNA，在Klenow大片段酶作用下，引物以M13为模板合成，最后用T4DNA连接酶封闭缺口，合成闭环M13异源dsDNA。4，异源dsDNA转染大肠杆菌（后用Kunkel法和硫代磷核酸法不用纯化）。5，突变体筛选，用32P标记探针对噬菌斑杂交。6，突变基因鉴定与回收。提高效率的方法：硫代磷核苷酸诱变法：原理：限制性核酸内切酶AvaⅠ，AvaⅡ，BanⅢ，HindⅡ，NciⅠ，PstⅠ，PvⅠ等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的DNA。用硫代磷核苷酸如dCTPαS及dNTPs,在DNA聚合酶催化和DNA连接酶作用下，形成异源dsDNA分子，再用NciⅠ消化该异源dsDNA分子，可获的高效率的定点突变分子。特点：可获得很高的突变率（点突变，缺失和插入突变）。Kunkel定点诱变法：在诱变前，先将复制型的M13噬菌体转染到脱氧鸟苷三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶缺陷的大肠杆菌中（dut-，ung-）。Dut突变导致dUTP上升，而ung突变时尿嘧啶取代胸腺嘧啶。这种M13模板含有很多U，当合成异源双链时，新链含T，在转染到ung正常的菌中，使得含U模板链在ung下发生断裂而破坏，野生型噬菌体生成受抑制，突变型中不带U被大量复制。使得后代噬菌体中多带有突变目标。突变的检测：限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）单链构象多态性（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）等位基因特异性PCR（allelespecificPCR）毛细管电泳法（capillaryelectrophoresis）测序（sequencing）DNA芯片（chip）肿瘤相关基因癌基因(oncogene，onc.)是指细胞内或病毒内存在的，能控制细胞生长和分化的基因,它的结构异常或表达异常,可引起细胞癌变。原癌基因(proto-oncogene，pro-onc)正常细胞基因组中的细胞癌基因以非激活状态存在。病毒癌基因：存在于病毒基因组的癌基因称为病毒癌基因（v-onc）。它不编码病毒的结构成分，对病毒的复制也没有作用，但其异常表达或表达产物的异常可以使细胞持续增殖。细胞癌基因：存在于正常细胞基因组的癌基因称为细胞癌基因（c-onc）。在正常细胞内可以表达，其表达产物具有调节细胞生长、增殖和分化的功能。只有在一定的条件下发生改变而有过度表达时，才可能与肿瘤的发生有关。细胞癌基因的特点：广泛存在于生物界中；基因序列高度保守；作用通过其产物蛋白质来体现；被激活后形成癌性的细胞转化基因，导致正常细胞癌变。细胞癌基因的分类：根据表达产物的功能和定位将癌基因分为1.生长因子类;2.生长因子受体类;3.非受体酪氨酸蛋白激酶类；4.丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类；5.GTP结合蛋白类;6.核内转录因子类。原癌基因的激活因素包括，病毒，化学因素，辐射等。癌基因的激活机理：1.点突变：点突变改变了表达蛋白的氨基酸组成，造成蛋白质的结构异常。点突变常见于ras癌基因。ras基因的表达产物Ras是一种小分子G蛋白，在信号转导中起重要作用，ras基因的点突变主要发生在第12、13和61位，正常Ras的作用因其自身的GTP酶活性而受到严格控制，而突变了的Ras其GTP酶活性下降或丧失，失去了原有控制，致使增殖信号持续作用，细胞发生恶性转化。启动子插入：插入具有高活性的启动子或增强子，使原癌基因持久、过量地表达。插入的启动子或增强子来自细胞内（内源性）如：内源性逆转录病毒的LTR。插入的启动子或增强子来自细胞外（外源性）如：鸡B淋巴细胞瘤由于ALV的LTR插入c-myc的旁侧（5’或3’端），使c-myc过量表达。基因扩增：基因拷贝数的增加称为基因扩增。原癌基因扩增使转录模板增加，mRNA的水平增高，表达活性增加，产生过量的表达蛋白而导致肿瘤的发生。在某些造血系统恶性肿瘤中，癌基因扩增是一个极常见的特征，如前髓细胞性白血病病人的白血病细胞中，c-myc扩增8-32倍。4.染色体易位：原癌基因在肿瘤细胞中从染色体正常位置转移到其他某个位置上称为染色体易位。易位导致原来无活性的原癌基因移至启动子或增强子附近而激活。易位后失去原旁侧的抑制性调节作用，使其表达增强。抑癌基因：是正常细胞中所存在的能抑制肿瘤发生和生长的基因。也称为肿瘤抑制基因或隐性癌基因。Rb基因：结构：Rb是第一个被分离到的抑癌基因。人类Rb基因位于人13号染色体q14,全部序列约200kb,含27个外显子,可转录出4.7kb的mRNA,该mRNA编码分子量为105kD,故被称之为p105蛋白，能与DNA结合。pRb上有9个Ser和Thr位点，其中只有5个位点的磷酸化与其功能变化有关。pRb至少有4个蛋白结合域，N-端结构域与抑制细胞生长有关。pRb中间A、B两个结构域形成袋装结构，可特异与多种转录因子结合。功能：调节细胞周期。pRB具有两种形式:磷酸化与非磷酸化。非磷酸化的P105为非活性型,可抑制细胞增殖。磷酸化的P105为活性型可促进细胞增殖。pRB的磷酸化由周期素依赖性激酶(cyclindependentkinase,CDK)催化。周期素依赖性蛋白激酶(CDK)通过使特异底物磷酸化调节细胞周期进行，其活性依赖与周期素(cyclin)结合形成复合物。细胞周期的不同时相表达不同cyc-CDK，这些cyc-CDK复合物在各不同的细胞周期过渡点起作用。Rb基因对肿瘤的抑制作用与转录因子E-2F有关。E-2F是一类激活转录作用的活性蛋白，在G0、G1期，低磷酸化型的Rb蛋白与E－2F结合成复合物，使E－2F处于非活化状态；在S期，Rb蛋白被磷酸化而与E－2F解离，结合状态的E-2F变成游离状态，细胞立即进入增殖阶段。当Rb基因发生缺失或突变，丧失结合、抑制E-2F的能力，于是细胞增殖活跃，导致肿瘤发生。Rb基因与肿瘤：Rb基因的失活主要与视网膜母细胞瘤的发生相关。此外，乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、食管癌、骨肉瘤、膀胱癌等均表现出Rb基因的缺失或失活。P53基因：结构：p53基因定位17p13.1，长20kb，有11个外显子，10个内含子。p53基因转录生成2.5KbmRNA，编码生成393个氨基酸的蛋白质，分子量为53KD。P53蛋白的一级结构可分为三个结构域：第一个结构域：N-端17-80肽段富含酸性氨基酸，为酸性区（水解和磷酸化位点）。第二个结构域：75-150肽段为核心疏水区，是高度保守和突变区。（DNA结合位点，激活P21基因产生抑制因子P21。）第三个结构域：C-端319-393肽段富含碱性氨基酸，为碱性区。（四聚体和DNA非特异结合位）三个结构域的主要功能：N-端1-43肽段：具有转录因子活性，促进基因转录。中间102-292肽段：DNA结合区，能与DNA特异序列结合，结合时需要Zn2+参与。C-端300-393肽段为p53四聚体结合部位，该部位除与p53四聚体结合外，与DNA非特异结合也有关。功能：1)抑制细胞增殖：P53基因时刻监控着基因的完整性，一旦细胞DNA遭到损害，P53蛋白与基因的DNA相应部位结合，起特殊转录因子作用，活化P21基因转录，p21蛋白与cyclinE/CDK2结合抑制该激酶的活性和其对pRb的磷酸化，使细胞停滞于G1/S期；与cyclinA/CDK2结合使细胞停滞于G2/M期。当DNA遭到损时P53基因与复制因子A相互作用参与DNA的损伤修复；如果修复失败，p53蛋白即启动程序性死亡过程诱导细胞自杀，阻止有癌变倾向突变细胞的生成，从而防止细胞恶变。2)促进DNA损伤修复：当DNA因各种物理、化学因素引起DNA损伤时，P53蛋白与受损DNA部位结合，起特殊转录因子的作用，活化GADD45基因转录修复DNA。GADD45蛋白与CDK3和增殖细胞核抗原(PCNA)结合形成复合体（CDK3/GADD45/PCNA），促进DNA修复。GADD45也可以P21/CDKS/GADD45/PCNA四聚体形式，促使DNA修复。3)P53蛋白还可诱导细胞凋亡：当DNA损伤不能修复时，P53可诱导Bax基因表达，形成Bax/Bax复合体，因Bax基因具有诱导细胞凋亡的作用而导致细胞凋亡。另外，当DNA损伤时，细胞表达p53mRNA而导致GADD45基因表达水平升高，使细胞的生长停止或凋亡。p53的失活机理：P53蛋白与其它蛋白的相互作用,p53基因突变,都可导致p53的正常功能丧失。1）P53蛋白与其它蛋白的相互作用：DNA肿瘤病毒如HBV（HBX蛋白）、HPV16、18（E6蛋白），SV40和腺病毒编码蛋白，这些癌蛋白能与P53蛋白结合，引起宿主细胞的恶性病变。P53还可与细胞癌基因产物相互作用而失活。如MDM2癌蛋白与P53相互作用后，促进P53降解，故MDM2过度表达可致癌。2）p53的突变主要是杂合缺失和错义突变，错义突变常常发生在特定编码区，如：175,245,248,249,273和282，也就是常说的突变热点区，正对应与p53基因高度保守区段。这些位点对p53蛋白的肿瘤抑制功能非常重要。因此，这些位点发生突变，导致p53的DNA结合区域单链残基改变，而失去转录下游因子发挥肿瘤抑制功能，从而导致肿瘤的发生。P53基因突变与肿瘤：人类50%肿瘤与P53基因突变有关：肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、食道癌、肺癌、造血器官肿瘤等以点突变（错义）为常见。不同肿瘤突变的位点不同。肝癌p53基因突变以249位点突变最为常见。肺癌p53基因以157位颠换突变最为常见。基因诊断：利用分子生物学和分子遗传学的技术方法，从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病作出诊断的方法。基因诊断的特点：针对性强：以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断”。特异性高：以分子杂交技术为基本原理灵敏度高：基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人类长达3×109kb的基因组中检测出某一基因的单碱基改变。而且待测标本微量。适应性强：基因探针可为任何来源，任何种类，探针序列可为已知亦可未知，检测目标可为内源基因亦可外源基因，诊断范围广。早期诊断：基因诊断不仅可对有表型出现的疾病作出明确诊断，它还可在产前早期诊断遗传性疾病；可检出感染疾病潜伏期的病原微生物、还可预测和早期发现某些恶性肿瘤。基因诊断的基本技术：核酸分子杂交；聚合酶链反应（PCR）技术；单链构象多态性（SSCP，PCR-SSCP）；限制性片段长度多态性分析(RFLP)；DNA序列测定；DNA芯片技术。基因治疗：狭义概念：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。广义概念：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。基因治疗的基本程序：治疗基因的选择→→基因载体的选择（病毒载体，非病毒载体）→→靶细胞的选择（体细胞，生殖细胞）→→将目的基因导入靶细胞（基因转移）→→转导细胞的选择鉴定→→外源基因表达的检测治疗基因的选择：在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库、cDNA文库获得，或基因的克隆化，PCR扩增，人工合成等方法。基因载体的选择：基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体：逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等。非病毒载体：脂质体、裸DNA等。靶细胞的选择：基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。基因治疗中体细胞的选择：发病的组织和器官的细胞；可以选择患病器官周围器官的细胞；容易取出或移植；容易在体外培养；容易转导；具有较长的寿命。使用干细胞成为一个选择的首要考虑。基因转移：非生物学方法(非病毒介导的基因转移)非病毒介导的基因转移方法包括物理的和化学的方法等。物理方法有显微注射、电穿孔和基因枪技术等。化学方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体介导的基因转移等。生物学方法(病毒介导的基因转移)：是以病毒为载体，将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞。包括逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体。逆转录病毒（retrovirus）：目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DNA形成前病毒，插入宿主染色体，前病毒转录产生的正链即是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒并出芽释放，成为感染性病毒。逆转录病毒载体优点：①高效感染宿主细胞，转染率可达100%。②病毒基因和所载的外源基因都可能表达。③宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留。缺点：①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能有不适当的表达；③逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包装信号。转导细胞的选择鉴定：标记基因技术：在载体上引入一个标记基因，或同时导入标记基因，在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛选标记基因表型，那些已导入外源基因的细胞将存活下来，而未转导的细胞则死于选择性细胞培养基。如在较多的载体中都有neor标记基因存在，若向培养基中加入G418进行选择，最后只有转导细胞存活下来。基因缺陷型受体细胞技术：以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选择性培养基进行筛选。例如将TK基因导入TK-的靶细胞，转导细胞可在HAT培养基中生长，未转导的细胞则不能在HAT培养基中生长。基因共转染技术：将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后得到复合转导的转导细胞。分子杂交技术：常用的方法有原位杂效，Southern杂交。若靶细胞内原来不存在所导入的目的基因，可选用目的基因作为探针；靶细胞内一般无标记基因存在，故标记基因是良好的探针。探针大小可以是较大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA单链探针分子。外源基因的表达鉴定：在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有：原位杂交&Northrn杂交检测外源基因转录出的mRNA；免疫组织化学染色：检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪：可定量分析外源基因的表达状况。基因敲除：通过同源基因重组的过程定向的在活细胞中从基因组上移出特定基因的过程.从而建立基因细胞和基因生物。基因敲除的基本过程：构建打靶载体→→将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)→→用阳性和阴性筛选标志对转染的ES细胞进行筛选→→将同源重组的ES细胞导入小鼠胚泡中,再将胚泡植入假孕小鼠子宫中,培育出嵌合体小鼠→→筛选嵌合体小鼠→→杂交育种,获得基因敲除的纯合子小鼠。基因治疗的临床应用：1.导入抑癌基因:在多种肿瘤中抑癌基因的缺失或突变是肿瘤发生发展的关键，向这些肿瘤中导入抑癌基因可以抑制肿瘤的生长或诱导其死亡，如将野生型P53导入肿瘤细胞可起到抑制肿瘤生长的作用。基因沉默技术:封闭癌基因的过度表达①反义RNA技术:用一段与靶核酸序列互补的序列,互补结合后形成二聚体,从而阻止靶核酸的表达。②RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，通过一系列细胞内反应引发细胞中mRNA发生降解而导致基因表达沉默。这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。机制：外源dsRNA

进入细胞后可激活Dicer(RNAaseⅢ家族中的一员，主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子）,可以切割双链RNA，产生小分子双链RNA（siRNAs），siRNAs再与Dicer形成沉默复合物(RISC：是RNA-蛋白质复合物），RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干涉的过程。RNA干扰：RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致该基因表达沉默的现象.发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象。RNAi作用机制：1):在细胞内,双链RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)Dicer在ATP的参与下被处理为21个～23个碱基的小RNA，即小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA是由19个～21个碱基配对形成的双链,并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸。siRNA是RNAi作用发生的重要中间分子。双链的两端各有2个～3个突出的非配对的3′碱基,两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基,这些是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础:siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在siRNA中反义链互补结合的两端切割mRNA。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。分子生物学常用技术电泳:是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极移动的现象。电泳技术:利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳的影响因素：自身因素：迁移率与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关。迁移率与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。外界因素：1.电场强度。强度越大，迁移速率越快pH：溶液pH觉得带电颗粒解离程度和其所带净电荷的性质和多少溶液离子强度。电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低电渗现象。液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象温度。上升一度，迁移率上升2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置。通电产生焦耳热。支持物的影响。对支持物的要求一般是均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离，实验结果及扫描图谱无法重复。不连续PAGE电泳有三种物理效应：电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定速度泳动分子筛效应：区别不同大小分子种类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小的能力即分子筛效应。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同浓缩效应浓缩效应：不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。原理：（1）缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩（2）凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。杂交：指两个以上的分子因具有相近的化学性质(或结构互补)而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid）分子杂交的原理：是在DNA变性和复性的基础上建立起来的一种分子生物学技术.其原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链(碱基对之间非共价健形成稳定的双链).核酸探针：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记而便于检测的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。包括基因组DNA，cDNA探针，寡核苷酸探针和RNA探针等。DNA探针的优点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择。人工合成的寡核酸探针有下述优点：①短的探针比长探针杂交速度快。②可以在短时间内大量制备。③在合成中进行标记制成探针。④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。Southern杂交(Southernbloting)的主要步骤：1.待测DNA样品的制备、酶切2.待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜：(硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜;毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法)5.探针的制备6.Southern杂交7.杂交结果的检测Southern杂交的用途：用DNA探针。1)基因定性定量2)DNA物理图谱3)基因变异重排4)基因限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RFLP）5)疾病诊断Northern杂交：DNA+RNA杂交。步骤与Southern相似。采用DNA探针和RNA探针。用途：1):基因表达(mRNA)定性定量2):transcripts(mRNA)splicingPCR基本原理：类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：1):模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右后，双链DNA变性解离为单链DNA；2):模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3):引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应五要素：（引物，酶及其浓度，dNTP质量和浓度，模板核酸，Mg2+浓度）1.引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补。设计引物的原则：1)引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。2)PCR产物：200-500bp，特定条件下可扩增长至10kb的片段。3)引物碱基：G+C含量以40-60%，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免4个单一碱基的重复出现。4)避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体。5)引物3’端的碱基应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6)引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性.7)引物5’端加上合适的酶切位点，这对被扩增的靶序列的酶切分析或分子克隆很有好处。在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们8)使用兼并引物时,要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)9)最好学会使用一种designsoftware.2.酶及其浓度：两种TaqDNA聚合酶1)一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶2)基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量:2.5U(总反应体积为100ul)浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3.dNTP质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度偏高或偏低，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4.模板核酸：DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板5.Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使得产物减少。PCR反应条件：1:变性温度与时间：94℃30-60sec。变性温度低，解链不完全。温度过高，高温环境对酶的活性有影响。不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。2:退火(复性)温度与时间：40℃～60℃30～60sec。退火温度是影响PCR特异性的较重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。3:延伸温度与时间：常用温度为72℃。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。4:循环次数:25～40次循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。模板DNA少,酶质量活性差,适当增加循环次数.一般的循环次数选在25～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCR扩增产物的分析：PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定。1.凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致。2.酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，还能进行变异性研究。3.分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。4.核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。Sanger双脱氧链终止法原理：通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因为它与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱,将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。采用类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3'端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列；DNA芯片：是指通过微加工技术将大量的DNA以预先设计的排列方式有序地固定在载体表面，形成储存有大量信息的DNA阵列。该阵列与标记的核酸杂交后，能在短时间快速，准确地获取大量信息。DNA芯片分为两类：1)