《中级食品检验工 》课件-实训任务8 焙烤食品中沙门氏菌的检验

实训任务7焙烤食品中沙门氏菌的检验高级食品检验工目录一

仪器和用具二

培养基与试剂三

操作方法沙门氏菌属是肠道杆菌科中最重要的病原菌属，是引起人类和动物发病及食物中毒的主要病原菌。沙门氏菌在水中能存活2~3周，在粪便中可存活1~2个月，在冰冻土壤中可过冬，对热抵抗力不强，60℃处理15min即可将其杀死。胆盐、煌绿及其他染料对本属细菌的抑制作用较其他肠道杆菌小，用这些染料制备肠道选择性培养基有利用分离沙门氏菌。沙门氏菌属的形态特征是：革兰氏阴性杆菌，无芽孢，无英膜，大多数有动力，周生鞭毛。其生化反应特征是：①吲哚、尿素分解及V·P实验均呈阴性，发酵葡萄糖产酸、产气，产生HS；②不分解蔗糖和水杨素，不利用丙二酸钠，不液化明胶，且在含有氰化钾的培养基内不能生长，使赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸脱羧基；③在普通培养基上形成中等大小、无色透明、表面光滑的菌落，菌落边缘整齐或呈锯齿形；④不分解乳糖,在肠道鉴别培养基上形成无色菌落。焙烤食品中的沙门氏菌的含量较少，加工过程常常使其受损伤而处于濒死状态。为了分离焙烤食品中的沙门氏菌，必须对样品进行增菌处理，用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门氏菌恢复活力，再进行选择性增菌，即增殖沙门氏菌，而抑制大多数其他细菌。检验沙门氏菌当前通用的方法分为5个基本步骤：前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、生化鉴定实验和血清学分型鉴定。紫外光灯：波长366mm，功率大于或等于6W。放大镜：3~4倍放大能力。毛细滴管。一、仪器和用具二、培养基与试剂(1)缓冲蛋白胨水。

成分如下:蛋白胨10.0g

氯化钠5.0g

磷酸二氢钾1.5g磷酸氢二钠9.0g

蒸馏水(pH=7.2)1000mL制法：将各成分配好后，装入大烧杯中，于121℃高压灭菌15min，备用。临用时，在无菌条件下每瓶分装225mL，供沙门氏菌前增菌使用。二、培养基与试剂(2)氯化镁孔雀绿(MM)增菌液。

成分如下:甲液：胰蛋白胨5.0g

氯化钠8.0g磷酸二氢钾1.6g

蒸馏水1000mL乙液：氯化镁(化学纯)40.0g

蒸馏水100mL丙液：40gL孔雀绿水溶液制法：将各成分配好后，于121℃高压灭菌15min，备用。临用时，取甲液90mL、乙液9mL、丙液0.9mL，在无菌条件下混合即可。二、培养基与试剂(3)四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液。

成分如下:多胨或脲胨5.0g

胆盐1.0g

硫代硫酸钠300g碳酸钙10.0g

蒸馏水1000mL制法：将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，每瓶分装100mL，再加2mL碘液(6g碘+5g碘化钾+20mL蒸馏水)和1mL1g/L的煌绿溶液。二、培养基与试剂(4)亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液。

成分如下:蛋白胨5.0g

乳糖4.0g

亚硒酸氢钠4.0g磷酸二氢钾4.5g

磷酸氢二钠5.5g

L-胱氨酸0.01g

蒸馏水1000mL

制法：将除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸以外的所有成分溶解于900mL蒸馏水中，加热煮沸后冷却。另将亚硒酸氢钠溶解于100mL蒸馏水中，加热煮沸后冷却。在无菌条件下将两种溶液混合，再加入1mL10g/L的L-胱氨酸的氢氧化纳溶液(0.1gL-胱氨酸+1.5mL1mol/L的氢氧化的溶液+8.5mL蒸馏水)，混匀，然后每瓶分装100mL，此时溶液pH值应为7.0±0.1。二、培养基与试剂(5)SS琼脂培养基[含1%(质量分数)蔗糖]。

成分加下牛肉浸膏5.0g

蛋白胨50g

乳糖10.0g蔗糖10.0g

胆盐8.5g

柠檬酸钠8.5g硫代硫酸钠1.0g

柠檬酸亚铁1.0g

煌绿1.0g中性红0.025g琼脂13.5g

蒸馏水1000mL制法：将各成分溶于水，煮沸4~5min，最终溶液pH=7.0±0.2，冷却至55-66℃倾于平板上。二、培养基与试剂(6)HE琼脂培养基。

成分如下:蛋白胨12.0g

酵母浸出物3.0g

乳糖12.0g蔗糖12.0g

水杨素2.0g

混合胆盐9.0g氯化钠5.0g

硫代硫酸钠5.0g

柠檬酸铁铵1.5g溴麝香草酚蓝0.065g

酸性复红0.1g

琼脂14.0g

蒸馏水1000mL制法：将各成分溶于水，煮沸45min，最终溶液pH=7.5±0.2，冷却至55~60℃，倾注于平板上。二、培养基与试剂(7)MUCAP试剂(用4-甲基伞形酮辛酯配成的试剂的缩写)。按生产者提供的使用说明制备工作稀释液，储存于4℃冰箱中，备用。(8)氧化酶试液与试纸。

①氧化酶试液：甲液为1%(质量分数)的α-萘酚乙醇溶液；乙液为1%(质量分数)的二甲基对苯二胺草酸盐水溶液。

②氧化酶试纸：先将甲液与乙液等量混合，然后取定性滤纸，浸透混合液后，于70-80℃的烘箱内烘干，剪成适当大小的纸条，密封于塑料袋或瓶中，储存于4℃的冰箱中，备用。二、培养基与试剂(9)三糖铁琼脂培养基。

成分如下:牛肉浸膏5.0g

蛋白胨200g

乳糖10.0g蔗糖10.0g

葡萄糖1.0g

氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g

硫酸亚铁铵0.2g

琼脂12.0g

酚红0.025g

蒸馏水(pH=7.4)1000mL制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节pH值，加入琼脂，加热熔化后，再加入12.5mL2g/L的酚红水溶液，混匀，然后分装于小试管中，于121℃高压灭菌15min，摆置高层斜面备用。（1）前增菌与选择性增菌将样品用均质器以8000-10000r/min的转速打1min，或用乳钵和灭菌砂磨碎。称取25g打碎样品，置于装有225mL缓冲蛋白胨水的300mL锥形瓶内，于36±1℃培养4h。从中吸取10m样品，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液中，于42℃培养18-24h。同时另取10mL样品，转种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，于36±1℃培养18-24h。三、操作方法（2)分离培养将增菌培养液据匀，挑取一接种环，划线接种于ss和HE琼脂培养基各一个中,于36±1℃培养22~26h。观察各琼脂平板上有无可疑沙门氏菌菌落，若无可疑菌落，则应再继续培养22~26h。沙门氏菌的菌落特征见下表1。三、操作方法ss平板HE平板圆形,边缘整齐;淡黄色,半透明,有成无黑色中心;周国培养基为遗明演黄色圆形,边缘整齐;蓝绿色至蓝色,有或无黑色中心;周围培养基为透明墨绿色表1

沙门氏菌的菌落特征三、操作方法（3)测定

从培养的分离培养基上选可疑沙门氏菌菌落(尽量选较大、分离较好的单个菌落)，用玻璃笔做好标记并编号。

用毛细滴管吸取MUCAP试剂，加一滴于已编号的菌落上。待一个平板的被检菌落全部滴加试剂后，将平板拿到紫外光灯下于366nm处检视，发蓝色荧光的为MUCAP实验阳性，将阳性菌落号记录下来。

用接种环挑取荧光反应为阳性的菌落，涂于氧化酶试纸上，观察涂菌点是否变蓝。在10min内变蓝的为氧化酶实验阳性，不变色的为阴性。三、操作方法(4)结果的报告

对于MUCAP实验阴性的样品，报告为“未检出沙门氏菌”；对于MUCAP实验阳性、氧化酶实验阴性的样品，继续进行生化和血清学鉴定。(5)生化学鉴定

挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，穿刺接种在三糖铁琼脂斜面和底层，同时再接种蛋白胨水(供靛基质实验用)、尿素琼脂培养基(pH=7.2)、氰化钾培养基、赖氨酸脱羧酶实验培养基和对照培养基各1管，于36±1℃培养18~24h，必要时可延长至48h。之后按表2判断生化反应结果。反应序号硫化氢靛基质尿素氰化钾赖氨酸脱羧酶判定菌属A1++沙门氏菌属A2+++沙门氏菌属(少见)，爱德华氏菌属A3+++柠檬