动物繁殖学：胚胎移植技术

第十单元配子与胚胎生物工程技术第一讲胚胎移植技术（一）第二讲胚胎移植技术（二）第三讲胚胎体外生产、性控与保存技术第四讲干细胞、克隆与转基因技术一、胚胎移植应具备的条件胚胎来源实验室条件技术条件（一）胚胎来源

目前胚胎的来源主要是通过超数排卵处理后，由供体输卵管或子宫内采集和胚胎体外生产（包括体外受精、显微受精和核移植）两种方法获得。（二）实验室条件在胚胎体外操作过程中，除了要求专业技术人员的基本素质以外，建立温度恒定、空气洁净、设备齐全和布局合理的实验室条件是提高胚胎移植效率的关键因素。在家畜胚胎移植实践中，从供体的确定、受体的选择、饲养管理、受体同期发情、供体超数排卵处理、胚胎采集到胚胎质量鉴定、胚胎冷冻、解冻和移植等都需要丰富的实践操作经验。（三）技术条件

二、牛胚胎移植操作步骤供、受体的选择供体的超数排卵与人工授精受体的同期发情胚胎的收集胚胎的检查和评定胚胎的移植二、胚胎移植操作步骤（一）供、受体的选择供体应是良种，而且为性状表现优秀、具有较高育种价值与遗传优势的个体；供体应健康无病，膘情中等偏上，年龄以青壮年为佳；供体生殖机能应处在较高水平。既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，超排处理前应有两个或两个以上的正常情期。1.供体母畜的选择一般选用价格低廉、生产性能比较低的同种母畜，达到配种年龄和体型；要具有良好的健康状态，体型与膘情中上等，初产或经产青壮年母畜。检疫和疫苗接种与供体相同；应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，移植胚胎前应有两个或两个以上的正常情期，也不能与公畜同群。

2.受体母畜的选择1.超排定义在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，简称“超排”。（二）供体的超数排卵与人工授精牛有FSH+PG法和CIDA+FSH+PG法两种；发情后8－13天开始；常用的激素为FSH；注射方法一般是连续4d递减注射,每天2次,间隔12小时（半衰期短）；发情后8－12小时配种，间隔12小时再配种一次。

2.超数排卵方法在发情周期第10、11、12、13天每头牛分别肌注FSH160、140、110、90单位（共500IU)，每天分两次注射，在第12天注射FSH的同时肌注PG，上午2支/头，下午1支/头。发情后供体AI配种2-3次。供体牛的超排方案图片来自网络（三）受体的同期发情1.定义利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程，使之在预定的时间内集中发情，以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法，也称同步发情。2.同期发情原理发情周期可分为卵泡期和黄体期两个阶段。卵泡期是在周期性黄体退化继而血孕酮水平显著下降后，卵泡迅速生长发育，最后成熟并导致排卵时期（第18天-21天）。卵泡期后，卵泡破裂发育成黄体，进入黄体期（第1天-17天）。黄体期内，在孕激素作用下，卵泡发育成熟受到抑制，母畜不表现发情，在未受精的情况下，黄体维持约15-17天，即行退化，随后进入另一个卵泡期。黄体期的结束是卵泡期到来的前提条件，高水平孕激素抑制发情，一旦其水平降到低限，卵泡即开始迅速生长发育，表现发情。因此，同期发情的中心问题是控制黄体期的寿命，并同时终止黄体期。缩短黄体期的前列腺素法(PG法)PGF2α或其类似物有溶解黄体的作用，黄体溶解后，卵巢上就会有卵泡发育而发情，所以只能对于卵巢上存在黄体的受体有效。在发情周期的第9天后注射PGF2α，2-5天内发情。延长黄体期的孕酮法3.同期发情方法目前同期发情的方法主要是使用前列腺烯醇（PG）间隔10-12天两次肌肉注射的方法，效果较好。因为前列腺素处理法只有当母牛在周期第5-18天(有功能黄体时期)才能产生发情反应。对于周期第5天以前的黄体，前列腺素并无溶解作用。因此，用前列腺素处理后，总有少数牛无反应，为使一群母牛有最大程度的同期发情率，第一次处理后，经10-12天后，再对全群牛进行第二次处理，这时所有的母牛均处于周期第5-18天之内。

（1）前列腺素处理法s母牛发情周期

第7-17天，对前列腺素（PG）有反应图片来自网络图片来自网络孕酮能够抑制腺垂体释放FSH，每日肌注或口服孕酮，或经阴道海绵栓给予孕酮或其类似物，一般处理12-18天后，可以抑制卵泡发育。停止处理或撤除海绵栓后，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡发育，通常在2-3天内发情。为了提高排卵的效率，在孕激素处理结束的前一天，可以给予小剂量的FSH。此法费用低，但处理时间长。

（2）孕激素处理法图片来自网络1.冲胚液和保存液的制作冲胚液有很多种，目前最常用的为含5%犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），也可用于体外短期保存胚胎。保存时间长或体外培养多用M-199液。（四）胚胎的收集2.回收过程牛适宜于5-7日龄胚胎;现均采用二通管非手术采卵法：用直肠把握子宫颈法插入带有探针的二通管直至一侧子宫角的基部，通过打气孔注入8-10ml空气,抽出探针，通过中心管道反复注入--回收冲卵液,连续5-6次。同样方法冲另一侧子宫角。PBS集卵杯子宫颈

子宫角卵巢牛的非手术法回收胚胎a.冲卵液b.硬膜外麻醉c.插入子宫中的Foley管d.子宫颈子宫角回收的液体较多，可以通过专用胚胎漏斗除去多余的冲卵液，在连续变倍解剖显微镜（实体显微镜）下进行检胚；胚胎的质量评定：主要采用形态学方法，优质胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植。（五）胚胎的检查和评定A级;形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,透明带适中；B级;轮廓清晰,色调和细胞密度良好；C级;轮廓不清楚,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多；D级;轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液泡很多。1.胚胎的分级标准2.不同发育阶段的正常胚胎3.未受精卵或异常胚胎2-cell4-cell8-cell16-cellMorulaBlastocyst4.正常胚胎的形态重点应检查子宫和卵巢的异常情况以及子宫的紧张性，然后检查卵巢上黄体的发育情况（位置、大小），只有黄体发育良好者才能正式列为待移植母牛，并记录和在牛臀部标出黄体位于左右哪一侧。牛站立保定于六柱栏保定架内，用2%盐酸利多卡因或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉，用18号针头，每只牛约5ml。1.受体母牛的准备（六）胚胎的移植

1.1ml注射器2.装管接头3.细管A.棉塞B.气泡Ⅰ、Ⅲ、保护液Ⅱ.含胚段装管器械和装管方法2.胚胎的移植方法直肠把握法三、山羊胚胎移植概述1.超排方案超排方案1(FSH+PG法)：从供体发情周期的第9-13天开始注射FSH，以日递减剂量连续注射3天6次，每次间隔12小时,总剂量为150-300IU，在第5次注射FSH的同时肌注氯前列稀醇0.1毫克。（一）供体的超数排卵技术超排方案2(CIDR+FSH+PG法)：在发情周期的任何一天给供体阴道内放入CIDR，计为0天，然后于第9-13天任何一天开始肌注FSH，递减法连续注射3天共6次，在第5次肌注FSH时取出CIDR，并肌注氯前列稀醇0.1毫克，一般在取出CIDR后24-48小时发情。（二）胚胎的回收场所、器械和人员的准备供体羊的术前准备：术前1日停止喂食但不停水；术部剃毛；麻醉现多用速眠新处理；术部皮肤先用2%-4%的碘酒消毒，晾干后再用70%-75%的酒精棉涂擦脱碘。将创巾固定在术部周围并露出术部。1.术前准备2.手术过程皮肤用外科刀一次切开，4—6厘米。肌肉用钝性分离的方法沿肌纤维的走向分层切开，最后切开腹膜。注意及时止血。手术者将食指及中指由切口伸入腹腔触摸子宫角，用二指夹持，因势利导地牵引至创口表面，先循一侧的子宫角至该侧的输卵管，在输卵管的末端弯转处找到该侧的卵巢，观察卵巢表面的排卵点和卵泡发育情况并做记录。3.冲洗输卵管法适宜于2-3日龄的胚胎。将一根长5-7cm，外径3-4mm的硅胶管插入输卵管喇叭口内1-1.5cm，用血管夹或手固定。以左手母指和食指捏住子宫角前端，右手持吸有冲卵液的针管并将针头插入子宫角尖端，注入冲卵液约10-15ml。

输卵管回收胚胎示意图图片来自网络供体的冲胚4.冲洗子宫法适宜于5-7日龄胚胎。

子宫角回收胚胎示意图(1)

子宫角回收胚胎示意图(2)图片来自网络用作受体的母畜应具有明显的发情症状，发情时间应与供体母畜一致。羊采用手术法移植。受、供体同时做好术前准备，在进行胚胎检查的同时或之后，立即在受体母畜腹部做一切口，轻轻拉出子宫角，找到排卵侧的卵巢并观察黄体数量与发育情况。（三）胚胎的移植只有黄体发育良好的受体才能用于胚胎移植，黄体过小、发育异常或退化的受体都不能用于胚胎移植，否则很难受孕。卵巢上有1个黄体的受体一般只给移1枚胚胎，有2个或2个以上黄体者可以移2枚胚胎。根据胚胎的发育阶段以及回收与移植部位一致的原则，用移植管将胚