动物繁殖学：干细胞、克隆与转基因技术

第一讲胚胎移植技术（一）第二讲胚胎移植技术（二）第三讲胚胎体外生产、性控与保存技术第四讲干细胞、克隆与转基因技术第十单元配子与胚胎生物工程技术第四讲干细胞、克隆与转基因技术干细胞概念及分类胚胎干细胞的特性胚胎干细胞的应用胚胎干细胞技术存在的主要问题诱导多能干细胞动物胚胎干细胞技术一、干细胞（Stemcell）的概念及分类具有不断增殖和分化的能力，在一定条件下可形成不同的细胞、组织、器官和系统。

根据细胞来源分类：胚胎---胚胎干细胞ESC（EmbryonicStemCell）成体---成体组织来源的干细胞ASC（Adult-derivedStemCell）根据发育潜能分类：当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。是一种高度未分化细胞,具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。全能干细胞：

具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。多能干细胞：

具有分化出多种组织细胞的潜能，但不能发育成完整个体。专能干细胞：

只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。二、胚胎干细胞的特性内细胞团原始生殖细胞胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESC)是一种从早期胚胎

内细胞团或原始生殖细胞经分离、体外培养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。具有胚胎细胞的特征形态：体积小、核大、核仁突出；呈克隆状生长；功能：在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即发育成完整动物体的能力。具有细胞系的特征在饲养层上能维持未分化状态并实现自我更新。可无限增殖，也可冷冻保存。

ES细胞的形态特征三、胚胎干细胞的应用在基础生物学方面，利用ES细胞研究细胞分化和个体发育的机理。在医学方面，用于修复或替换功能丧失的组织或器官，是再生医学的重要种子细胞；也可用于新药的研制和开发。在动物生产方面，可用于生产克隆和转基因动物，加快良种家畜繁育。外胚层中胚层内胚层生殖细胞1、分离培养系统问题目前ES细胞的分离培养体系仍沿袭传统的方法，分离成功率很低，需要建立新的或者完善已有的ES细胞分离和培养系统。

2、分化与临床应用问题目前还无法对ES细胞实施专一性的诱导分化，无法在体外分化发育成一完整的器官，而且可用于诱导分化的化学物质种类有限。

3、伦理道德问题ES细胞的研究和应用一直牵涉到许多法律、宗教和伦理学问题。四、胚胎干细胞存在的问题那么是否可以用另外的方法，避开伦理学的限制，获得具有多能性的细胞呢？

2006年,日本Yamanaka(山中伸弥)研究小组通过将逆转录病毒介导的Oct-4,Sox2,Klf4及c-Myc四个基因转入鼠成纤维母细胞，将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞。Yamanaka也因此而获得了2009年度美国拉斯克医学奖。五、胚胎干细胞的新来源-诱导多能干细胞通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞细胞样的多潜能细胞。称之为诱导多能干细胞即iPS细胞（inducedpluripotentstemcells,iPSC）

iPS细胞与传统胚胎干细胞的区别iPS细胞虽然成功避开伦理之争，但是用于疾病的干细胞治疗还有相当长的路要走，还有一系列的科学和技术问题有待深入系统地研究，如成熟体细胞转化为类胚胎干细胞的效率还很低，重编程分子机制还不清楚，所用的转染病毒随机整合到细胞的基因组中具有诱发细胞恶性转变的风险等。iPS细胞所提供的新思路、新技术和新方法有重大理论意义和实用价值，并将成为今后获得患者自身遗传背景的胚胎干细胞重要途径之一。第四讲干细胞、克隆与转基因技术概述胚胎细胞克隆技术概况体细胞克隆技术定义体细胞克隆技术的关键环节影响核移植效果的主要因素核移植技术的应用前景核移植技术存在的问题动物克隆技术克隆（cloning）源于希腊文klon，原意是树木的枝条繁育。在生物学上是指由一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物学上是指不经过有性生殖的方式，直接获得与亲本具有相同遗传物质后代的过程。

哺乳动物的克隆可通过胚胎分割和细胞核移植技术实现，理论上通过孤雌生殖也能实现动物克隆，但迄今为止尚无成功的报道。一般情况下，哺乳动物的克隆仅指细胞核移植技术，它包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植技术。概述胚胎分割（embryosplitting）是运用显微手术的方法，将哺乳动物附植前的胚胎均等地分成若干份，并使之继续发育成完整个体的生物技术。在畜牧生产上，运用胚胎分割可获得同卵双生或同卵多生，有利于扩大优良家畜的规模；在实验生物学或医学中，运用同卵孪生后代作实验材料，可消除遗传差异，提高实验结果的准确性。1235687哺乳动物胚胎分割示意图哺乳动物的胚胎分割技术在近二十年取得了较大进展，主要表现为操作方法越来越简单。在胚胎分割中，技术人员可不借助显微操作仪，徒手分割。从目前的研究来看，由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限，最好的结果是由一枚胚胎获得3头犊牛，这说明用胚胎分割的方法克隆动物的潜力很有限。因此，想要大量生产克隆动物必须利用细胞核移植方法。胚胎细胞克隆又称为胚胎细胞核移植，是通过显微操作将早期胚胎的单个细胞核移植到去核卵母细胞中构建新合子的生物技术。核移植中，通常把提供细胞核的细胞称核供体，接受细胞核的去核卵子称核受体（受体卵子），由核供体和核受体构建的胚胎称重构胚。由于哺乳动物的遗传性状主要由细胞核的遗传物质决定，所以用同一枚胚胎卵裂球获得的核移植后代，因其基因型几乎一致，故称为克隆动物。

一、胚胎细胞克隆技术概况胚胎克隆的理论基础：早期胚胎细胞具有发育全能性或多能性，即这些细胞核被移入到成熟的去核卵母细胞后，在胞质内特殊因子的作用下，使植入核的基因表达被重编程

（reprogramming），将“发育钟”拨回到受精时的状态，恢复全能性，犹如受精卵的基因组启动个体发育一样。511423876910121311

哺乳动物细胞核移植示意图1.供体2.MⅡ期卵子3.去核4.核供体胚胎5.体细胞传代培养6.分离的卵裂球7.G0/G1期体细胞

8.去核的卵子

9.胞质-核供体复合体10.平行电极细胞融合11.针式电极细胞融合12.重构胚13.囊胚获得克隆动物必须具备的条件：

供体细胞核受体卵母细胞胚胎移植的受体

（胚胎细胞或体细胞）体细胞克隆技术又称体细胞核移植技术，它是把高度分化的体细胞的细胞核移入去核卵母细胞中，使重构胚发育成为与供体遗传物质完全相同个体的技术。二、体细胞克隆技术定义它与胚胎克隆技术相比，有两大优点：第一，同一遗传性状供体核的数量可无限获得；第二，可通过对供体细胞的改造，加速家畜品种改良或生产转基因动物。三、体细胞克隆技术的关键环节体细胞克隆的主要技术程序与胚胎细胞克隆基本相同，主要差别在供体细胞的选择。供体细胞可通过血清饥饿或接触抑制获得（供体细胞要处于G0/G1期）。自然状态的G0期细胞（如卵丘细胞）和G1期细胞（胎儿成纤维细胞），可直接移入去核卵母细胞中生产克隆胚胎。受体卵母细胞供体核细胞成熟卵母细胞去核细胞周期同期化细胞融合重构胚激活重构胚培养操作人员技术四、影响核移植效果的主要因素五、核移植技术应用前景1．迅速扩繁优良畜种，加快育种进展2．生产转基因动物核移植技术可以与转基因技术结合起来，生产转基因克隆动物。3．加深核质互作关系的研究通过核移植技术，可以深入研究动物个体发生的核质互作关系。4．肿瘤和癌细胞基因活动研究利用核移植技术先将肿瘤或癌细胞的核移入卵母细胞，再研究重构胚的发育情况和基因调控规律，以便为肿瘤和癌症的治疗提供依据。

1．效率低

目前，胚胎克隆动物成功率在5%~10%，体细胞克隆动物在1%~6%。这是由于核移植的技术环节太多，每个环节都对核移植的效果产生直接的影响。目前基因组重编程的确切机制尚未阐明，配制的体外培养液和操作液不能完全满足受体卵子、供体细胞及重构胚的要求。六、核移植技术存在的问题2．流产率、后代死亡率高

在克隆效率相对较高的克隆牛中流产率高达20%~50%。剖检结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平。另外，有些克隆牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等未能正常发育，还有些牛犊右心室异常，这是导致克隆动物流产和出生后死亡的一个重要原因。3．出生重过大造成难产

克隆动物在妊娠期间体重及出生重远远超过非克隆个体，这可能是由于克隆个体在胎儿阶段发育失衡造成。对克隆牛出生10min内测定的结果，血浆中甲状腺素和3-碘化甲状腺氨酸水平都明显低于对照组，而胰岛素水平却明显高于对照组，这也许是克隆牛犊出生重普遍偏高的原因之一。另外，由于培养基中血清的存在，导致早期胚胎基因表达发生改变，致使许多克隆动物出生重增加。第四讲干细胞、克隆与转基因技术概述转基因动物的研究意义转基因动物制备的主要环节转基因动物研究面临的主要问题动物转基因技术转基因动物，是指通过人为方法导入外源基因，在染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。整合到动物基因组上的外源结构基因称为转基因。在制备转基因动物时，外源基因可能只整合入动物部分组织细胞的基因组，也可能整合进动物所有细胞的基因组中，因而其遗传的稳定性就会有所不同。概述超级鼠的诞生—动物转基因发展的里程碑动物转基因技术已成为当今生命科学中一个发展最快、最热门的领域，相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼和猫等动物获得转基因成功。转基因动物正在改变着农业生产、生物医药甚至是整个生命科学的研究与发展面貌。

提高生长速率异种器官移植

减少排污

生物反应器

改善肉质成份提高抗病能力医学疾病模型

提高瘦肉率

生物材料生产改善奶品质一、转基因动物的研究意义

1.改良动物生产性能

利用转基因技术，将所需的优良基因直接转入待改良群体中，增加新的遗传品质，形成优良的转基因畜禽，从而改良畜禽生产性能，如生长速度、繁殖率、瘦肉率、产毛量等，最终培育成满足人们需要的、具有优良品质的畜禽及鱼类新品系。农业领域

2.抗病育种

对一些种属特异性疾病，可以从抗该病的动物中克隆出目的基因，导入易感动物品种的基因组。若该目的基因能够在宿主基因中表达，那么转基因动物对该病毒具有一定的抵抗力，由此可培育出抗该病品系。1.用作生物反应器生产昂贵药物和保健产品

把药用蛋白或营养蛋白质与组织特异性表达调控元件藕联，运用家畜的造血系统或泌乳蛋白生产药用或营养蛋白质，提高畜牧业的经济效益。2.利用转基因猪生产人类所需要的器官

转基因动物技术的发展可以将携带有人免疫系统基因的转基因猪，为人的器官移植提供了有效的器官来源途径。3.建立人类疾病的动物模型

通过精确地激活或增强某些基因的表达，制作各种人类遗传疾病的动物模型，其研究结果具有较高的真实性，可用于诊断、治和新药筛选。同时利用转基因动物可建立敏感动物品系及与人类相同疾病的动物模型，可用于药物筛选。医药领域上游：基因改造与载体构建二、转基因动物制备的主要环节中游：基因导入、胚胎移植与建系下游：基因整合、表达检测与转基因产品纯化与利用显微注射病毒转染法精子介导法胚胎干细胞方法体细胞核移植法基因同源重组法外源基因的导入1.显微注射制备转基因利用精细的显微注射针将外源基因直接注入单细胞受精卵的原核中，使外源基因整合到动物的基因组中。优点整合效率高;效果稳定;通常外源基因是